用于改善阿卡波糖形成的方法与流程

用于改善阿卡波糖形成的方法
发明领域
1.本发明涉及用于改善阿卡波糖形成的放线菌目(actinomycetales)菌株。本发明提供了经工程化以过表达dtdp-d-葡萄糖-4,6-脱水酶(acbb)和/或尿苷酰转移酶(gtab)的放线菌目菌株。还提供经工程化以具有降低的或不存在的小碳水化合物结合蛋白(cgt)的表达和/或降低的或不存在的类胡萝卜素合成所必需的基因的表达的放线菌目菌株。还提供产生这些菌株的工具、方法和手段。


背景技术：

2.阿卡波糖
3.治疗剂阿卡维基-麦芽糖(acarviosyl-maltose)(阿卡波糖)自从1990年以来用于糖尿病的医学治疗(wehmeier和piepersberg 2004；wehmeier 2004)。其将支持患者的严格饮食计划，并防止当消耗高碳水化合物膳食时的糖峰值。在口服之后，阿卡波糖抑制肠道α-葡糖苷酶，这导致单糖从含淀粉和蔗糖的饮食中延迟释放。由此，阿卡波糖有助于控制单糖吸收到血液系统中的速率，并导致餐后血液和血清糖水平降低，这被认为在心血管疾病死亡率的背景下是至关重要的。
4.工业实用性
5.阿卡波糖是已知的，并且在欧洲和中国以glucobay(bayer ag)销售，在北美以precose(bayer pharmaceuticals)销售，和在加拿大以prandase(bayer ag)销售。作为一种用于治疗糖尿病的重要且高度需要的药物，需要以高产率和高质量提供阿卡波糖。随着ii型糖尿病的发病率在世界范围持续增加，产品产率和质量的优化是当前关注的问题。
6.阿卡波糖生产菌株
7.阿卡波糖由不同的放线菌天然产生，如天蓝黄链霉菌(streptomyces coelicoflavus)zg0656(geng et al.2009)、淡青链霉菌(streptomyces glaucescens)gla.o(rockser和wehmeier 2009；ortseifen et al.2015)和游动放线菌se50/110(由wehmeier和piepersberg 2004综述)，其中后者是野生型的工业生产菌株(ortseifen 2016；mahmud et al.1999)。游动放线菌属首先由couch(1950)作为放线菌门，放线菌目，小单孢菌科的成员引入。游动放线菌se50/110(atcc 31044，cbs 674.73)是一种se 50的缓慢生长的天然衍生物(atcc 31042，cbs 961.70)(frommer et al.，1973)。se50是在1970年在bayer ag的筛选项目期间从肯尼亚咖啡种植园附近的土壤样品中分离的(frommer et al.，1972)。当在培养基中提供麦芽糖时，se50/110产生约1g
·
l-1
阿卡波糖(wendler et al.，2014)。已经对其他生产菌株进行了工程化，如例如(ep2601209b1)和(cn103298828b)中所述。
8.对于游动放线菌se50/110，显示了阿卡维基-糖的生物合成依赖于培养基中碳源的供应(wendler et al.2014)。在葡萄糖上生长时，形成了作为主要化合物的阿卡维基-葡萄糖，而当在麦芽糖上生长时，主要形成阿卡维基-麦芽糖(wendler et al.2014)，并且当在麦芽三糖上生长时，主要形成阿卡维基-麦芽三糖(ortseifen 2016)。
9.由于其与野生型的工业阿卡波糖生产菌株的医学和工业相关性，在过去几年中广泛研究了游动放线菌se50/110：全面分析了完整基因组(schwientek et al.2012)、转录组(schwientek et al.2013)和蛋白质组(wendler et al.2015b；wendler et al.2015a；wendler et al.2013)。在2017年，这得到了优化的基因组序列和改进的注释(genbank：lt827010.1)(wolf等人2017b)。此外，建立了属间接合系统(gren et al.2016)以及通过使用crispr/cas9的高级基因组编辑工具(wolf et al.2016)，从而允许靶向基因工程化。然而，对于游动放线菌se50/110，缺少能够实现中等至强基因表达的可靠表达系统。由于以前不存在用于单一基因的中等强度过表达的合适系统，因此根据本发明测试和评价了不同的策略，这导致开发了称为psett4的新表达系统。
10.阿卡波糖的生物合成
11.阿卡波糖的生物合成途径是基于催化单一步骤的单功能酶(图1)(wehmeier和piepersberg 2009)。根据zhang等(2002)的模型，生物合成通过中间体valienone-7p进行。在wehmeier(2003)的精优化，改变了还原和脱水步骤，导致作为中间体的valiolol-7p。由于步骤的顺序未知，因此在括号中示出它们。阿卡波糖生物合成的第一步，即由acbc从景天-庚酮糖-7p(sedo-heptulose-7p)形成2-epi-5-epi-valiolone的环化反应，在该图示中缺失。尽管在过去几十年中，阿卡波糖生物合成途径成为研究的焦点，但该生物合成途径仍然尚未完全阐明。仅生物合成的前三个步骤被实验证实。acbc(acsp50-3607)，阿卡波糖生物合成的第一个酶，催化从景天-庚酮糖7p7p生成2-epi-5-epi-valiolone的环化反应(stratmann et al.，1999)。磷酸化为2-epi-5-epi-valiolone-7p由激酶acbm(acsp50-3603)在atp存在下催化(zhang et al.，2002)，并且通过辅因子非依赖性差向异构酶acbo(acsp50-3606)差向异构化为5-epi-valiolone-7p(zhang et al.，2002；zhang et al.，2003)。
12.该模型的其余步骤基于蛋白质同源性和功能预测(zhang et al.(2002)，wehmeier(2003)，wehmeier和piepersberg(2004)，wehmeier和piepersberg(2009)和wendler et al.(2013))：nadh依赖性(多元醇)脱氢酶/还原酶acbl(acsp50_3604)和环多醇脱氢酶/氧化还原酶acbn(acsp50_3605)已经被建议催化还原和5,6脱水为1-epi-valienol-7p。据认为磷酸化为1,7-二磷酸-1-epi-valienol是由1-epi-valienol-7-磷酸-1-激酶acbu(acsp50_3595)和/或水解酶acbj(acsp50_3600)催化。对ndp-1-epi-valienol-7p的核苷酸化可能由glgc-相关的ndp-多元醇合酶acbr(acsp50_3597)(1-epi-valienol-1,7-二磷酸-腺苷酰转移酶)催化，并且活化的中间体向活化的氨基糖的转移似乎是由糖基转移酶acbi(acsp50_3599)和/或acbs(acsp50_3596)介导以生成acarviosine-7p。活化的氨基糖被认为由d-葡萄糖-1-磷酸在三个步骤中合成(wehmeier和piepersberg 2004；wehmeier和piepersberg2009；zhang等人2002)，这些步骤是：(i)通过dtdp-葡萄糖合酶acba(acsp50_3609)核苷酸化为dtdp-d-葡萄糖，(ii)通过dtdp-d-葡萄糖-4,6-脱水酶acbb(acsp50-3608)脱水为dtdp-4-酮基-6-脱氧-d-葡萄糖，和(iii)通过gabt-样氨基转移酶acbv(acsp50_3594)胺化为dtdp-4-氨基-4,6-二脱氧-d-葡萄糖(diaz-guardamino uribe 2000；zhang et al.2019)。
13.葡萄糖-1p是一种分支代谢物，其在不同途径中表现出重要作用，如糖原代谢、半乳糖代谢和在转化为葡萄糖-6p后的糖酵解(frey 1996；purves 2006)。udp-葡萄糖-1p尿
苷酰转移酶gtab催化葡萄糖-1p和udp-葡萄糖相互转化。
14.最后，麦芽糖可能通过acbs在一步反应中转移(hemker et al.，2001)。然而，还提出了acbi或acbj催化转移反应(wehmeier和piepersberg 2004；wendler et al.2013)。该反应的另一候选物可能是淀粉麦芽糖酶acbq(acsp50_3601)。
15.在游动放线菌se50/110中，生物合成基因被组织在阿卡波糖生物合成基因簇(acb基因簇)中，该基因簇在1999年由stratmann等首次鉴定，随后测序(genbank：y18523.4)(stratmann et al.1999；thomas2001)。该簇含有22个基因(图2)。
16.除了已经提到的生物合成基因(acbcmolnujrsivba)之外，该簇编码细胞外淀粉降解(acbez，acsp50_3610和acsp50_3590)、转糖基化(acbd，acsp50_3611)和阿卡波糖输出(acbwxy，acsp50_3591-3)中的功能。此外，编码阿卡波糖-7-激酶(acbk，acsp50_3602)和细胞内淀粉麦芽糖酶(acbq)，其被赋予carbophore内的功能(wendler et al.2015b；schwientek et al.2012；wehmeier和piepersberg 2009)。注释为ntp-焦磷酸水解酶的acbp(acsp50_3598)的功能是未知的。
17.具有可能的代谢相关性的游动放线菌蛋白
18.单cbm-20结构域蛋白cgt是游动放线菌se50/110和衍生的阿卡波糖生产菌株中最强表达的基因之一(ortseifen 2016；wendler et al.2015a；schwientek et al.2013)。根据signalp分析(almagro armenteros et al.，2019)，其通过sec途径分泌，并且占该生物体的总分泌蛋白质组的8％(数据未显示)。cgt含有149个氨基酸和折叠家族1功能组a的cbm-20结构域，其特征在于β-夹心结构(schwientek et al.，2013；guill
é
n et al.，2010)。该家族的成员被描述为结合淀粉(guill
é
net al.2010)。
19.游动放线菌中基因删除的方法
20.属间接合系统(gren et al.2016)和crispr/cas9技术(wolf et al.2016)的建立允许在游动放线菌se50/110中进行基因组编辑。
21.此外，根据本发明，发明人通过同源重组成功建立了新的缺失系统，其使用无整合酶的载体骨架和coda进行反选择，如zhao等人(2017)中所述。由此，可以进一步扩展游动放线菌se50/110的遗传工具箱。作为原理验证，成功地测试了新的缺失系统的示例性基因cgt的缺失。同源重组(hr)是放线菌中的共同过程，其可在技术上用于通过双交换产生缺失突变体。温度敏感性复制子，如psg5复制子，可以支持和推动该过程(du et al.2015；garg和parry 2010；myronovskyy et al.2009；zhang和parry 2007)。本领域存在其他方法，例如用于单核苷酸交换的crispr-碱基编辑系统、根据tong et al.2019的crispr-best、根据qi et al.2013的crispri/dcas9、rna干扰等。
22.游动放线菌中基因过表达的方法
23.在过去几十年中，游动放线菌se50/110已经得到了广泛的研究。合适的表达系统难以设计，参见schaffert et al.(2019)。将该公开出版物的全部内容，特别是用于游动放线菌的遗传操作的表达系统和启动子的描述，以其整体包括在本文中。
24.先前的研究已经显示通过在替考游动放线菌(a.teichomyceticus)中使用pkc1139成功表达基因(horbal et al.2012)。然而，复制型psg5基载体pkc1139(由bierman et al.(1992)构建)证实不适合在游动放线菌se50/110中表达同源基因，因为通过同源重组发生了不需要的载体整合，参见schaffert et al.(2019)。这似乎是有利的过程，据推定
是由于载体复制的高代谢成本。不受理论的束缚，由se50/110中的acsp50_7170编码的蛋白质(预测为重组酶a(reca))可能催化重组过程。有趣的是，在替考游动放线菌的基因组中没有发现reca的同源物。reca在游动放线菌se50/110中的存在和在替考游动放线菌中的缺乏提供了结论性的解释，为什么以前对于替考游动放线菌没有报道hr介导的载体整合。因此，通过在游动放线菌se50/110中删除重组酶基因reca，可以实现psg5基的复制型表达系统。
25.其它复制型链霉菌-大肠杆菌穿梭质粒，如基于scp2*-复制子的pkc1218(kieser et al.，2000)和基于pij101-复制子的psok101(zotchev et al.，2000)，不产生与游动放线菌se50/110的接合后体(gren 2017)。这些复制子在se50/110中可能不稳定或无活性，这与相关物种替考游动放线菌的发现一致(horbal et al.2012)。
26.通过使用整合性载体系统，可以通过在不同的基因组位置处携带另外基因拷贝的完整载体的整合来实现遗传复制。该过程由噬菌体整合酶介导。噬菌体整合酶催化两个连接位点的靶向和单向的重组：位于质粒上的attp和位于宿主染色体中的attb(te poele et al.，2008)。在整合之后，载体侧接左侧连接位点(attl)和右侧连接位点(attr)，其源自attp-attb-重组(te poele et al.，2008)。
27.对于游动放线菌se50/110已经描述了四种不同的整合载体(gren et al.2016)：两种是基于噬菌体的整合机制(pset152和pij6902)。载体prt801/2和psok804是基于噬菌体和vwb-噬菌体的整合机制。然而，通过使用天然启动子，没有实现相对转录物量的加倍，参见schaffert et al.(2019)。
28.整合性载体的同源和异源启动子的评价
29.schaffert et al.(2019)提供了一种在强度方面评价同源和异源启动子的方法，将其全部内容并入本文。简言之，整合性的-基载体pset152用于游动放线菌se50/110中的启动子筛选(gren et al.2016)。在蛋白质水平上分析13种同源和异源启动子的启动子强度，并且在转录物水平上分析其中的12种(表1，图3)。
30.表1.在启动子筛选实验中测试的具有报告基因gusa的构建体
31.[0032][0033]
策略
[0034]
对于本发明，通过基因缺失和过表达研究了阿卡维基-麦芽糖代谢，产生了一组相关工具和方法来工程化菌株用于改善阿卡波糖的生产。为了改善acarviose的合成，遵循三种不同的策略：(i)提高acb基因的基因剂量以增强通过阿卡波糖生物合成的通量，(ii)配置阿卡波糖生物合成的前体，和(iii)减少代谢负荷(图4)。这些相关策略中的每一种的途径令人惊讶地导致阿卡波糖形成的改善：通过过表达dtdp-d-葡萄糖-4,6-脱水酶acbb，最终的阿卡波糖浓度显著提高约50％。通过过表达尿苷酰转移酶gtab，阿卡波糖产率提高8.5％，推测是因为前体葡萄糖-1p的供应得到改善。通过小碳水化合物结合蛋白cgt的功能性缺失，阿卡波糖形成显著增强8-16％，这可能是因为由此降低了代谢负荷。该增强在长时间段内和在不同的培养配置中是稳健的。
[0035]
此外，进行了暴露于光和避光的野生型和调节子突变体δmerr的生长实验，揭示了光诱导的应激和类胡萝卜素形成对阿卡波糖产生的负面影响。因此，可以通过减少类胡萝卜素形成来进一步改善阿卡波糖的生产。
[0036]
附图简述
[0037]
图1.游动放线菌se50/110中阿卡维基-麦芽糖的生物合成模型。显示了从2-epi-5-epi-valiolone生物合成阿卡波糖的十一个步骤(zhang(2002))。
[0038]
图2.游动放线菌se50/110基因组(genbank:lt827010.1)中的阿卡波糖生物合成基因簇和基因分布(schaffert,et al.2019)。
[0039]
图3.在游动放线菌se50/110菌株中蛋白质和转录物水平上的启动子筛选，参见表1。左侧显示了标准化的葡糖醛酸糖苷酶活性(绝对值)，右侧显示了通过rt-qpcr计算的gusa基因的相对转录物量。对于葡糖醛酸糖苷酶测定，通过线性回归计算靛蓝的吸收曲线的斜率，并按照细胞干重标准化。在双侧t检验中测试标准化活性与pgus相比的显著性差异(p-值：p
2475
:0.8889,p
efp
:3.048e-07,p
cdar
:8.967e-07,p
rpsl
:1.296e-08,p
rpsj
:0.0003677,p
cgt
:2.183e-06,p
tipa
:0.0001651,p
apm
:0.0001078,p
erme*
:0.007406,p
kate
:0.002577,p
moee5
:0.001809,p
gapdh
:0.0005821,p
act
:0.02042)。相对于pgus-载体(设置为1)分析gusa基因的相对转录量。对于act-启动子，由于严重的生长缺陷，不能分离rna。对于残余启动子，测量到相对转录物量的显著增加(双侧t检验的p值：p
2475
:0.0001133,p
efp
:4.871e-05,p
cdar
:0.002509,p
rpsl
:9.928e-06,p
rpsj
:1.167e-08,p
cgt
:5.911e-08,p
tipa
:7.158e-06,p
apm
:4.596e-05,p
erme*
:0.0009364,p
kate
:0.0001373,p
moee5
:0.0002518,p
gapdh
:4.207e-06)。计算的p值的显著性水平由星号显示：*《α＝5％，**《α＝1％，***《α＝0.1％。图公开在(schaffert,et al.2019)中。
[0040]
图4.用于改善阿卡波糖生产的策略。提供了三种不同的策略来改善阿卡波糖的生产：1.提高阿卡波糖生物合成基因的基因剂量，2.阿卡波糖生物合成前体的分布，和3.通过基因缺失减少代谢负荷。显示了本研究中评估的靶基因。进一步，必须实施过表达系统以过表达单基因。
[0041]
图5.阿卡波糖的化学结构。阿卡波糖是由假二糖(井冈胺基(valienaminyl)-4-氨基-4,6-二脱氧葡萄糖)(称为acarviose)和麦芽糖组成的含环多醇的氨基糖苷。两者通过α-1,4-糖苷键连接。图公开在wolf2017中。
[0042]
图6.新克隆系统psett4(参见seq id no.110、seq id no.111)的载体卡。将启动子(如来自迟缓埃格特氏菌的基因gapdh的强启动子或tipa启动子)克隆在表达盒例如lacz-盒之前。lacz-盒侧接限制酶例如bsai的识别位点。通过gibson组装、限制/连接克隆或golden gate克隆，该限制位点使得能够由感兴趣的基因交换lacz。为了终止，在克隆位点之前和之后引入t4终止子。在克隆位点之后，两个反平行取向的t4终止子将阻止从两个方向的通读。为了交换启动子序列，引入其它限制性位点，例如ndei和kpni限制性位点。此外，该载体包含整合酶基因int和噬菌体的连接位点attp、转移起点(ncp)和松弛体(relaxosome)基因traj、高拷贝数cole1/pmb1/pbr322/puc复制起点和抗性基因(此处：安普霉素抗性基因aac(3)iv(apmr))。
[0043]
图7.新缺失系统的方案和同源重组期间的过程(第一和第二交换)。通过使用安普霉素或卡那霉素(第一交换，由apmr或kanr介导的抗性)进行载体整合的选择。通过使用5-氟尿嘧啶进行反选择(第二交换，由coda介导的敏感性)。
[0044]
图8.使用同源重组的新型缺失系统的工作流程。
[0045]
图9.cgt的氨基酸序列的blastp分析导致鉴定由单一cbm-20结构域组成的17种其它蛋白质。基于通过blastp进行的多序列比对(altschul et al.1990)创建蛋白质树并使
其并可视化。蛋白质树显示了通过ncbi登录号鉴定的18种单一cbm-20结构域蛋白及其宿主的距离。在括号中，blastp分析的序列同一性和阳性以百分比显示。
[0046]
图10.野生型游动放线菌se50/110在补充有不同碳源(相等c-摩尔量)的基础培养基中的生长。显示了至少三个生物学重复的细胞干重和标准偏差(n
glc
＝3,n
mal
＝5,n
cel
＝4,n
lac
＝3,n
ara
＝5,n
starch
＝5)。
[0047]
图11.a.与在麦芽糖基础培养基上生长的培养物相比，在补充有淀粉、c-pur、葡萄糖、半乳糖、纤维二糖或乳糖作为碳源的基础培养基上生长的游动放线菌se50/110中cgt的相对转录物量。在双侧t检验中的差异测试显示，与麦芽糖相比，cgt基因在碳源葡萄糖(p值＝0.002848)、半乳糖(p值＝0.002945)和乳糖(p值＝0.00114)上的显著差异基因表达。b.与在72.06g
·
l-1
麦芽糖上生长的培养物相比，在补充有44.40g
·
l-1
麦芽糖的麦芽糖基础培养基上生长的游动放线菌se50/110中cgt的相对转录物量。在双侧t检验中的差异测试显示在含有减少量的麦芽糖的培养基中cgt的基因表达显著降低(p值＝0.04141)。
[0048]
图12.游动放线菌se50/110的野生型和缺失突变体δcgt在补充有不同碳源的基础培养基中的生长。显示了随时间的细胞干重和标准偏差(野生型：n
glc
＝3,n
mal
＝5,n
cel
＝4,n
lac
＝3,n
ara
＝5,n
starch
＝5,δcgt:n
glc
＝2,n
mal
＝5,n
cel
＝4,n
lac
＝4,n
ara
＝5,n
starch
＝5)。
[0049]
图13.在补充有六种不同碳源的基础培养基中培养野生型和δcgt突变体中获得的最终细胞干重。误差条表示标准偏差。
[0050]
图14.δcgt和野生型在作为碳源的限制量的淀粉下的生长。培养基中补充有1g
·
l-1
、2g
·
l-1
、3g
·
l-1
、4g
·
l-1
和5g
·
l-1
的淀粉，并且在m2p labs的系统中进行培养。在柱形图中显示了反向散射信号和至少三个生物学重复的标准偏差。没有观察到δcgt对生长的限制。对于1g
·
l-1
，甚至发现生长显著增强(双侧t检验的p值：0.006141,n
wt
＝3,n
δcgt
＝4)。
[0051]
图15.麦芽糖基础培养基中ph筛选实验的最终细胞干重。游动放线菌se50/110的野生型和δcgt突变体在m2p-labs的系统中的48孔flowerplates中以1ml反应体积生长。在4至7的ph范围内，未观察到最终细胞干重的显著差异(通过双侧t检验测试，n
wt
＝3,n
δcgt
＝4)。
[0052]
图16.m2p-labs的系统中的渗透压耐受性筛选：麦芽糖基础培养基中的最终细胞干重，其中麦芽糖一水合物浓度在3.6与108.1g
·
l-1
之间的范围内。没有观察到显著的生长差异(通过双侧t检验测试，n
wt
＝3,n
δcgt
＝4)。
[0053]
图17.m2p-labs的系统中的渗透压耐受性筛选：麦芽糖基础培养基中渗透压筛选实验的最终细胞干重。通过加入浓度范围为0mm至280mm的肌醇来获得不同的渗透压。未观察到野生型和δcgt之间的显著生长差异(通过双侧t检验测试，n
wt
＝3，n
δcgt
＝4)。
[0054]
图18.游动放线菌se50/110野生型和δcgt突变体在分别补充有11.0g
·
l-1
麦芽糖和10.0g
·
l-1
葡萄糖一水合物的复合培养基nbs中的生长和阿卡波糖产生。未检测到差异生长。在生长期中，在δcgt中测量到阿卡波糖浓度显著增加(在培养49小时之后，t检验的显著性：p值＝0.006778,n
wt-acb
＝3，n
δcgt-acb
＝3，n
wt-cdwglc
＝4，n
δcgt-cdwglc
＝3，n
wt-cdwmal
＝4，n
δcgt-cdwmal
＝4)。
[0055]
图19.a.柱形图中相对于细胞干重的阿卡波糖最终产量系数。通过高斯误差传播计算误差条。b.细胞干重和在麦芽糖基础培养基中培养期间上清液中阿卡波糖浓度(n
cdw
＝5，n
acb
＝4)。
[0056]
图20.与在麦芽糖基础培养基上生长的野生型游动放线菌se50/110相比，突变体δcgt的基因acbz、acbw、acbv、acba、acbb、acbe和acbd的相对转录物量(n＝3-6)。
[0057]
图21.游动放线菌se50/110中胡萝卜素形成的重建。显示了通过针对ncbi数据库的blastx分析鉴定的游动放线菌se50/110中推定的同源基因。借助于kyoto encyclopedia of genes and genomes(kanehisa et al.(2014))进行重建。
[0058]
a.用于生物合成类异戊二烯前体异戊烯基焦磷酸(ipp)和二甲基烯丙基焦磷酸(dmapp)的甲基赤藓糖醇磷酸(mep)途径，其也称为甲羟戊酸途径的替代代谢途径。
[0059]
b-c:胡萝卜素形成。b.由类异戊二烯前体形成番茄红素。c.热带盐孢菌(salinospora tropica)cnb-440中糖基化类胡萝卜素sioxanthin的合成(richter et al.(2015)的图1)。
[0060]
d.游动放线菌se50/110中鉴定的基因的基因组组织。根据通过antismash的分析，基因簇2b显示出与来自热带盐孢菌cnb-440的sioxanthin基因簇的同源性，antismash是一种用于注释和分析细菌和真菌基因组中次级代谢物生物合成基因簇的快速全基因组鉴定工具(weber et al.,2015)。
[0061]
图22.暴露于光和避光的游动放线菌se50/110的生长、阿卡波糖和色素形成。a.在暴露于或避开灯光(22-44μe，1μe＝μmol
光子
m-2
s-1
)的麦芽糖基础培养基中野生型游动放线菌se50/110的培养。显示了五个生物学重复的细胞干重和三个生物学重复的上清液中的阿卡波糖浓度。b.最终培养时间的沉淀和上清液。c.在暴露于或避开自然光的sfm琼脂板上固体培养物中的生长和色素形成。
[0062]
图23.编码merr-调节物的基因在萜烯簇1中的位置及其在游动放线菌se50/110的基因组中的分布(参见图21和表e12)。所述簇的基因编码merr样转录调节物(acsp50_0145)、异戊烯基-二磷酸δ-异构酶(idi，acsp50_0146)、八氢番茄红素脱氢酶(crti，acsp50_0147)、多异戊二烯基合成酶(crte，acsp50_0148)、八氢番茄红素合酶(crtb，acsp50_0149)、脱氧核糖二嘧啶光裂合酶(acsp50_0150)和吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶(acsp50_0151)。
[0063]
图24.暴露于光和避光的游动放线菌se50/110和缺失突变体δmerr的生长、阿卡波糖和色素形成。a.在暴露于或避开灯光(22-44μe，1μe＝μmol
光子
m-2
s-1
)的麦芽糖基础培养基中培养游动放线菌se50/110的野生型和缺失突变体δmerr。显示了至少四个生物学重复的细胞干重和三个生物学重复的上清液中的阿卡波糖浓度。b.最终培养时间的沉淀和上清液。c.在固体培养基(sfm琼脂板)上的生长和色素形成。d.最大阿卡波糖浓度(双侧t检验的p值：wt黑暗对比wt光：0.003975，wt黑暗对比δmerr黑暗：0.09711，wt黑暗对比δmerr光：0.007043，δmerr黑暗对比wt光：0.02081，δmerr黑暗对比δmerr光：0.0002131)。e.当在黑暗条件下培养时，与野生型(设定为值1)相比，缺失突变体中基因crte(acsp50_0148)、crtb(acsp50_0149)、crti(acsp50_0147)、idi(acsp50_0146)和merr(acsp50_0145)的相对转录物量(双侧t检验的p值:crte:0.04245,crtb:0.01017,crti:0.07162,idi:0.004366)。星号表示显著性水平：*p-值《α＝5％，**p-值《α＝1％，***p-值《α＝0.1％。
[0064]
图25.与黑暗中生长的培养物相比，暴露于光的游动放线菌se50/110中差异转录基因的比率/强度图。将比率(log2(倍数变化))相对于微阵列实验的平均强度作图。较暗的点表示与避光培养物相比，暴露于光的培养物中具有显著差异转录水平的基因。
[0065]
图26.readxplorer(hilker et al.，2014)视图，其显示了pset152-载体系统中感兴趣的基因后面推定的反义启动子的tss。通过对合并的初级转录物文库进行测序来确定tss。显示了映射于pgus：papm：gusa的整合载体-突变体的示例性堆叠阅读。两个tss(被方框包围)以反义定向位于感兴趣的基因后面(a)。这些tss可以分配给载体骨架上的序列基序(b)，其由σa/rna聚合酶复合物推定识别为启动子序列。突出显示了-10-和-35-六聚体的保守核苷酸。如果存在，tg-二聚体以粗体黑色字母显示。六聚体之间的距离由s1显示；-10基序与tss之间的距离由s2显示。
[0066]
图27.在麦芽糖基础培养基中，acbb过表达菌株的生长和阿卡波糖产生。显示了两个独立的培养(a和b)。rna-分离的取样时间由t1(“早期生长期”)和t2(“线性生长期”)表示。
[0067]
图28.麦芽糖基础培养基中acbb过表达突变体的产率系数。在异源tipa-启动子控制下转录的具有acbb的突变体显示出增强的产率系数(约50％)，而对于具有gapdh-启动子的构建体仅观察到微小差异。通过高斯误差传播计算误差。通过双侧t检验(图中指定的缩写)测试所有差异的显著性。星号表示显著性水平：*p-值《α＝5％，**p-值《α＝1％，***p-值《α＝0.1％。
[0068]
图29.通过lc-ms分析acbb-过表达突变体的细胞内代谢物。显示了质量m/z＝545[m-h

]的标准化峰面积。a.葡萄糖-1p和半乳糖-1p(m/z＝259[m-h

])。b.葡萄糖-6p(m/z＝259[m-h

])，和c.udp-葡萄糖(m/z＝565[m-h

])。d.观察到与空载体对照相比udp-葡萄糖的标准化峰面积(双侧t检验的p值：ptip：0.01068，pgap：0.001356)和质量m/z＝545[m-h

](双侧t检验的p值：ptip：0.0412)的显著性差异。
[0069]
图30.在初始生长期中，acbb过表达突变体中的基因acbb、acba和acbv的相对转录物量。显示了至少三个生物学重复的平均值和标准偏差。通过双侧t检验测试与空载体对照(设置为值1)的差异(p值从左到右对应于psett4gap::acbb、psett4tip::acbb、psett4::p
acbb
:acbb、pset152::p
acbb
:acbb):acbb:4.332e-05,4.561e-06,0.3511,0.7082；acba:0.3384,0.0001164,0.5967,0.4246；acbv:0.3033,0.0423,0.73,0.4687)。星号表示显著性水平：*p-值《α＝5％，**p-值《α＝1％，***p-值《α＝0.1％。
[0070]
图31.在线性生长期的acbb过表达突变体中基因acbb的相对转录物量。显示了至少三个生物学重复的平均值和标准偏差。rt-qpcr表明与空载体对照(设置为1的值)相比基因表达的显著差异，其通过双侧t检验进行测试(p值从左到右对应于psett4gap::acbb、psett4tip::acbb、psett4::p
acbb
:acbb、pset152::p
acbb
:acbb):acbb:0.02217,0.02771,0.03895,0.1582)。星号表示显著性水平：*p-值《α＝5％，**p-值《α＝1％，***p-值《α＝0.1％。
[0071]
图32.gtab过表达突变体在麦芽糖基础培养基中的生长和阿卡波糖产生。rna-分离的取样时间用箭头表示。
[0072]
图33.在过表达突变体中gtab的相对转录物量。rt-qpcr表明与空载体对照(设定为1的值)相比gtab表达的显著增加(双侧t检验的p值：0.01295)。星号表示显著性水平：*p-值《α＝5％,**p-值《α＝1。
[0073]
图34.通过lc-ms分析gtab-过表达突变体的细胞内代谢物。显示了在基因gtab的过表达菌株中的质量m/z＝545[m-h

](a)、葡萄糖-1p和半乳糖-1p(m/z＝259[m-h

]，b)、葡萄糖-6p(m/z＝259[m-h

]，c)和udp-葡萄糖(m/z＝565[m-h

]，d)的峰面积。对于质量m/z＝545[m-h

]的标准化峰面积，观察到与空载体对照相比的显著差异(双侧t检验的p值：0.01531)。根据双侧t检验，所有其它峰面积没有显著差异。
[0074]
序列id的简述
[0075]
与本技术相关联的序列表以电子格式提交，并通过引用整体并入本说明书中。
[0076]
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[0113]
[0114]
[0115]
[0116][0117]
详细说明
[0118]
定义
[0119]
除非另有定义，否则说明书、附图和权利要求书中使用的所有科学和技术术语具有如本领域普通技术人员通常理解的普通含义。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入本文。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。如果通过引用并入的两个或更多个文献包括相对于彼此冲突和/或不一致的公开内容，则应以生效日期较晚的文献为准。材料、方法和实施例仅是说明性的而不是限制性的。除非另有说明，否则本文中(包括说明书和权利要求书)中使用的以下术语具有以下给出的定义。
[0120]
除非上下文另有明确说明，否则术语“包含(comprising)”、“包括(including)”、“含有(containing)”、“具有(having)”等应当扩展性地或开放式地进行解读，且没有限制。除非另有说明，否则单数形式如“一个(一种)”或“该”包括复数指代。除非另有说明，否则在一系列要素之前的术语“至少”应当理解为指代该系列中的每个要素。术语“至少一个”和“至少一个的”包括例如一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个要素。
[0121]
还应理解，高于和低于所述范围的轻微变化可用于实现与该范围内的值基本相同的结果。此外，除非另有说明，否则范围的公开旨在作为包括最小值和最大值之间的每个值的连续范围。
[0122]
在整个申请中提供蛋白质或氨基酸序列的情况下，本领域技术人员还应理解，单个或多个氨基酸可以被具有相似性质的氨基酸交换以实现基本上相同的效果，即等同的结果。本领域技术人员还知道，确定的蛋白质或氨基酸序列可以由各种不同的核酸序列编码。对于如本文定义的给定氨基酸序列，编码特定氨基酸序列的可计数的核酸序列中的每一个都应当被视为在本文中公开。在整个申请中提供核酸序列的情况下，还应理解可以引入沉默突变。
[0123]
o-{4,6-二脱氧-4[1s-(1,4,6/5)-4,5,6-三羟基-3-羟甲基-2-环己烯-1-基]-氨基-α-d-吡喃葡萄糖基}-(1
→
4)-o-α-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-d-吡喃葡萄糖或“阿卡波糖”是含环多醇的氨基糖苷，其由假二糖和α-1,4-糖苷结合的麦芽糖组成(wehmeier和piepersberg 2009)。该假二糖，命名为acarviose，由不饱和c7-氨基环醇(也称为valienol或井冈胺(valienamine))构建，其通过氮键与4,6-二脱氧-d-葡萄糖的c4连接(参见图5)(wehmeier和piepersberg 2009)。该n-糖苷键不能被外源α-1,4-葡糖苷水解酶水解，导致几乎不可逆的抑制作用(wehmeier和piepersberg 2009；brayer et al.，2000)。
[0124]
如本文所述的基因产物或蛋白质的“过表达”指与野生型或特定参考菌株相比表达的增加。优选地，参考菌株或对照是未被工程化以特异性过表达相应基因或蛋白质的菌株。例如，对照不包含含有相应基因产物或蛋白的表达盒的载体。例如，基因产物的过表达可以是在早期生长期期间、线性生长期期间、稳定期期间的增加或在任何其他时间期间的增加。优选地，过表达是与对照相比，基因产物或蛋白质增加至少1.5倍或至少2倍。关于转录物量，且如果在本文中没有另外定义，强过表达指log2(倍数变化)＞6。关于转录物量，且如果在本文中没有另外定义，弱过表达指log2(倍数变化)＜2。关于转录物量，且如果在本文中没有另外定义，则中等强过表达指log2(倍数变化)≥2且≤6。
[0125]
如果相应的基因已经以其基因产物根本不表达或以显著降低的量(例如小于0.75倍或小于0.5倍)表达的方式缺失或突变，则如本文所述的基因产物或蛋白的表达是“不存在或降低的”。如果基因产物或蛋白质例如以瞬时或永久方式(例如通过突变或敲低)丧失了功能，则如本文所述的基因产物或蛋白的表达也被认为不存在或降低。监测基因产物的量和/或活性的方法是本领域已知的，并且在本文中也以示例性方式描述。通常，获得基因产物表达不存在或降低的合适方法是改变基因表达的遗传序列或元件的方法(例如通过缺失或点突变)和/或负面影响基因的转录和翻译或基因产物(蛋白质)的活性或半衰期的方法。
[0126]
如果没有另外说明，则符号“δ”是指“缺失突变体”，即其中特定基因序列至少部分缺失的突变体。
[0127]“早期生长期”是其中游动放线菌菌株适应培养基并且其中细胞干重低于3g
·
l-1
的时间。在适应环境之后，培养物代谢由培养基供应的营养物并开始生长。由于游动放线菌在球形菌丝体中生长，其只能扩展到球体外部，因此中间的细胞与营养物隔离，并且仅具有有限的细胞分裂空间。因此，只有球形菌丝体外层中的细胞正在分裂。由此，游动放线菌的生长是线性的而不是指数的-与单细胞生长的其他细菌相反。生长期对于游动放线菌属被称为“线性生长期”，并且以3g
·
l-1
的细胞干重开始。“稳定期”被定义为生长期，其中细胞分别达到(空间和营养物的)容量极限，其中生长由于形成抑制性副产物或其他化学和物理因素(例如渗透压或ph的变化)而减少。稳定期是生长期，其中垂死细胞的数量等于分裂细胞的数量。该阶段通常在麦芽糖基础培养基中的细胞干重为16-18g
·
l-1
时开始。
[0128]
如本文使用的术语“载体”指能够增殖与其连接的核酸分子的核酸分子。
[0129]
如本文使用的术语“表达盒”指至少包含用于表达的基因和调控序列(例如启动子)的核酸分子。
[0130]“启动子”是导致特定基因转录起始的核酸序列。
[0131]
如本文所定义的“强启动子”是其在葡糖醛酸糖苷酶测定中导致至少5
×
10-4
[l
·
g-1
·
min-1
]的标准化葡糖醛酸糖苷酶活性，和/或其导致与无启动子的pgus对照载体相比gusa基因的350倍相对转录(以log2(倍数变化)计)的启动子。在实施例和(schaffert et al.2019)中提供了用于表征启动子强度的方法的详细描述。
[0132]
实例包括以下启动子：
[0133]
·
apm:9.2
·
10-4
[l
·
g-1
·
min-1
]和log2(倍数变化)＝360.78
[0134]
·
erme*:9.7
·
10-4
[l
·
g-1
·
min-1
]和log2(倍数变化)＝291.03
[0135]
·
kate:5.1
·
10-4
[l
·
g-1
·
min-1
]和log2(倍数变化)＝342.51
[0136]
·
moee5:9.7
·
10-4
[l
·
g-1
·
min-1
]和log2(倍数变化)＝329.32
[0137]
·
gapdh:11.5
·
10-4
[l
·
g-1
·
min-1
]和log2(倍数变化)＝931.45，和
[0138]
·
actp:22.9
·
10-4
[l
·
g-1
·
min-1
]。
[0139]
如本文所定义的“中等强启动子”是其在葡糖醛酸糖苷酶测定中导致至少1
·
10-4
[l
·
g-1
·
min-1
]的标准化葡糖醛酸糖苷酶活性，和/或其导致与无启动子的pgus对照载体相比gusa基因的10倍相对转录(以log2(倍数变化)计)的启动子。实例包括以下启动子：
[0140]
·
efp:3.1
·
10-4
[l
·
g-1
min-1
]和log2(倍数变化)＝53.08
[0141]
·
cdar:3.1
·
10-4
[l
·
g-1
·
min-1
]和log2(倍数变化)＝86.82
[0142]
·
rpsl:3.5
·
10-4
[l
·
g-1
·
min-1
]和log2(倍数变化)＝98.53
[0143]
·
rpsj:3.7
·
10-4
[l
·
g-1
·
min-1
]和log2(倍数变化)＝123.97
[0144]
·
cgt:2.5
·
10-4
[l
·
g-1
·
min-1
]和log2(倍数变化)＝347.29，和
[0145]
·
tipa:4.2
·
10-4
[l
·
g-1
·
min-1
]和log2(倍数变化)＝191。
[0146]
在一些情况下，中等强启动子在葡糖醛酸糖苷酶测定中导致至少1
·
10-4
[l
·
g-1
·
min-1
]和最大5
·
10-4
[l
·
g-1
·
min-1
]的标准化葡糖醛酸糖苷酶活性。
[0147]“弱启动子”定义为其导致低于1
·
10-4
[l
·
g-1
·
min-1
]的标准化葡糖醛酸糖苷酶活性，和/或其导致与无启动子pgus对照载体相比低于10倍的相对转录的启动子。
[0148]
术语“cgt”(acsp50_5024，以前：acpl_5091)指细胞外小碳水化合物结合蛋白，由于与环糊精糖基转移酶的c-末端结构域的高度相似性，以前描述为环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶，其获得自游动放线菌，例如菌株atcc 31044/cbs 674.73/se50/110。cgt蛋白由基因cgt编码。序列在本文中描述(seq id no.20)或可经由uniprot标识符g8s155(g8s155_acts5)获得。不同菌株可以存在不同的同工型和变体，并且全部包括在该术语中。在特定突变可以交换而不改变所描述的初始序列的催化性质的情况下，很明显具有这种功能沉默突变的序列相对于初始序列是等同的。此外，蛋白质还可以进行各种修饰，例如合成或天然存在的修饰。
[0149]
术语“acbb”(acsp50_3608，以前为acpl_3681)指从游动放线菌(例如菌株atcc 31044/cbs 674.73/se50/110)获得的dtdp-d-葡萄糖-4,6-脱水酶，其可能参与阿卡波糖的acarviose部分的生物合成。acbb蛋白由基因acbb编码。序列在本文中描述(seq id no.13)或可通过uniprot标识符q9zae8(rmlb_acts5)获得。对于不同的菌株，可以存在不同的同工型和变体，并且全部包括在该术语中。在特定突变可以交换而不改变所描述的初始序列的催化性质的情况下，很明显具有这种功能沉默突变的序列相对于初始序列是等同的。此外，蛋白质还可以进行各种修饰，例如合成或天然存在的修饰。
[0150]
术语“gtab”，也称为“galu”(acsp50_7820，以前acpl_7811)，指从游动放线菌(例
如菌株atcc 31044/cbs 674.73/se50/110)获得的utp-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶。gtab似乎催化葡萄糖-1p和udp-葡萄糖相互转化，并且可能参与用于阿卡波糖的前体供应。gtab蛋白由基因gtab编码。序列在本文中描述(seq id no.19)或可经由uniprot标识符g8s608(acpl_7811)获得。对于不同的菌株，可以存在不同的同工型和变体，并且全部包括在该术语中。在可以交换特定突变而不改变所描述初始序列的催化性质的情况下，很明显具有这种功能沉默突变的序列相对于初始序列是等同的。此外，蛋白质还可以进行各种修饰，例如合成或天然存在的修饰。
[0151]
如本文定义的“类胡萝卜素合成所必需的基因”被定义为合成类胡萝卜素绝对需要的基因。已知游动放线菌产生各种可溶性色素，包括类胡萝卜素类的黄色、橙色和粉红色色素。在游动放线菌中，类胡萝卜素合成所必需的基因集包括来自mep/doxp途径的基因、萜烯簇1的基因、萜烯簇2a的基因、萜烯簇2b的基因和莰烯样单萜生物合成萜烯簇3的基因。mep/doxp途径的基因包括
[0152]
i.1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs(acsp50_7096,seq id no.23)，
[0153]
ii.4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶基因ispg(acsp50_7248,seq id no.24)，
[0154]
iii.1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因dxr(acsp50_7250,seq id no.25)，
[0155]
iv.4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶基因isph(acsp50_7707,seq id no.26)，
[0156]
v.4-(胞苷5'-二磷酸)-2-c-甲基-d-赤藓糖醇激酶基因ispe(acsp50_7802,seq id no.27)，
[0157]
vi.2-c-甲基-d-赤藓糖醇2；4-环二磷酸合酶基因ispf(acsp50_8046,seq id no.28)，和/或
[0158]
vii.2-c-甲基-d-赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶基因ispd(acsp50_8047,seq id no.29)。
[0159]
萜烯簇1的基因包括
[0160]
i.异戊烯基-二磷酸δ-异构酶基因idi(acsp50_0146,seq id no.30)，
[0161]
ii.ζ-八氢番茄红素去饱和酶基因crti(acsp50_0147,seq id no.10)，
[0162]
iii.聚异戊二烯基合成酶基因crte/ldsa(acsp50_0148,seq id no.31)，
[0163]
iv.八氢番茄红素合酶基因crtb(acsp50_0149,seq id no.32)，
[0164]
v.脱氧核糖二嘧啶光裂解酶基因(acsp50_0150,seq id no.33)，或
[0165]
vi.吡啶核苷酸二硫化物氧化还原酶基因(acsp50_0151,seq id no.34)。
[0166]
萜烯簇2a的基因包括
[0167]
i.转录调节子基因(acsp50_1631,seq id no.35)，
[0168]
ii.番茄红素环化酶基因(acsp50_1632,seq id no.36)，
[0169]
iii.番茄红素环化酶基因(acsp50_1633,seq id no.37)，
[0170]
iv.聚异戊二烯基合成酶(法呢基焦磷酸合成酶2基因)fps2/crte(acsp50_1634,seq id no.38)，和
[0171]
v.亚甲基四氢叶酸还原酶(nadph)基因(acsp50_1635,seq id no.39)。
[0172]
萜烯簇2b的基因包括
[0173]
i.lysr-家族转录调节子基因(acsp50_1650,seq id no.40)，
[0174]
ii.甲基转移酶11型基因(acsp50_1651,seq id no.41)，
[0175]
iii.cdp-醇磷脂酰转移酶pgsa(acsp50_1652,seq id no.42)，
[0176]
iv.ζ-八氢番茄红素去饱和酶(crti-家族)基因crtd(acsp50_1653,seq id no.43)，
[0177]
v.糖基转移酶基因cruc(acsp50_1654,seq id no.44)，
[0178]
vi.假定蛋白(置膜蛋白)基因cruf(acsp50_1655,seq id no.45)，
[0179]
vii.gcn5家族乙酰转移酶基因(acsp50_1656,seq id no.46)，
[0180]
viii.单加氧酶基因(acsp50_1657,seq id no.47)，和
[0181]
ix.短链脱氢酶基因(acsp50_1658,seq id no.48)。
[0182]
类胡萝卜素合成所必需的另一基因是聚异戊二烯合成酶基因crte(acsp50_3873,seq id no.49)。
[0183]
莰烯样单萜生物合成萜烯簇3的基因包括
[0184]
i.转录调节子(crp/fnr家族)基因esha(acsp50_1949,seq id no.104)，
[0185]
ii.莰烯合酶基因(acsp50_1950,seq id no.50)，
[0186]
iii.甲基转移酶(sam依赖性)11型基因(acsp50_1951,seq id no.105)，
[0187]
iv.糖基水解酶基因(acsp50_1952,seq id no.106)，和
[0188]
v.氧化还原酶/醛/酮还原酶(acsp50_1953,seq id no.107)。
[0189]
实施方案
[0190]
虽然使用放线菌目菌株游动放线菌se 50/110作为本发明的模型菌株，但是本领域技术人员清楚，一般机制和发现可以应用于其它阿卡波糖生产菌株，例如目前用于阿卡波糖的工业生产的那些菌株。根据一些实施方案，放线菌目菌株是小单孢菌科菌株。根据一些实施方案，放线菌目菌株是游动放线菌属菌株。根据一些实施方案，放线菌目菌株是游动放线菌se50(atcc 31042，cbs 961.70)(frommer et al.1973)、游动放线菌se50/110(atcc 31044，cbs 674.73)或由其衍生的游动放线菌菌株。在一些实施方案中，放线菌目菌株是商业上用于阿卡波糖生产的游动放线菌菌株。在一些实施方案中，放线菌目菌株是商业上用于阿卡波糖生产的游动放线菌菌株，如例如ep 2601209 b1和cn103298828b中公开的sn223-29-47、c445-p47、sn12755-38、sc3687-18-43、sc7177-40-17或sn19910-37-21，或其衍生的菌株。
[0191]
阿卡波糖生产的改善指阿卡波糖在特定时间内(全部或相对于细胞生长)的产率增加和/或阿卡波糖纯度的提高，例如副产物和/或阿卡波糖类似物如组分c的减少。游动放线菌菌株的培养可以如本领域已知或如本文所述的进行。在一些实施方案中，游动放线菌菌株的培养在麦芽糖基础培养基中进行。
[0192]
根据本发明的第一方面，提供一种工程化放线菌目菌株(例如游动放线菌菌株)用于改善阿卡波糖生产的方法。
[0193]
根据第一方面的一些第一实施方案，根据第一方面的方法包括工程化放线菌目菌株用于使细胞外小碳水化合物结合蛋白cgt(seq id no.20)的表达不存在或降低其表达。
[0194]
令人惊讶的是，碳水化合物结合蛋白cgt(seq id no.20)的缺失导致阿卡波糖的
生产改善。在三个独立的摇瓶培养中实现了最终阿卡波糖产率在8.3％和16.6％之间的增加(参见实施例“δcgt显示在麦芽糖基础培养基上改善的阿卡波糖形成”，图18、图19、表e10、表e11)。
[0195]
此外，与野生型相比，基因缺失突变体δcgt在测试不同碳源的筛选实验中，或在碳限制条件下(参见实施例“在不同碳源上生长期间cgt表达的分析”，“在不同碳源上或在碳限制条件下的δcgt”，图12、图13、图14)，或在ph和渗透物应激下(参见实施例“δcgt对渗透压耐受性或ph耐受性没有影响”，图15、图16、图17)，未显示出明显的生长表型。本发明人还可表明，cgt的缺失对阿卡波糖生物合成基因的表达没有负面影响(参见实施例“δcgt对阿卡波糖生物合成基因的表达没有影响”，图20)。
[0196]
不受理论的束缚，根据细胞外蛋白质组(wendler et al.2013；ortseifen 2016)和转录组(schwientek et al.2013)的综合研究，发现cgt在游动放线菌se50/110中高度表达。其基因产物被输出到细胞外空间中，占整个分泌蛋白质组的约8％。本发明人通过blastp分析分析了cbm-20单结构域蛋白在原核生物界中的分布。有趣的是，仅在17种其他物种中发现了单cbm-20结构域蛋白(参见实施例“单结构域cbm-20蛋白在真细菌界中的分布”)。这些中的大多数在放线菌目物种中发现，例如在游动放线菌属的所有菌株中。不受理论的束缚，通过cgt表达的缺失或降低，能量和资源(例如atp和氨基酸)得以缓解。然后，可以将这些资源重定向到阿卡波糖生物合成，其是生长相关产物。
[0197]
根据按照第一方面的一些实施方案，所述方法包括编码细胞外小碳水化合物结合蛋白cgt(seq id no.20)的基因的缺失或突变。属间接合系统的建立(gren et al.2016)和crispr/cas9(wolf et al.2016)的建立允许在游动放线菌se50/110中进行基因组编辑。在根据第一方面的一些实施方案中，可以使用crispr/cas9技术对放线菌目菌株进行工程化以使表达不存在或降低。在一些实施方案中，工程化放线菌目菌株以使表达不存在或降低可以如(wolf et al.2016)的描述进行。在一些实施方案中，可以如本文所述，例如如实施例“通过crispr/cas9技术缺失基因cgt”或“基于与胞嘧啶脱氨酶coda的同源重组和反选择的缺失系统”中所述进行放线菌目菌株工程化以使表达不存在或降低。
[0198]
例如，本发明人已经通过同源重组成功建立了新的缺失系统，其使用无整合酶的载体骨架和用于反选择的coda，如zhao et al.(2017)所述。
[0199]
根据第一方面的一些第二实施方案，根据第一方面的方法包括工程化放线菌目菌株以使类胡萝卜素合成所必需的至少一种基因的表达不存在或降低。在一些实施方案中，类胡萝卜素是游动放线菌的橙色色素或其衍生物。在一些不同或相同的实施方案中，类胡萝卜素是c40-类胡萝卜素。
[0200]
工程化放线菌目菌株以使其表达不存在或降低可以如先前针对当前方面所述进行。根据第一方面的一些实施方案，所述方法包括类胡萝卜素合成所必需的基因的缺失或突变。
[0201]
已知游动放线菌产生多种可溶性色素，包括类胡萝卜素类别的黄色、橙色和粉红色色素(parenti和coronelli 1979)。本发明人观察到，强色素沉着与阿卡波糖生产损失相关。这通过比较暴露于光和避光的培养物的生长和阿卡波糖产率得到证实(参见实施例“光依赖性类胡萝卜素形成和氧化应激减少游动放线菌se50/110中的阿卡波糖产生”，图22)。在诱导类胡萝卜素形成的同时，当暴露于灯光时，游动放线菌se50/110的阿卡波糖产生和
生长强烈减少(图22)。总之，监测到最终阿卡波糖浓度的39％损失。
[0202]
根据这些发现，不仅似乎合理的是产生的色素不是必需的(例如在用于商业阿卡波糖生产的技术设置中)，而且减少或耗尽游动放线菌中的类胡萝卜素合成可用于改善阿卡波糖形成。为此，根据第一方面的方法包括减少或耗尽类胡萝卜素合成所必需的至少一种基因的表达。
[0203]
本发明人还可以重建游动放线菌se50/110中的类胡萝卜素生成(参见实施例“类胡萝卜素形成的功能相关性分析”，图21)。游动放线菌中类胡萝卜素合成所必需的基因集包括来自mep/doxp途径的基因、萜烯簇1的基因、萜烯簇2a的基因、萜烯簇2b的基因、莰烯样单萜生物合成萜烯簇3的基因。
[0204]
根据依据当前方面和实施方案的一些实施方案，类胡萝卜素合成所必需的至少一个基因是mep/doxp途径的基因，例如
[0205]
i.1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs(acsp50_7096,seq id no.23)，
[0206]
ii.4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶基因ispg(acsp50_7248,seq id no.24)，
[0207]
iii.1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因dxr(acsp50_7250,seq id no.25)，
[0208]
iv.4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶基因isph(acsp50_7707,seq id no.26)，
[0209]
v.4-(胞苷5'-二磷酸)-2-c-甲基-d-赤藓糖醇激酶基因ispe(acsp50_7802,seq id no.27)，
[0210]
vi.2-c-甲基-d-赤藓糖醇2；4-环二磷酸合酶基因ispf(acsp50_8046,seq id no.28)，和/或
[0211]
vii.2-c-甲基-d-赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶基因ispd(acsp50_8047,seq id no.29)。
[0212]
根据依据当前方面和实施方案的一些实施方案，至少一个类胡萝卜素合成必需的基因是萜烯簇1的基因，例如
[0213]
i.异戊烯-二磷酸δ-异构酶基因idi(acsp50_0146,seq id no.30)，
[0214]
ii.ζ-八氢番茄红素去饱和酶基因crti(acsp50_0147,seq id no.10)，
[0215]
iii.聚异戊二烯基合成酶基因crte/ldsa(acsp50_0148,seq id no.31)，
[0216]
iv.八氢番茄红素合酶基因crtb(acsp50_0149,seq id no.32)，
[0217]
v.脱氧核糖二嘧啶光裂解酶基因(acsp50_0150,seq id no.33)，或
[0218]
vi.吡啶核苷酸二硫化物氧化还原酶基因(acsp50_0151,seq id no.34)。
[0219]
根据依据当前方面和实施方案的一些实施方案，类胡萝卜素合成所必需的至少一个基因是ζ-八氢番茄红素去饱和酶基因crti(acsp50_0147，seq id no.10)。如前所述，类胡萝卜素形成在实验室条件下不是必要的。为了改善阿卡波糖生产，切断同时发生的类胡萝卜素生物合成途径，特别是通过缺失中心基因crti，可以用于菌株开发。
[0220]
根据依据当前方面和实施方案的一些实施方案，至少一个类胡萝卜素合成必需的基因是萜烯簇2a的基因，例如
[0221]
i.转录调节子基因(acsp50_1631,seq id no.35)，
[0222]
ii.番茄红素环化酶基因(acsp50_1632,seq id no.36)，
[0223]
iii.番茄红素环化酶基因(acsp50_1633,seq id no.37)，
[0224]
iv.聚异戊二烯基合成酶(法呢基焦磷酸合成酶2基因)fps2/crte(acsp50_1634,seq id no.38)，或
[0225]
v.亚甲基四氢叶酸还原酶(nadph)基因(acsp50_1635,seq id no.39)，
[0226]
根据依据当前方面和实施方案的一些实施方案，至少一个类胡萝卜素合成必需的基因是萜烯簇2b的基因，例如
[0227]
i.lysr-家族转录调节子基因(acsp50_1650,seq id no.40)，
[0228]
ii.甲基转移酶11型基因(acsp50_1651,seq id no.41)，
[0229]
iii.cdp-醇磷脂酰转移酶pgsa(acsp50_1652,seq id no.42)，
[0230]
iv.ζ-八氢番茄红素去饱和酶(crti-家族)基因crtd(acsp50_1653,seq id no.43)，
[0231]
v.糖基转移酶基因cruc(acsp50_1654,seq id no.44)，
[0232]
vi.假定蛋白(置膜蛋白)基因cruf(acsp50_1655,seq id no.45)，
[0233]
vii.gcn5家族乙酰转移酶基因(acsp50_1656,seq id no.46)，
[0234]
viii.单加氧酶基因(acsp50_1657,seq id no.47)，或
[0235]
ix.短链脱氢酶基因(acsp50_1658,seq id no.48)，
[0236]
根据依据当前方面和实施方案的一些实施方案，类胡萝卜素合成所必需的至少一个基因是聚异戊二烯基合成酶基因crte(acsp50_3873,seq id no.49)。
[0237]
根据依据当前方面和实施方案的一些实施方案，类胡萝卜素合成必需的至少一个基因是莰烯样单萜生物合成萜烯簇3的基因，例如
[0238]
i.转录调节子(crp/fnr家族)基因esha(acsp50_1949,seq id no.104)，
[0239]
ii.莰烯合酶基因(acsp50_1950,seq id no.50)，
[0240]
iii.甲基转移酶(sam依赖性)11型基因(acsp50_1951,seq id no.105)，
[0241]
iv.糖基水解酶基因(acsp50_1952,seq id no.106)，或
[0242]
v.氧化还原酶/醛/酮还原酶(acsp50_1953,seq id no.107)。
[0243]
因为类胡萝卜素影响膜的流动性，所以缺乏类胡萝卜素，特别是c40-类胡萝卜素，也可影响游动放线菌se50/110的表面和菌丝结构。关于生产，菌丝块的分解有利于增加菌丝体表面和生物化学上可用细胞的数量。
[0244]
根据一些进一步的实施方案，根据第一方面的方法包括工程化放线菌目菌株用于过表达merr-/hth-转录调节子基因merr(acsp50_0145，seq id no.11)。工程化放线菌目菌株用于过表达可以如本文其他地方所述进行。
[0245]
除了提及的类胡萝卜素合成所必需的基因之外，本发明人令人惊奇地在萜烯簇1的基因中鉴定了类胡萝卜素合成的转录阻遏物：acsp50_0145(seq id no.11，merr-/hth-转录调节子基因merr)。参见实施例“se50/110中merr的缺失在不暴露于光下诱导类胡萝卜素形成”，图24。通过se50/110中相应基因的crispr/cas9删除，在不暴露于光下强烈诱导类胡萝卜素形成(图24b和c)。与此一致，发现阿卡波糖产生减少。当照射时，野生型和δmerr都强烈着色，并且两种菌株的最终阿卡波糖浓度相似，达到约0.52g
·
l-1
(图24b和d)。在黑暗条件下，这相当于与野生型相比，阿卡波糖形成减少约38％(达到0.83g
·
l-1
)。这与先前
的野生型生长实验一致。
[0246]
在黑暗条件下，与野生型相比，δmerr产生少约15％的阿卡波糖(0.70g
·
l-1
)。不受理论的束缚，这些生产损失被认为是由缺失突变体中类胡萝卜素形成造成的资源浪费所引起的(图24c)。总之，在光条件下的产量损失(38-39％)可能归因于缺失突变体和野生型中的进一步光诱导的应激。
[0247]
根据依据第一方面的一些第三实施方案，所述方法包括工程化放线菌目菌株用于过表达dtdp-d-葡萄糖-4,6-脱水酶acbb(seq id no.13)。
[0248]
根据本发明，令人惊讶地发现，编码dtdp-d-葡萄糖-4,6-脱水酶acbb的acb基因的过表达使最终阿卡波糖浓度显著增加约50％。这是特别令人惊讶的，因为acb簇的其他基因例如acbc不会导致阿卡波糖形成的改善。此外，与如zhao et al.(zhao,xie,et al.2017)所述观察到的完整acb簇的过表达的增加相比，观察到的增加更优。
[0249]
根据一些实施方案，所述菌株不包括工程化放线菌目菌株用于acb簇中除acba之外的其它基因的过表达。
[0250]
dtdp-d-葡萄糖-4,6-脱水酶acbb似乎参与从d-葡萄糖-1p产生活化的氨基糖，这是阿卡波糖生物合成的进料途径(图1)：不受理论的束缚，令人惊奇地发现提高的acbb活性也改善了改性前体的供应。
[0251]
如本文所述的acbb的过表达指与野生型或指定参照菌株/对照相比acbb表达的增加。例如，基因产物的过表达可以是在早期生长期、线性生长期、稳定期中增加，或在任何其它时间期间增加。
[0252]
优选地，如本文所述，acbb的过表达指与对照相比acbb转录物和/或蛋白质增加至少1.5倍或至少2倍。关于acbb转录物量，如果本文没有另外定义，强过表达是指log2(倍数变化)＞6。关于acbb转录物量，如果本文没有另外定义，中等强过表达指log2(倍数变化)≥2且≤6。
[0253]
根据一些实施方案，dtdp-d-葡萄糖-4,6-脱水酶acbb(seq id no.13)的过表达是在早期生长期期间、在线性生长期期间、在稳定期期间acbb转录物和/或蛋白的表达增加至少1.5或至少2的log2(倍数变化)，或在任何其它时间期间增加。
[0254]
根据一些实施方案，dtdp-d-葡萄糖-4,6-脱水酶acbb(seq id no.13)的过表达是在早期生长期期间、在线性生长期期间、在稳定期期间acbb转录物和/或蛋白的表达增加log2(倍数变化)≥2且≤6，或在任何其它时间期间如早期生长期期间和/或线性生长期期间增加。
[0255]
根据一些实施方案，dtdp-d-葡萄糖-4,6-脱水酶acbb(seq id no.13)的过表达是在早期生长期期间、在线性生长期期间、在稳定期期间acbb转录物和/或蛋白的表达增加log2(倍数变化)＞3且＜5，或在任何其它时间期间增加。
[0256]
根据一些实施方案，dtdp-d-葡萄糖-4,6-脱水酶acbb(seq id no.13)的过表达是在早期生长期期间、在线性生长期期间、在稳定期期间acbb转录物和/或蛋白的表达增加log2(倍数变化)＞6，或在任何其它时间期间增加。
[0257]
在具有包含异源启动子的表达载体的过表达突变体中，在psett4tip::acbb(中等强度启动子)中两个取样时间之间acbb的相对转录从4.06-倍降低至3.33-倍(log2(倍数变化))，并且在psett4gap::acbb(强启动子)中，从6.54-倍降低至2.05-倍(参见实施例“中等
过表达acbb导致阿卡波糖形成改善”)。
[0258]
根据一些实施方案，根据第一方面工程化用于基因过表达的放线菌目菌株可通过本领域已知的或本文所述的任何方法进行。
[0259]
如实施例“acbb的中等过表达引起阿卡波糖形成改善”中所述，产生了两种基于pset4的过表达突变体，其中acbb在中等强tipa-启动子或强gapdh-启动子的控制下转录。天然启动子用于作为对照的pset152-载体和pset4-载体背景中。特别地，与对照菌株相比，具有在异源tipa-启动子控制下转录的acbb的突变体显示出增强的阿卡波糖产生(图27、图28)。与空载体对照相比，产率系数增加至48.6％和51.9％。通过使用强gapdh-启动子，发现阿卡波糖的产率系数略微增加(图28)。
[0260]
根据一些实施方案，根据第一方面工程化放线菌目菌株用于过表达基因可以通过将包含acbb(seq id no.13)的表达盒的载体引入放线菌目菌株中来进行。在一些实施方案中，表达载体源于pset152。在一些实施方案中，表达载体源于psett4。如果载体包含另一载体的至少一个、两个、三个、四个元件，则载体源于该第二载体。
[0261]
根据一些实施方案，根据第一方面工程化放线菌目菌株用于过表达基因可以通过将包含acbb(seq id no.13)的表达盒的载体引入放线菌目菌株中来进行。在这些实施方案或其他实施方案中的一些实施方案中，所述表达盒在中等强启动子的控制下，所述中等强启动子的特征在于在葡糖醛酸糖苷酶测定中，标准化葡糖醛酸糖苷酶活性为至少1
×
10-4
，优选地在1
×
10-4
与5
×
10-4
[l-g-1
min-1
]之间，例如，如本文其他地方所述。在一些实施方案中，所述启动子选自efp启动子(seq id no.92)、cdar启动子(seq id no.97)、rpsl启动子(seq id no.99)、rpsj启动子(seq id no.93)、cgt启动子(seq id no.91)或tipa启动子(seq id no.81)。在一些实施方案中，启动子是tipa启动子(seq id no.81)。用psett4tip::acbb获得了阿卡波糖生产的优异结果，参见图27、图28。
[0262]
在一些实施方案中，该表达盒在强启动子的控制下，如特征在于在葡糖醛酸糖苷酶测定中，标准化葡糖醛酸糖苷酶活性为至少5
×
10-5
[l g-1
min-1
]，例如如本文其他地方所述。在一些实施方案中，所述启动子选自apm启动子(seq id no.96)、erme*启动子(seq id no.98)、kate启动子(seq id no.94)、moee5启动子(seq id no.95)或gapdh启动子(seq id no.82)。
[0263]
根据一些实施方案，根据第一方面的方法包括工程化放线菌目菌株用于中等过表达dtdp-d-葡萄糖-4,6-脱水酶acbb(seq id no.13)和任选的acba(seq id no.12)。在一些实施方案中，如果没有另外明确说明，则其也与本文所述的所有其他实施方案相容，对于除acbb和acba之外的acb基因，遗传工程化不导致转录物和/或蛋白质增加log2(倍数变化)≥2。在也与本文所述的所有其他实施方案相容的一些实施方案中，遗传工程化不导致acbc的转录物和/或蛋白质增加log2(倍数变化)≥2。
[0264]
在acbb过表达时，acb基因簇的其他基因不受显著的影响，例如在早期生长期，如对于acba和acbv所示(图30)。唯一的例外是psett4tip::acbb中acba的转录丰度略高(log2(倍数变化)＝1.87)。
[0265]
根据一些实施方案，根据第一方面的方法包括工程化放线菌目菌株用于过表达acbb(seq id no.13)和acbs(acsp50_3596)和/或acbi(acsp50_3599)。
[0266]
通过acbs和/或acbi的(另外的)过表达，可以加强氨基糖向环多醇前体的转移反
应。根据当前模型(参见图1)，该反应由acbs(acsp50_3596)或acbi(acsp50_3599)催化。
[0267]
根据一些实施方案，根据第一方面的方法包括工程化放线菌目菌株用于过表达acbb(seq id no.13)和acbcuj(acbc(acsp50_3607)和/或acbu(acsp50_3595)和/或acbj(acsp50_3600))和/或acbsi(acbs(acsp50_3596)和/或acbi(acsp50_3599))。不受理论的束缚，这种组合似乎可以增强两种阿卡波糖合成链。
[0268]
根据第一方面的一些第四实施方案，所述方法包括工程化放线菌目菌株用于过表达udp-葡萄糖-1p尿苷酰转移酶gtab(seq id no.19)。
[0269]
通过中等过表达gtab，观察到最终阿卡波糖浓度增加8.5％，参见实施例“中等过表达gtab引起阿卡波糖形成的改善”，图32，图33。有趣的是，阿卡波糖形成特别地在线性生长期后期至稳定生长期增加(图32)。不受理论的束缚，这可能是由于前体葡萄糖-1p的分布改善(参见图34)。
[0270]
如本文所述的gtab(seq id no.19)的过表达指与野生型或指定的参考菌株/对照相比，gtab转录物和/或蛋白的表达增加。例如，基因产物的过表达可以是在早期生长期期间和/或在线性生长期期间和/或在稳定期期间的增加，和/或在任何其他时间期间增加。
[0271]
优选地，过表达是与对照相比，gtab转录物和/或蛋白质增加至少1.5倍或至少2倍。关于gtab转录物量，如果本文没有另外定义，强过表达是指log2(倍数变化)＞6。关于gtab转录物量，如果本文没有另外定义，中等强过表达指log2(倍数变化)≥2且≤6。
[0272]
根据一些实施方案，udp-葡萄糖-1p尿苷酰转移酶gtab的过表达是在早期生长期期间和/或在线性生长期期间和/或在稳定期期间gtab的表达增加至少1.5或至少2的log2(倍数变化)的倍数，和/或在任何其它时间期间增加。
[0273]
在本文所述的过表达突变体之一中，基因gtab的相对转录物量增加2.64倍(log2(倍数变化))(图33)。
[0274]
根据一些实施方案，udp-葡萄糖-1p尿苷酰转移酶gtab的过表达是在早期生长期期间和/或在线性生长期期间和/或在稳定期期间gtab转录物和/或蛋白的表达增加log2(倍数变化)≥2且≤6，和/或在任何其它时间期间增加。根据一些实施方案，udp-葡萄糖-1p尿苷酰转移酶gtab的过表达是在早期生长期期间和/或在线性生长期期间和/或在稳定期期间gtab的表达增加log2(倍数变化)≥3且≤5，和/或在任何其它时间期间增加。
[0275]
根据一些实施方案，udp-葡萄糖-1p尿苷酰转移酶gtab的过表达是在早期生长期期间和/或在线性生长期期间和/或在稳定期期间gtab的表达增加log2(倍数变化)≥6。
[0276]
根据一些实施方案，根据第一方面的工程化放线菌目菌株用于基因过表达可以通过将包含gtab(seq id no.19)的表达盒的载体引入放线菌目菌株中来进行。在一些实施方案中，表达载体源于pset152。在一些实施方案中，表达载体源于psett4。如果载体包含另一载体的至少一个、两个、三个、四个元件，则载体源于该第二载体。
[0277]
根据一些实施方案，根据第一方面的工程化放线菌目菌株用于基因过表达可以通过将包含gtab(seq id no.19)的表达盒的载体引入放线菌目菌株中来进行。
[0278]
在这些实施方案或其他实施方案中的一些实施方案中，所述表达盒在中等强启动子的控制下，所述中等强启动子的特征在于在葡糖醛酸糖苷酶测定中，标准化葡糖醛酸糖苷酶活性在至少1
×
10-4
至5
×
10-5
[l-g-1
min-1
]之间，例如，如本文其他地方所述。在一些实施方案中，所述启动子选自efp启动子(seq id no.92)、cdar启动子(seq id no.97)、rpsl
启动子(seq id no.99)、rpsj启动子(seq id no.93)、cgt启动子(seq id no.91)或tipa启动子(seq id no.81)。在一些实施方案中，启动子是tipa启动子(seq id no.81)。例如，用psett4tip::gtab获得了阿卡波糖生产的良好结果，参见图32、图33。
[0279]
在一些实施方案中，该表达盒在强启动子的控制下，如特征在于在葡糖醛酸糖苷酶测定中，标准化葡糖醛酸糖苷酶活性为至少5
×
10-5
[l
·
g-1
·
min-1
]，例如如本文其他地方所述。在一些实施方案中，所述启动子选自apm启动子(seq id no.96)、erme*启动子(seq id no.98)、kate启动子(seq id no.94)、moee5启动子(seq id no.95)或gapdh启动子(seq id no.82)。
[0280]
根据第一方面的一些进一步的或相同的实施方案，所述方法包括工程化放线菌目菌株用于中等过表达dtdp-d-葡萄糖-4,6-脱水酶acbb(seq id no.13)和gtab(seq id no.19)。
[0281]
令人惊讶地发现，gtab的过表达触发阿卡波糖形成的改善。通过中等过表达acbb(例如通过使用tipa-启动子)，观察到对阿卡波糖生产的积极影响，在两次独立培养中，得到多约50％的阿卡波糖。因此，通过单acb基因acbb的过表达获得了阿卡波糖生物合成的改善。此外，通过中等过表达gtab，观察到最终阿卡波糖浓度增加8.5％。似乎合理是，通过acbb和gtab的组合过表达，通过氨基糖生物合成的通量得到改善，引起阿卡波糖产生的进一步增强。
[0282]
不受理论的束缚，与acbb的中等强过表达相比，acbb的强过表达仅诱导阿卡波糖产生的较小增加。这可能是由于在acbb的大量过表达时发生的葡萄糖-磷酸盐代谢的不平衡。gtab的过表达可以消除这种不平衡，因此acbb和gtab两者的组合过表达似乎合理地引起阿卡波糖产生的进一步增加。
[0283]
有趣的是，在psett4tip::gtab中发现质量m/z＝545[m-h

]的量显著降低(约降低48％)，其可能对应于dtdp-4-酮-6-脱氧-d-葡萄糖，所提出的acbb的产物。这可能表明，通过合成链的流更平衡，因为与空载体对照和acbb过表达突变体相比，该代谢物的积累减少(图34)。
[0284]
根据一些实施方案，根据第一方面的方法包括工程化放线菌目菌株以
[0285]
(i)用于使细胞外小碳水化合物结合蛋白cgt(seq id no.20)的表达不存在或降低，和/或，
[0286]
(ii)用于使参与类胡萝卜素合成的至少一个基因的表达不存在或降低，和/或，
[0287]
(iii)用于过表达dtdp-d-葡萄糖-4,6-脱水酶acbb(seq id no.13)，和/或
[0288]
(iv)用于过表达udp-葡萄糖-1p尿苷酰转移酶gtab(seq id no.19)。
[0289]
根据一些实施方案，根据第一方面的方法进一步包括工程化放线菌目菌株用于使trey的表达不存在或降低。
[0290]
根据一些实施方案，根据第一方面的方法进一步包括
[0291]
(i)编码细胞外小碳水化合物结合蛋白cgt(seq id no.20)的基因的缺失或突变，和/或
[0292]
(ii)参与类胡萝卜素合成的至少一个基因的缺失或突变，和/或
[0293]
(iii)将包含acbb(seq id no.13)的表达盒的载体引入放线菌目菌株中，和/或
[0294]
(iv)将包含gtab(seq id no.19)的表达盒的载体引入放线菌目菌株中。
[0295]
根据一些实施方案，根据(iii)和/或(iv)的表达盒在中等强启动子的控制下，其特征在于在葡糖醛酸糖苷酶测定中，标准化葡糖醛酸糖苷酶活性在1
×
10-4
和5
×
10-5
[l
·
g-1
·
min-1
]之间。
[0296]
根据第二方面，提供用于生产阿卡波糖的放线菌目菌株，例如游动放线菌属菌株。根据一些实施方案，放线菌目菌株是通过根据第一方面的方法产生的菌株。根据一些其他实施方案，放线菌目菌株经遗传工程化以使细胞外小碳水化合物结合蛋白cgt(seq id no.20)的表达不存在或降低。根据一些实施方案，放线菌目菌株是δcgt突变体。δcgt突变体是其中基因cgt(seq id no.20)已经至少部分缺失或倒置的放线菌目菌株变体。
[0297]
根据这些或其他实施方案中的一些实施方案，放线菌目菌株经遗传工程化以使类胡萝卜素合成所必需的至少一个基因的表达不存在或降低。根据一些实施方案，类胡萝卜素合成所必需的至少一个基因已经至少部分缺失或倒置。根据这些或其他实施方案中的一些实施方案，类胡萝卜素合成所必需的至少一个基因包括选自以下任一个的至少一个基因：
[0298]
a.mep/doxp途径的基因，例如
[0299]
i.1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs(acsp50_7096,seq id no.23)，
[0300]
ii.4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶基因ispg(acsp50_7248,seq id no.24)，
[0301]
iii.1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因dxr(acsp50_7250,seq id no.25)，
[0302]
iv.4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶基因isph(acsp50_7707,seq id no.26)，
[0303]
v.4-(胞苷5'-二磷酸)-2-c-甲基-d-赤藓糖醇激酶基因ispe(acsp50_7802,seq id no.27)，
[0304]
vi.2-c-甲基-d-赤藓糖醇2；4-环二磷酸合酶基因ispf(acsp50_8046,seq id no.28)，和/或
[0305]
vii.2-c-甲基-d-赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶基因ispd(acsp50_8047,seq id no.29)，
[0306]
b.萜烯簇1的基因，例如
[0307]
i.异戊烯基-二磷酸δ-异构酶基因idi(acsp50_0146,seq id no.30)，
[0308]
ii.ζ-八氢番茄红素去饱和酶基因crti(acsp50_0147,seq id no.10)，
[0309]
iii.聚异戊二烯基合成酶基因crte/ldsa(acsp50_0148,seq id no.31)，
[0310]
iv.八氢番茄红素合酶基因crtb(acsp50_0149,seq id no.32)，
[0311]
v.脱氧核糖二嘧啶光裂解酶基因(acsp50_0150,seq id no.33)，或
[0312]
vi.吡啶核苷酸二硫化物氧化还原酶基因(acsp50_0151,seq id no.34)
[0313]
c.萜烯簇2a的基因，例如
[0314]
i.转录调节子基因(acsp50_1631,seq id no.35)，
[0315]
ii.番茄红素环化酶基因(acsp50_1632,seq id no.36)，
[0316]
iii.番茄红素环化酶基因(acsp50_1633,seq id no.37)，
[0317]
iv.聚异戊二烯基合成酶(法呢基焦磷酸合成酶2基因)fps2/crte(acsp50_1634,
seq id no.38)，或
[0318]
v.亚甲基四氢叶酸还原酶(nadph)基因(acsp50_1635,seq id no.39)，
[0319]
d.萜烯簇2b的基因，例如
[0320]
i.lysr-家族转录调节子基因(acsp50_1650,seq id no.40)，
[0321]
ii.甲基转移酶11型基因(acsp50_1651,seq id no.41)，
[0322]
iii.cdp-醇磷脂酰转移酶pgsa(acsp50_1652,seq id no.42)，
[0323]
iv.ζ-八氢番茄红素去饱和酶(crti-家族)基因crtd(acsp50_1653,seq id no.43)，
[0324]
v.糖基转移酶基因cruc(acsp50_1654,seq id no.44)，
[0325]
vi.假定蛋白(置膜蛋白)基因cruf(acsp50_1655,seq id no.45)，
[0326]
vii.gcn5家族乙酰转移酶基因(acsp50_1656,seq id no.46)，
[0327]
viii.单加氧酶基因(acsp50_1657,seq id no.47)，
[0328]
ix.短链脱氢酶基因(acsp50_1658,seq id no.48)，
[0329]
e.聚异戊二烯基合成酶基因crte(acsp50_3873,seq id no.49)，或
[0330]
f.莰烯样单萜生物合成萜烯簇3的基因，例如
[0331]
i.转录调节子(crp/fnr家族)基因esha(acsp50_1949,seq id no.104)，
[0332]
ii.莰烯合酶基因(acsp50_1950,seq id no.50)，
[0333]
iii.甲基转移酶(sam依赖性)11型基因(acsp50_1951,seq id no.105)，
[0334]
iv.糖基水解酶基因(acsp50_1952,seq id no.106)，
[0335]
v.氧化还原酶/醛/酮还原酶(acsp50_1953,seq id no.107)。
[0336]
根据这些或其他实施方案中的一些实施方案，放线菌目菌株经遗传工程化用于过表达merr-/hth-转录调节子基因merr(acsp50_0145,seq id no.11)。
[0337]
根据这些或其他实施方案中的一些实施方案，放线菌目菌株经遗传工程化用于过表达dtdp-d-葡萄糖-4,6-脱水酶acbb(seq id no.13)。
[0338]
如本文别处所述，acbb的过表达指与对照相比，acbb增加至少1.5倍或至少2倍。优选地，对照是未被工程化用于特异性过表达dtdp-d-葡萄糖-4,6-脱水酶acbb(seq id no.13)的菌株。例如，对照不包含含有acbb的表达盒的载体。
[0339]
例如，基因产物的过表达可以是在早期生长期期间、在线性生长期期间、在稳定期期间的增加或在任何其他时间期间增加。
[0340]
根据一些实施方案，dtdp-d-葡萄糖-4,6-脱水酶acbb(seq id no.13)的过表达是在早期生长期期间、在线性生长期期间、在稳定期期间acbb转录物和/或蛋白的表达增加至少1.5或至少2的log2(倍数变化)的倍数，或在任何其它时间期间增加。
[0341]
根据一些实施方案，dtdp-d-葡萄糖-4,6-脱水酶acbb(seq id no.13)的过表达是在早期生长期期间、在线性生长期期间、在稳定期期间acbb转录物和/或蛋白的表达增加log2(倍数变化)≥2且≤6，或在任何其它时间如早期生长期和/或线性生长期期间增加。
[0342]
根据一些实施方案，dtdp-d-葡萄糖-4,6-脱水酶acbb(seq id no.13)的过表达是在早期生长期期间、在线性生长期期间、在稳定期期间acbb转录物和/或蛋白的表达增加log2(倍数变化)＞3且＜5，或在任何其它时间期间增加。
[0343]
根据一些实施方案，dtdp-d-葡萄糖-4,6-脱水酶acbb(seq id no.13)的过表达是
在早期生长期期间、在线性生长期期间、在稳定期期间acbb转录物和/或蛋白的表达增加log2(倍数变化)＞6，或在任何其它时间期间增加。
[0344]
根据一些实施方案，经遗传工程化用于过表达dtdp-d-葡萄糖-4,6-脱水酶acbb(seq id no.13)的放线菌目菌株包含用于过表达acbb的载体。根据这些实施方案中的一些，载体是如本文所述，优选地根据本文所述的一个方面所述的载体。
[0345]
根据一些实施方案，经遗传工程化用于过表达dtdp-d-葡萄糖-4,6-脱水酶acbb(seq id no.13)的放线菌目菌株包含在中等强启动子控制下的acbb(seq id no.13)的表达盒。
[0346]
根据一些实施方案，经遗传工程化用于过表达dtdp-d-葡萄糖-4,6-脱水酶acbb(seq id no.13)的放线菌目菌株包含在强启动子控制下的acbb(seq id no.13)的表达盒。优选地，所述启动子不是acbb的天然启动子。
[0347]
根据这些或其他实施方案中的一些实施方案，放线菌目菌株经遗传工程化用于过表达udp-葡萄糖-1p尿苷酰转移酶gtab(seq id no.19)。
[0348]
如本文别处所述的gtab(seq id no.19)的过表达指与野生型或指定的参考菌株/对照相比gtab的表达增加。优选地，对照是未被工程化用于特异性过表达gtab(seq id no.19)的菌株。例如，对照不包含含有gtab(seq id no.19)的表达盒的载体。例如，基因产物的过表达可以是在早期生长期期间和/或在线性生长期期间和/或在稳定期期间的增加，和/或在任何其他时间期间增加。
[0349]
根据一些实施方案，gtab的过表达是在早期生长期期间、在线性生长期期间、在稳定期期间gtab转录物和/或蛋白的表达增加至少1.5或至少2的log2(倍数变化)的倍数，或在任何其它时间期间增加。
[0350]
根据一些实施方案，gtab的过表达是在早期生长期期间、在线性生长期期间、在稳定期期间gtab转录物和/或蛋白的表达增加log2(倍数变化)≥2且≤6，或在任何其它时间期间例如在早期生长期期间和/或在线性生长期期间增加。
[0351]
根据一些实施方案，gtab的过表达是在早期生长期期间、在线性生长期期间、在稳定期期间gtab转录物和/或蛋白的表达增加log2(倍数变化)＞3且＜5，或在任何其它时间期间增加。
[0352]
根据一些实施方案，gtab的过表达是在早期生长期期间、在线性生长期期间、在稳定期期间gtab转录物和/或蛋白的表达增加log2(倍数变化)＞6，或在任何其它时间期间增加。
[0353]
根据一些实施方案，经遗传工程化用于过表达gtab的放线菌目菌株包含用于过表达gtab的载体。根据这些实施方案中的一些，载体是如本文所述，优选地根据本文所述的一个方面所述的载体。
[0354]
根据一些实施方案，经遗传工程化用于过表达gtab(seq id no.19)的放线菌目菌株包含在中等强启动子控制下的gtab(seq id no.19)的表达盒。
[0355]
根据一些实施方案，经遗传工程化用于过表达gtab(seq id no.19)的放线菌目菌株包含在强启动子控制下的gtab(seq id no.19)的表达盒。优选地，所述启动子不是gtab的天然启动子。
[0356]
根据第三方面，提供用于生产阿卡波糖的放线菌目菌株，例如游动放线菌属菌株，
其用于生产阿卡波糖。
[0357]
根据一些实施方案，提供用于生产阿卡波糖的方法，其中所述方法包括使用根据第二方面的放线菌目菌株。
[0358]
对于游动放线菌的遗传工程化，需要表达系统来过表达单个或多个基因。根据第四方面，提供用于游动放线菌的表达载体。
[0359]
根据一些实施方案，根据第四方面的载体包含中等强启动子，其特征在于在葡糖醛酸糖苷酶测定中，标准化葡糖醛酸糖苷酶活性为至少1
×
10-4
[l
·
g-1
·
min-1
]。在一些实施方案中，中等强启动子选自根据seq id no.92的efp、根据seq id no.97的cdar、根据seq id no.99的rpsl、根据seq id no.93的rpsj、根据seq id no.91的cgt或根据seq id no.81的tipa。
[0360]
根据一些实施方案，根据第四方面的载体包含强启动子，其特征在于在葡糖醛酸糖苷酶测定中，标准化葡糖醛酸糖苷酶活性为至少5
×
10-4
[l
·
g-1
·
min-1
]。在一些实施方案中，强启动子选自根据seq id no.96的apm、根据seq id no.98的erme*、根据seq id no.94的kate、根据seq id no.95的moee5或根据seq id no.82的gapdh。
[0361]
为了找到允许中等至强基因表达的其他合适的启动子，可以使用horbal et al.(2013)和myronovskyi et al.(2011)的筛选系统进行启动子筛选，所述筛选系统是基于在pset152-载体系统中克隆的报告体gusa，参见图3，表1。
[0362]
在一些实施方案中，根据第一方面的载体包含表达盒。优选地，载体包含acbb(seq id no.13)的表达盒和/或gtab(seq id no.19)的表达盒和/或merr的表达盒。
[0363]
在一些实施方案中，表达盒还可以包含在lac-启动子控制下的laczα-基因。laczα-基因编码β-半乳糖苷酶的催化结构域，其能够在克隆菌株大肠杆菌dh5αmcr(nc_017638.1)中通过蓝/白选择快速选择靶序列的整合(grant et al.1990)。
[0364]
不受理论的束缚，根据当前方面的载体包含用于载体复制、转移、维持和选择的元件。在一些实施方案中，这些元件中的至少一个源于pset152。
[0365]
在一些实施方案中，根据当前方面的载体包含bierman et al.(1992)的pset152载体的序列部分。
[0366]
优选地，载体不包含根据seq id no 108和/或seq id no 109的推定的反义启动子。这些反义启动子是由本发明人通过对5'-初级转录物文库的测序鉴定，并且损害载体pset 152的适用性。简言之，通过对富集的初级转录物文库进行测序来进行鉴定。两个推定的启动子是在感兴趣的基因后面以反义方向鉴定的(图26)。去除这两个假启动子，以防止反义转录。
[0367]
此外，在表达盒后面以相反的方向引入t4终止子，以防止进一步推定的反义阅读(参见例如图6)。在一些实施方案中，载体包含至少一个t4终止子(源于噬菌体t4)。t4-终止子可以有效地阻断转录并防止从整合酶基因通读到感兴趣的基因中。在一些实施方案中，载体包含在表达盒后面相反方向的t4终止子，以防止进一步推定的反义阅读。例如，载体可以在表达盒之前包含至少一个t4终止子和/或在表达盒之后包含至少一个t4终止子。在一些实施方案中，载体可以包含三个终止子，一个在表达盒之前和两个在表达盒之后。
[0368]
在一些实施方案中，载体包含整合酶基因int。在这些实施方案的一些中，整合酶基因int源于pset152。在一些实施方案中，根据第一方面的载体还包含连接
位点attp。整合酶基因int的整合酶通过催化两个连接位点的靶向和单向重组来介导载体在不同基因组位置处整合到宿主染色体中：位于载体上的attp和位于宿主染色体中基因acsp50_6589中的attb(前者：acpl_6602)(te poele et al.2008；gren et al.2016)。不受理论的束缚，在整合之后，载体侧接左侧连接位点(attl)和右侧连接位点(attr)，其源于attp-attb-重组(te poele，bolhuis und dijkhuizen 2008)。
[0369]
在一些实施方案中，载体包含转移起点如转移起点(incp)和/或松弛体基因如松弛体基因traj。在这些实施方案的一些中，转移起点如转移起点(incp)和/或松弛体基因如traj来源于pset152。转移起点和松弛体基因使得质粒能够从供体菌株(例如大肠杆菌et12567/puz8002(kieser et al.2000))转移。
[0370]
在一些实施方案中，根据第一方面的载体包含复制起点，例如高拷贝数cole1/pmb1/pbr322/puc复制起点(ori)。在这些实施方案的一些中，复制起点如高拷贝数cole1/pmb1/pbr322/puc复制起点(ori)来源于pset152。复制起点如高拷贝数cole1/pmb1/pbr322/puc复制起点(ori)使得质粒能够在克隆菌株(大肠杆菌dh5αmcr)和供体菌株(大肠杆菌et12567/puz8002)中复制。
[0371]
在一些实施方案中，根据第一方面的载体包含至少一种抗性标记，例如介导安普霉素抗性的抗性标记(aac(3)iv，apmr)。介导安普霉素抗性的抗性标记(aac(3)iv，apmr)可用于选择。
[0372]
根据第四方面的一些实施方案，表达载体包含pset152的至少一个元件，例如(a)根据seq id no.85的整合酶基因int，(b)根据seq id no.87的转移起点(incp)，(c)根据seq id no.88的松弛体基因traj，或(d)根据seq id no.89的高拷贝数cole1/pmb1/pbr322/puc，并且此外不包含根据seq id no.108和seq id no.109的推定的反义启动子。
[0373]
根据第四方面的一些实施方案，表达载体包含(a)根据seq id no.85的φc31整合酶基因int，和(b)根据seq id no.87的转移起点(incp)，和(c)根据seq id no.88的松弛体基因traj，和(d)复制起点，例如根据seq id no.89的高拷贝数cole1/pmb1/pbr322/puc，复制起点(ori)，和(e)任选地至少一种抗性标记，例如介导安普霉素抗性的抗性标记，例如根据seq id no.90的aac(3)iv，apmr，和(f)任选地至少一个t4-终止子，和(g)任选地，其中所述载体不包含根据seq id no.108和/或seq id no.109的推定的反义启动子。
[0374]
根据一些实施方案，所述载体包含根据seq id no.110或seq id no.111的序列。根据一些实施方案，所述载体包含根据seq id no.110或seq id no.111的序列或其片段。
[0375]
在一些实施方案中，载体的优点在于允许整合不同启动子的简单克隆机制。由此，该系统可以快速适应其它物种，例如阿卡波糖的生产菌株。
实施例
[0376]
通用工具和方法
[0377]
菌株和质粒
[0378]
本研究中使用的所有菌株列在表e1中。在本研究中使用和产生的重组菌株列在表e2、表e3和表e4中(基于质粒的表达系统列在表e2中，在大肠杆菌dh5αmcr中克隆并储存的缺失和整合构建体列在表e3中，游动放线菌se50/110的缺失和整合突变体列在表e4中)。
[0379]
表e1微生物的培养物收集
[0380][0381][0382]
表e2复制和整合性载体系统
[0383][0384][0385]
表e3基于cobb et al.(2015)的pcrispomyces-2的用于靶向缺失和整合的载体系统
[0386][0387]
表e4通过crispr/cas9技术在游动放线菌ssp.中获得的缺失和整合突变体
[0388][0389][0390]
培养基和培养条件
[0391]
除非另有说明，否则所有化学品和培养基组分均获自carl roth gmbh&co.kg(karlsruhe，germany)、sigma-aldrich(st.louis，usa)、serva electrophoresis gmbh(heidelberg，germany)或vwr international(pennsylvania，usa)。
[0392]
游动放线菌se50/110的甘油储备物的制备
[0393]
为了制备甘油储备物，使游动放线菌se50/110(atcc 31044)在复合培养基nbs(11g
·
l-1
葡萄糖1h2o、4g
·
l-1
蛋白胨、4g
·
l-1
酵母提取物、1g
·
l-1
mgso4·
7h2o、2g
·
l-1
kh2po4、4g
·
l-1
k2hpo4)中生长，并与无菌86％(v/v)甘油以2:3混合。将甘油储备物储存在-80℃下。
[0394]
在固体培养基上的生长和孢子溶液的制备
[0395]
对于孢子形成，使200-300μl的甘油储备物在大豆粉培养基(sfm-琼脂)(20g
·
l-1
大豆粉(naturkost(cologne，germany))、20g
·
l-1
d-甘露醇、20g
·
l-1
bacto
tm
琼脂(becton-dickinson，heidelberg，germany)、167μl的10n naoh的自来水溶液)的琼脂板上生长。如wolf et al.(2016)所述，在28℃下培养5-7天之后，可以通过用棉签(cotton swab)在3ml的ddh2o中洗去收获孢子。
[0396]
基础培养基的制备
[0397]
制备麦芽糖基础培养基(72.06g
·
l-1
麦芽糖
·
1h2o,5g
·
l-1
(nh4)2so4,0.184g
·
l-1
fecl2·
4h2o,5.7g
·
l-1
na3c6h5o7·
2h2o,1g
·
l-1
mgcl2·
6h2o,2g
·
l-1
cacl2·
2h2o，微量元素(最终浓度：1μm cucl2,50μm zncl2,7.5μm mncl2，溶于1m hcl中)和由在ddh2o中的5g
·
l-1
的每种k2hpo4和kh2po4组成的磷酸盐缓冲液)，并按照wendler et al.(2013)的方案过滤灭菌。
[0398]
为了代替碳源麦芽糖，分别使用79.2g
·
l-1
葡萄糖
·
1h2o、72.0g
·
l-1
c-pur(cerestar 01908,cerestar gmbh,krefeld,germany)、71.9g
·
l-1
半乳糖、68.4g
·
l-1
纤维二糖、71.9g
·
l-1
d-阿拉伯糖或72.0g
·
l-1
d-乳糖代替麦芽糖一水合物。以90:10、80:20和50:50(v/v)的比率制备麦芽糖和葡萄糖的混合物。
[0399]
对于淀粉培养基，产生来自acros organics(thermo fisher scientific分部，geel，belgium)的“可溶性淀粉”的4％(w/v)乳白溶液。为此，将无菌水在水浴中预热至90℃，并在搅拌下加入称重的淀粉部分。然后，加入剩余的培养基组分。为了允许与淀粉培养进行比较，产生具有可比较的c摩尔浓度(此处净重为44.4g
·
l-1
麦芽糖
·
1h2o)的麦芽糖基础培养基。通过加入校正剂(hcl或naoh)，通过加入肌醇分别改变碳源麦芽糖的浓度，产生
具有不同ph和渗透压的培养基，根据我们的研究肌醇不能被代谢(数据没有显示)。
[0400]
此外，还创建了具有来自acros organics的1g
·
l-1
、2g
·
l-1
、3g
·
l-1
、4g
·
l-1
和5g
·
l-1
的“可溶性淀粉”的基础培养基，用于在限制的碳源下进行培养。
[0401]
根据制造商的说明书，通过knick gmbh(berlin，germany)的ph计calimatic和gonotec gmbh(berlin，germany)的osmomat 3000测定所有培养基的ph和渗透压。
[0402]
摇瓶培养
[0403]
在gfl振摇培养器3032或3033(burgwedel，germany)中，在250ml的erlenmeyer挡板式细胞培养瓶中，在28℃和140rpm下进行培养七天。对于50ml培养基的接种，使用od＝3-5的1ml孢子溶液。如通过wolf et al.(2017a)所述测定细胞干重。将上清液储存在-20℃下用于随后分析。
[0404]
m2p-labs gmbh(baesweiler,germany)的biolector系统中的微型化培养
[0405]
在由透气密封箔覆盖的48孔flowerplate(m2p-labs gmbh，baesweiler，germany)中，以1ml反应体积进行比较生长实验，并且在m2p-labs的中在28℃和800rpm下培养1周。通过反向散射信号记录生长。为了测定最终细胞干重，将800μl/每孔取样于称重的反应管中(14,000g，2分钟)，用去离子水洗涤，并在60-70℃干燥1天。将上清液储存在-20℃下，用于后续分析。
[0406]
重组dna研究
[0407]
除非另有说明，否则通过gibson组件(gibson等2009)进行质粒构建和组装。在eppendorf thermocycler vapo.protect(hamburg,germany)中通过pcr(high-fidelity pcr master mix with gc buffer，neb，ipswich，ma，usa)扩增片段，并且当必要时，用dpni(thermo fisher scientific，waltham，ma，usa)处理。pcr产物和凝胶提取物的纯化通过使用gel和pcr clean-up试剂盒(macherey-nagel，d
ü
ren，德国)进行。将等摩尔量的dna片段以1:4的比率加入到gibson assembly master mix中。主混合物由0.64μl t5exonuclease(10u
·
μl-1
,neb,ipswich,ma,usa)、20μl phusion high-fidelity dna polymerase(2u
·
μl-1
,thermo fisher scientific,us)、160μl taq dna ligase(neb,ipswich,ma,usa)、699.36μl蒸馏水和320μl等温反应缓冲液(25％peg-8000、1ml 1m tris-hcl、100μl1m mgcl2、100μl 1m dtt、20μl的每种1mm dntp、200μl nad)组成。将样品在50℃下培养至少1小时，随后根据beyer et al(2015)的方案，通过化学转化转移至大肠杆菌dh5αmcr。在含有15g
·
l-1
琼脂(carl roth，gmbh&co，karlsruhe，germany))和50mg
·
l-1
的安普霉素硫酸盐的luria/miller肉汤培养基上进行大肠杆菌的选择。通过pcr和凝胶电泳以及通过内部测序核心设备(in-house sequencing core)的sanger测序测试阳性菌落。
[0408]
用于gusa报告系统的质粒的构建
[0409]
对于gusa报告系统的质粒的构建，参见schaffert et al.(2019)。
[0410]
新的psett4表达系统的构建
[0411]
为了克隆新的psett4表达系统，使用bierman et al.(1992)的pset152载体作为模板。通过pcr使载体骨架线性化(表e5)。
[0412]
将由gapdh启动子、在lac-启动子控制下的lacz基因和侧接三个t4终止子的几个
限制性位点组成的克隆盒在integrated dna technologies(iowa，usa)处作为串dna(string dna)订购。由于复杂的结构，所述盒以三个部分订购，并且通过genesoeing(horton1995)使用表e5中的引物组装。最后，通过gibson assembly(gibson et al.2009)组装骨架和插入物。新的载体系统命名为psett4gap。
[0413]
为了用tipa-启动子交换gapdh-启动子，按照供应商的说明，用ndei和kpni消化psett4gap，并用虾碱性磷酸酶处理。所有酶均购自thermo fisher scientific(waltham，ma，usa)。通过使用引物tipa_gaf和tipa_gar从psetgus(myronovskyi et al.2011)扩增tipa-启动子，并通过gibson组件(gibson et al.2009)用线性化骨架组装。该载体命名为psett4tip(参见图6)。
[0414]
表e5用于新的表达系统psett4gap和psett4tip组装的gibson组件引物
[0415][0416]
在新的psett4表达系统中单个基因的过表达
[0417]
对于单个基因的过表达，通过pcr扩增插入物(表e6)。用bsai(neb，ipswich，ma，usa)消化载体(psett4gap或psett4tip)，并通过gibson assembly组装(gibson et al.，2009)与插入物组装。为了在天然启动子控制下表达acbb基因，用bsai和ndei消化载体骨架psett4gap，引起在去除启动子下载体的线性化。通过使用表e6中的引物扩增感兴趣的基因和天然启动子，并通过gibson assembly(gibson et al.，2009)与载体骨架组装。
[0418]
表e6用于golden gate克隆和限制性克隆到psett4gap和psett4tip载体系统中的插入物扩增的引物
[0419][0420]
pcrispomyces-2缺失和整合载体的构建
[0421]
对于通过crispr/cas9技术构建缺失和整合突变体，根据wolf et al.(2016)的方案使用质粒pcrispomyces-2(cobb et al.2015)。将间隔物及其反向互补物作为具有重叠的寡核苷酸在metabion gmbh(steinkirchen，germany)或sigma-aldrich(taufkirchen，germany)订购(表e7)。
[0422]
根据cobb et al.(2015)的方案，将寡核苷酸退火成双链，并通过golden gate assembly(engler et al.2008)与质粒组装。为了修复cas9-诱导的双链断裂，通过gibson assembly(gibson et al.2009)将dna模板克隆到载体骨架中。作为dna模板，通过pcr(表e8)从基因组dna扩增靶基因上游和下游的侧翼序列(大约1kb)。
[0423]
表e7在用pcrispomyes-2的golden gate assembly中使用的间隔物和反向互补物。
[0424][0425]
表e8用于pcrispomyes-2缺失和整合载体的gibson assembly引物。
[0426][0427]
通过crispr/cas9技术删除基因cgt
[0428]
为了通过crispr/cas9技术(成簇规律间隔短回文重复序列/crispr相关核酸内切酶9)构建δcgt(δacsp50_5024)缺失突变体，使用质粒pcrispomyces-2(cobb et al.2015)。根据wolf et al.(2016)选择间隔物序列，并将其作为寡核苷酸与其反向互补物一起在metabion gmbh(steinkirchen，germany)订购(间隔物_1：5
’‑
acgcagcgtcgcccgctgggagaa-3’，间隔物_2：5
’‑
aaacttctcccagcgggcgacgct-3’)。根据cobb et al.(2015)(cobb et al.2015)的方案，使用bsai(neb，ipswich，ma，usa)通过golden gate assembly(engler et al.2008)将寡核苷酸退火成双链并与质粒组装。为了修复cas9-诱导的双链断裂，通过gibson assembly(gibson et al.2009)将脱氧核糖核酸(dna)模板克隆到xbai-线性化的载体中。作为dna模板，用high-fidelity pcr master mix with gc buffer(neb,ipswich,ma,usa)(引物序列：cgt_flank1_fw:5
’‑
tcggttgccgccgggcgttttttatccggtaccctgctcctcgtc-3’,cgt_flank1_rv:5
’‑
gtgacgcattgacgcaggtcgagggatatggctcagatac-3’,cgt_flank2_fw:5
’‑
gtatctgagccatatccctcgacctgcgtcaatgcgtcac-3’,cgt_flank2_rv:5
’‑
gcggcctttttacggttcctggcctacctgaccctgctgaaatgg-3’)通过聚合酶链反应扩增靶基因上游和下游的侧翼序列(大约1kb)。对于gibson assembly，将dna片段(侧翼_1:1101bp和侧翼_2:982bp)等摩尔混合以1:4的比率加入gibson assembly master mix中，所述gibson assembly master mix由0.64μl的t5外切核酸酶(10u/μl，neb，ipswich，ma，usa)、20μl的phusion high-fidelity dna聚合酶(2u/μl，thermo fisher scientific，us)和160μl的taq dna连接酶(40u/μl neb，ipswich，ma，usa)、699.36μl的蒸馏水和320μl的等温反应缓冲液(25％peg-8000，1ml的1mtris-hcl、100μl的1m mgcl2、100μl的1m dtt、20μl的每种1mm dntp、200μl的nad)组成。在50℃下培养至少1小时之后，根据(beyeret al.2015)的方案，通过化学转化将反应混合物转移到大肠杆菌dh5αmcr。通过将大肠杆菌铺板在补充有50mg l-1
安普霉素硫酸盐的15g l-1
琼脂kobel的luria/miller肉汤(lb-培养基)(两者：carl roth，gmbh&co kg，karlsruhe，germany)上进行大肠杆菌的生长和选择。将板在37℃下培养10-14小时。首先，通过pcr和凝胶电泳，接着通过我们的内部测序核心设备(用于pcr的引物序列：5'-ggcgttcctgcaattcttag-3',rev:5'-tcgccacctctgacttgagc-3'，用于测序的步移引物：w1:5'-cgctgatcttcagcttcc-3',w2:
5'-gccttcaccttccatctg-3',w3:5'-tcgggaaagccgccggag-3')的sanger测序，测试安普霉素抗性菌落。
[0429]
接合转移至游动放线菌se50/110
[0430]
从新鲜生长的nbs培养物中制备感受态游动放线菌se50/110细胞(参见上文)。将细胞在10％(w/v)冰冷的蔗糖中洗涤两次，并在冰冷的15％(v/v)甘油中洗涤两次。最后，将细胞收集在15％(v/v)冰冷甘油中(通过加入细胞沉淀的约四倍体积)，在反应管中等分至100μl，并在液氮中快速冷冻。将感受态游动放线菌细胞储存在-80℃下。
[0431]
对于接合，使用大肠杆菌et12567/puz8002(kieser et al.，2000)。根据beyer et al.(2015)将期望的构建体转移到大肠杆菌et12567/puz8002中和在补充有50mg
·
l-1
硫酸安普霉素、50mg
·
l-1
硫酸卡那霉素和15mg
·
l-1
氯霉素的lb琼脂板上选择之后，使细胞在液体培养基(具有相同补充物的lb培养基)中生长，并以0.4-0.6的光密度收获。将细胞在冰冷的lb培养基中洗涤两次，并与感受态游动放线菌se50/110细胞混合。将细胞悬浮液铺板在sfm琼脂板上。在28℃下培养20-24小时之后，将1ml溶于ddh2o中的500mg
·
l-1
硫酸安普霉素用无菌拭子分布在板上。在1周之后，可以观察到游动放线菌se50/110的第一接合后体。将接合后体转移至补充有50mg
·
l-1
硫酸安普霉素的sfm琼脂板。进行重复划线数次以从大肠杆菌中纯化游动放线菌接合后体。为了加速该过程，可以向培养基中补充50mg
·
l-1
磷霉素或甲氧苄啶以除去供体菌株。
[0432]
质粒消除以获得游动放线菌se50/110的无标记crispr/cas9缺失/整合突变体
[0433]
根据wolf et al.(2016)的方案，通过在升高的温度下在复合培养基nbs中培养来进行质粒消除。通过在含有安普霉素和不含安普霉素的sfm平板上平行划线来测试菌落中质粒的存在。通过pcr(引物序列数据未显示)测试安普霉素敏感的接合后体的缺失。从凝胶切下pcr片段，并通过我们内部sanger测序核心设备测序。
[0434]
另外，还通过oxford nanopore技术(oxford，uk)对缺失或整合突变体的基因组dna进行测序，以排除脱靶效应。为此，用微生物dna试剂盒(macherey-nagel，d
ü
ren，germany)分离nbs生长的培养物的基因组dna。通过连接试剂盒(oxford nanopore，oxford，uk)在1d基因组dna的帮助下制备文库。
[0435]
基于同源重组和用胞嘧啶脱氨酶coda的反选择的缺失系统
[0436]
通过使用复制性载体pkc1139，将载体整合到acb基因簇的基因中。基于该观察结果，开发了使用同源重组的新的缺失系统，并通过基因cgt(acsp50_5024)的实例进行了测试。
[0437]
使用具有转移起点(ncp)和松弛体基因traj的载体骨架以允许接合到游动放线菌se50/110中。在本研究中，测试了介导安普霉素和卡那霉素抗性的两种不同的抗生素抗性标记用于选择：aph(3')ii(kanr，卡那霉素)和aac(3)iv(apmr，安普霉素)。此外，整合高拷贝数cole1/pmb1/pbr322/puc复制起点，以允许在供体菌株大肠杆菌中复制。ori、orit
ncp
、tra基因和抗性盒分别取自prt802、prt801(gregory et al.2003)。由于在新的缺失系统中不含用于在游动放线菌se50/110中复制的复制子，也不含具有连接位点的整合酶基因，因此当通过同源重组整合到基因组中时，载体只能保持在游动放线菌se50/110中(图7)。为此，整合了2kb的同源序列，其位于基因cgt的侧翼。在游动放线菌se 50/110中接合转移之后，可以通过安普霉素或卡那霉素抗性选择其中发生了第一交换的突变体。为了迫使载体骨架
去整合(第二交换)，加入5-氟胞嘧啶(5-fc)，其通过胞嘧啶脱氨酶coda转化为毒性产物5-氟尿嘧啶(5-fu)。在本研究中，使用coda(s)，其是对于链霉菌属种(streptomyces ssp.)密码子优化的(dubeau等人，2009)。在第二交换之后，存在野生型的基因型或缺失突变体的基因型。
[0438]
新的缺失系统成功地测试了基因cgt，这通过菌落pcr和ont测序显示。在成功的第二交换之后，缺失突变体的比例在25％和32％之间。工作流程示于图8中。
[0439]
分析方法
[0440]
通过高效液相色谱(hplc)从上清液定量阿卡波糖
[0441]
将游动放线菌的麦芽糖生长培养物的上清液离心(20,000g，2min)，通过涡旋与甲醇1：5混合，并再次离心以除去沉淀物(20,000g，2min)。将样品转移到hplc小瓶中，并在agilent的hplc系统1100系列(g1312a二元泵serial#_de43616357、g1329a als自动进样器serial#_de43613/10、g1315a二极管阵列检测器(dad)serial#_de72002469)中分析。使用thermo fisher scientific inc.(waltham，ma，usa)的hypersil aps-2柱(125
×
4mm，3μm粒径)作为固定相，加热至40℃。使用1ml
·
min-1 68％乙腈(溶剂b)和32％磷酸盐缓冲液(0.62g
·
l-1
kh2po4和0.38g
·
l-1
na2hpo4·
2h2o)(溶剂a)的等度流(isocratic flow)作为流动相。注入40μl的每种样品，并在10分钟运行中分离。用dad检测器在210nm(参考360nm)下进行阿卡波糖的检测，并从校准曲线的峰面积定量。
[0442]
液相色谱-质谱(lc-ms)
[0443]
用于分析细胞内代谢物的样品制备
[0444]
使一式三份的游动放线菌se50/110菌株在麦芽糖基础培养基中生长至少4天。通过布氏漏斗，经由滤纸快速过滤10ml的培养物，并用2.63g
·
l-1
nacl溶液洗涤。将细胞转移到预称重的圆底螺旋盖管中，在液氮中快速冷冻，并储存在-80℃下。将细胞在thermo fisher scientific(waltham，ma，usa)的离心蒸发器(speedvac)中干燥过夜。将4mg干燥的细胞转移到新的2ml螺旋盖管中，其含有约500μl尺寸为0.1mm、0.05mm和0.01mm的氧化锆/二氧化硅微珠(bio spec products inc.，bartlesville，usa)的混合物。将700μl的80％meoh加入细胞和珠中。在均质器(fastprep fp120，thermo fisher scientific，waltham，ma，usa)中以设定6.5的速度进行细胞破碎三次30s。其间将样品在冰上冷却5分钟。将细胞悬浮液在13,000g和4℃下离心5分钟。将500μl上清液转移到hplc小瓶中，在氮气流下干燥，并溶于50μl的蒸馏水中。
[0445]
用于分析细胞外阿卡维基代谢物的样品制备
[0446]
根据ortseifen(2016)描述的方案进行样品制备。使用easy柱(macherey-nagel，d
ü
ren，germany，ref 730753)，通过固相萃取从10ml的上清液中富集糖和假糖。将柱用3ml的甲醇平衡，然后用3ml蒸馏水洗涤，之后上样样品。用3ml的95％(v/v)甲醇冲洗非特异性结合的代谢物。在3ml的甲醇中进行洗脱。
[0447]
细胞内和细胞外代谢物的lc-esi-ms
[0448]
对于lc-ms，使用与microtof-q杂合四极/飞行时间质谱仪(bruker daltonics，bremen，germany)耦联的lachromultra(hitachi europe ltd.，uk)hplc系统，其配备电喷雾电离(esi)源。
[0449]
为了分析细胞内代谢物，用-philic 5μm polymeric柱(150
×
2.1mm)(merck，darmstadt，germany)分离2μl的样品。通过使用以下梯度以0.2ml min-1
的流速应用洗脱液a(20mm的nh4hco3，ph 9.3，用氨水溶液调节)和洗脱液b(乙腈)：0分钟b：90％，30分钟b：25％，37.5分钟b：25％，40.0分钟b：80％。
[0450]
作为峰鉴定的标准，注射2μl的10μm udp-葡萄糖、葡萄糖-1-磷酸、半乳糖-1-磷酸、葡萄糖-6-磷酸和dtdp-葡萄糖。
[0451]
为了分析细胞外阿卡维基代谢物，用cogent diamond hydride
tm hplc柱(microsolv technology corporation；150mm
×
2.1mm；3μl粒径)分离10μl的样品。通过使用以下梯度，以0.4ml min-1
的流速应用洗脱液a(50％(v/v)乙腈、50％(v/v)h2o和0.1％(v/v)甲酸)和洗脱液b(90％(v/v)乙腈、10％(v/v)h2o和0.1％(v/v)甲酸)：0分钟b：100％，8分钟b：0％，13分钟b：0％，15.5分钟b：100％，18分钟b：100％。
[0452]
esi源以负离子化模式操作以分析细胞内代谢物，并且以正离子化模式操作以分析细胞外阿卡维基代谢物。将干燥气体和毛细管的温度设定为180℃。ms的扫描范围分别设定为200-1,000m/z(细胞内代谢物)和50-3,000m/z(细胞外阿卡维基-代谢物)。
[0453]
通过使用软件compass
tm
(bruker daltonics，bremen，germany)对特定质量的峰面积进行积分。将峰分别在干燥细胞(细胞内代谢物)的称重量和取样时的细胞干重(细胞外阿卡维基代谢物)上标准化。
[0454]
类胡萝卜素的提取和分析
[0455]
提取
[0456]
将来自游动放线菌se50/110的细胞沉淀物转移到2ml螺旋盖管中，该螺旋盖管具有约500μl的尺寸为0.1mm、0.05mm和0.01mm的氧化锆/二氧化硅微珠的混合物(bio spec products inc.，bartlesville，usa)。加入1ml丙酮或甲醇作为提取溶剂。在均质器(fastprep fp120，thermo fisher scientific，waltham，ma，usa)中以6.5的速度设置进行细胞破碎三次45s。中间将样品在冰上冷却5min。将均质化的细胞悬浮液在13,000g和4℃下离心20分钟。将上清液转移到玻璃小瓶中。对于hplc分析，以7：3的比率产生丙酮提取物和甲醇提取物的混合物，并转移到新的玻璃小瓶中。
[0457]
薄层色谱(tlc)和光谱分析
[0458]
将50μl提取的类胡萝卜素以5μl步骤应用到硅胶基质(hptlc-hl，目录号58077，analtech inc.，newark，usa)上，并在填充有100ml凡士林(petroleum)、11ml异丙醇和50μl水的tlc室中温育。在黑暗中进行运行。在tlc板干燥之后，用解剖刀剥离条带并转移到新管中。在加入1ml的乙醇之后，通过使用thermo fisher scientific(waltham，ma，usa)的genesys 10s uv-vis分光光度计分析吸收光谱。
[0459]
采用吸光度扫描进行类胡萝卜素的hplc分析
[0460]
根据henke et al.(2017)和heider et al.(2014)，使用agilent 1200系列hplc系统(agilent technologies gmbh&co.kg，germany)，包括用于uv-vis光谱的二极管阵列检测器(dad)，通过反相hplc分离类胡萝卜素。将20μl的样品体积以0.5ml min-1
的流速应用。使用来自cs chromatographieservice gmbh(langerwehe，germany)的预柱(10
×
4mm multohigh 100rp18-5)和主柱(prontosil 200-5c30，250
×
4mm)作为固定相，如前所述(heider et al.2014；henke et al.2017)。
[0461]
应用以下梯度：0分钟a：100％，32分钟a：75％，47分钟a：0％，70分钟a：0％，75分钟
a：100％，洗脱液a由比率为15:85(v/v)的0.1m乙酸铵的去离子水溶液和甲醇组成。洗脱液b由比率为44:43:13(v/v)的甲醇、乙腈和丙酮的混合物组成。在470nm下进行类胡萝卜素的检测。另外，在运行期间每秒进行360nm和700nm之间的波长扫描。
[0462]
测定
[0463]
通过分光光度法测量葡糖醛酸糖苷酶活性的启动子筛选实验
[0464]
进行两种不同类型的葡糖醛酸糖苷酶测定：一种用蛋白质粗提取物，一种用完整细胞。horbal et al.(2013)和siegl et al.(2013)描述的方案适应于游动放线菌se50/110。选择底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-葡糖苷酸(x-gluc，applichem gmbh，darmstadt，germany)，因为底物对-硝基苯基-d-葡糖苷酸在我们的测定条件下解离。
[0465]
生长条件和样品制备
[0466]
如上所述，将携带具有gusa基因的启动子构建体的游动放线菌突变体在麦芽糖基础培养基中培养一周。在生长期期间进行测定。取样500μl的每种培养物用于完整细胞的测定。取样1ml用于蛋白质粗提取物的测定，并转移到含有尺寸为0.1mm和0.05mm的氧化锆/二氧化硅微珠(bio spec products inc.，bartlesville，usa)的螺旋盖管中。将细胞在均质器(fastprep fp120，thermo fisher scientific，waltham，ma，usa)中以速度设定6.5破碎两次30秒和中间5分钟在冰上。在离心之后，将裂解物转移到新的反应管中，并离心。使用上清液进行无细胞测定。通过bradford测定(参见上文)进行总蛋白定量。
[0467]
葡糖醛酸糖苷酶(gus)测定
[0468]
在黑色微量滴定板(96孔ps f-底μclear，黑色，中等结合，greiner bio-one，kremsm
ü
nster，ref 655096)中进行gus测定。将100μl的各样品(细胞悬浮液或裂解物)移液到三个孔中，其中一个孔用作阴性对照，两个用作技术重复。给gus缓冲液(50mm磷酸盐缓冲液ph7.0(5.136g
·
l-1
na2hpo4·
2h2o，3.299g
·
l-1
na2po4·
2h2o)，含有5mm dtt和0.1％triton-x-100)补充2mm底物x-gluc(储备溶液：在dmf中的0.2m)。将100μl加入到100μl的样品中。对于阴性对照，加入100μl不含底物的gus缓冲液。除了每个样品的单独阴性对照之外，还制备培养基和底物对照。
[0469]
在预热的tecan reader infinite m200(ref 30016056，tecan group ag，switzerland)(37℃)中分别测量微量滴定板3小时(用完整细胞测定)，2小时(用裂解物测定)。在610和660nm处测量靛蓝的最大吸收。在扣除所有对照的吸收值之后，通过线性回归计算每条吸收曲线的斜率，并对细胞干重(用完整细胞测定)或对全蛋白量(用裂解物测定)进行归一化。使用归一化斜率比较不同突变体中的β-葡糖醛酸糖苷酶活性。
[0470]
omnilog表型微阵列系统中的筛选实验
[0471]
在omnilog identification system(hayward，ca，usa)中进行预筛选实验，以评价在不同碳源(pm1和pm2板)上的呼吸。如本文别处所述，使游动放线菌se50/110野生型和缺失突变体δcgt在sfm琼脂板上生长。通过使用无菌拭子收集细胞，并在pm1和pm2的接种液if-0a中稀释。根据制造商的方案，在的浊度计中检查细胞悬浮液的浊度以实现80％透射率。根据制造商的方案，将2.32ml细胞悬液加入20ml的if-0a、0.24ml的0.5m mgcl2、0.24ml的0.5m na2so4、0.24ml的1.5m nh4cl、0.24ml的1.0m na3po4、0.24ml的蒸馏水、0.24ml的biolog氧化还原染料混合物g和0.24ml的金属离子混合物(各自5.0mm：
zncl
2 7h2o、fecl
2 6h2o、mncl
2 4h2o、cacl
2 2h2o)中。用100μl/孔的制备溶液接种pm板，并在28-30℃下，在omnilog系统(模式71000serial#_406)中培养1周。用制造商的软件(kinetic analysis，biolog and omnilog 2.3，biolog)进行数据评估。
[0472]
rna研究
[0473]
取样和rna分离
[0474]
对于转录组分析，在生长期期间取2
×
1ml培养物，通过离心(10s)与上清液分离，并在液氮中快速冷冻。将沉淀物储存在-80℃下，直至进一步加工。
[0475]
为了分离核糖核酸(rna)，将冷冻的细胞沉淀再悬浮于500μl的lb缓冲液(rna plus，macherey-nagel，d
ü
ren，germany)中，并转移到2ml裂解基质管(0.1mm球形二氧化硅珠，mp biomedicals，santa ana，california，usa)中。在均质器(fastprep fp120，thermo fisher scientific，waltham，ma，usa)中以速度设定6.5进行细胞破碎三次20秒和中间在冰上5分钟。随后，将细胞悬浮液在13,000g和4℃下离心5分钟。使用rna plus试剂盒与用于柱上dna消化的rdnase set(macherey-nagel，d
ü
ren，germany)组合，将上清液用于rna提取。在根据制造商的方案进行提纯(clean-up)和洗脱之后，重复dna消化(在溶液中)，并通过使用相同的试剂盒再次提纯样品。用两个引物对结合游动放线菌se50/110的基因组dna和扩增大约200-300nt的小片段，测试样品的残留dna。如有必要，重复dna消化和rna提纯。用nanodrop 1000光谱仪(peqlab，erlangen，germany)分析rna的量。
[0476]
逆转录定量pcr
[0477]
根据wolf et al.(2017a)的方案，通过使用sensifast sybr no-rox one-step试剂盒(bioline，london，uk)和96孔lightcycler板(sarstedt，n
ü
mbrecht，germany)，在roche的lightcycler 96系统(mannheim，germany)中进行逆转录定量pcr。相对rna量在总rna(100ng)上归一化，并计算为2-δcq
。δcq是突变菌株与对照菌株相比的平均cq的差异。表e9中的引物用于测定基因的相对转录。
[0478]
表e9在rt-qpcr实验中使用的引物
[0479]
[0480][0481]
全基因组寡核苷酸微阵列
[0482]
根据wolf et al.(2017a)的方案进行全基因组寡核苷酸微阵列，其使杂交方法适应游动放线菌属se50/110的高g c含量。
[0483]
分离一式三份的rna，并等摩尔合并(总量为5μg合并的rna，12μl)。对于cdna合成、标记和微阵列杂交，根据制造商的说明书，使用two-color microarray-based prokaryote analysis fairplay iii标记试剂盒(版本1.4，agilent technologies，santa clara，ca，usa)，并进行wolf et al.(2017a)描述的实际调整。使用amersham cydye单反应性染料包装(ge healthcare，little chalfont，uk)进行标记。使用一种代表游动放线菌se50/110序列的定制全基因组寡核苷酸微阵列，其由wolf et al.(2017a)设计(4
×
44k格式，43,803个特征代表8,238个基因和1,417个对照点，供应商：agilent technologies，santa clara，ca，usa)。使用来自agilent technologies(santa clara，ca，usa)的所有微阵列特异性试剂和装置，包括杂交烘箱和扫描仪。使用agilent feature extraction软件版本10.7.3.1(agilent technologies,santa clara,ca,usa)进行特征提取(方案ge2_107_sep09)。通过使用微阵列和基因表达(mage)-相容性系统emma 2(dondrup et al.2009)进行随后数据分析，包括lowess归一化和统计分析。使用0.05的p值作为显著性的截止值。根据wolf et al.(2017a)之前进行的“黄色实验”，确定0.01的错误发现率的m-值截止值为1.1和-1.1。
[0484]
cgt的功能相关性的分析
[0485]
单结构域cbm-20蛋白在真细菌界中的分布
[0486]
通过blastp分析，本发明人分析了cbm-20单结构域蛋白在原核生物界中的分布。
[0487]
简言之，通过使用ncbi非冗余蛋白质数据库的blastp分析来分析单一cbm-20结构
域蛋白的分布(altschul et al.2005；altschul et al.1990)。由于cbm-20结构域存在于多种不同的蛋白和酶中，因此必须进行数据过滤：在最初的3,316blastp命中物中，排除了所有真核来源和所有具有功能特异性注释或大小超过350个氨基酸的酶。分析剩余80个blastp命中物的结构域结构(marchler-bauer et al.2017；marchler-bauer和bryant 2004；marchler-bauer et al.2015；marchler-bauer et al.2010)。这些中的大多数，总共53种蛋白含有两个被称为glyco-hydro-77-超家族4-α-葡聚糖转移酶的高级结构域涵盖的(traversed)cbm-20结构域。十个含有不同的另外结构域：分别是其中五个α-淀粉酶抑制剂结构域、两个cbm-25、n末端的cbm-26结合结构域、两个具有可能的调节功能的ipt超家族的n-末端结构域和一个duf1393结构域，其被描述存在于几种α-淀粉酶中(信息取自ncbi数据库)。这些候选物也被排除。只有18个候选物(包括来自游动放线菌se50/110的cgt)显示单一cbm-20结构域。通过ncbi数据库(ncbi数据库)的blast tree view 1.17.5，基于blastp(altschul et al.1990；altschul et al.2005)进行的多序列比对，建立蛋白质树。
[0488]
有趣的是，仅在17个其他物种中发现单一cbm-20结构域蛋白(图9)。这些中的大多数发现于放线菌目物种中，例如在游动放线菌属的所有菌株中。17个物种中的大多数最初是从土壤和环境样品中分离的，即密苏里游动放线菌(a.missouriensis)(parenti和coronelli 1979)、犹他游动放线菌(a.utahensis)(parenti和coronelli(1979)描述且由couch(1963)首次分离)、替考游动放线菌(a.teichomyceticus)(wink et al.2006)、链霉菌(streptomyces sp.)94(chu et al.1996)、链霉菌ok885(从roots,tennessee,usa分离，信息取自ncbi(ncbi数据库)的genbank(benson et al.2013))、玫瑰链孢囊菌(streptosporangium roseum)(nolan et al.2010)、streptosporangium sclerotialus(同义词chainia antibiotica)(thirumalachar 1955)、纤维单胞菌(cellulomonas sp)b6(piccinni et al.2016)、类芽孢杆菌(paenibacillus sp.)p22(hanak et al.2014)和梭菌(clostridium sp.)dmhc 10，其是从酒厂废物处理装置的污泥中分离的(kamalaskar et al.2010)。cbm-20蛋白也存在于链霉菌di166(其取样位点尚未报道)和假单胞菌科的多个物种中。它们属于已知包括土壤栖息(soil-inhabiting)成员的属。
[0489]
携带单一cbm-20蛋白而不与生境土壤或环境直接相关的菌株仅偶尔出现，如在人类病原体沙眼衣原体(thomson et al.2008)和脓肿分枝杆菌(ryan和byrd 2018；moore和frerichs 1953)的单一分离株中。
[0490]
通过体外测定证实淀粉结合功能
[0491]
cbm-20结构域被描述为具有淀粉结合功能，本发明人希望通过体外测定来测试该功能。由于n-末端信号肽导致小碳水化合物结合蛋白cgt高度表达和在细胞外空间中富集(wendler et al.2015a)，因此蛋白可以通过过滤直接从上清液浓缩。用不同浓度的马铃薯淀粉进行淀粉结合分析。通过sds-page分析淀粉级分以及上清液两者。在所有淀粉级分(1-10％(w/v)的淀粉)中，检测到在约15kda的蛋白质条带，其通过maldi-tof-ms清楚地鉴定为cgt。相反，上清液级分几乎被cgt完全耗尽。发现上清液中残留的cgt，表明加入的淀粉被cgt完全饱和。在没有淀粉的阴性对照中，cgt的大部分保留在上清液部分中。除了cgt之外，通过淀粉结合分析鉴定了另一种功能未知的小细胞外蛋白acsp50_6253(数据未显示)。
[0492]
在不同碳源上生长期间cgt表达的分析
[0493]
据报道，基因cgt在不同碳源存在下差异表达，如通过对葡萄糖和麦芽糖的转录组
和蛋白质组分析所确定的(schwientek et al.，2013；wendler et al.，2015a；ortseifen 2016)。本发明人通过逆转录定量pcr(rt-qpcr)测量转录物量，测试了几种碳源对cgt基因表达的影响。为此目的，使游动放线菌se50/110的野生型菌株在补充有麦芽糖、葡萄糖、淀粉、半乳糖、纤维二糖、乳糖和c-pur(cerestar 01908)的基础培养基上生长(图10)。后者是来自淀粉降解的含糖产物，主要由麦芽糖和麦芽三糖组成。所有碳源都补充相等c-摩尔量。唯一的例外是淀粉：由于溶解度低，这里产生了来自acros organics的“可溶性淀粉”的4％(w/v)乳白色溶液。为了进行比较，制备麦芽糖含量减少的麦芽糖基础培养基(此处：44.40g
·
l-1
麦芽糖一水合物)，其中c摩尔浓度应当接近淀粉培养基中的c摩尔浓度。
[0494]
对于大多数测试的碳源，与麦芽糖生长培养物相比，cgt基因的转录相似或仅轻微地且不显著降低(图11a)。对于半乳糖观察到较小程度的差异转录(转录少3.4，log2(倍数变化)＝0.291)。对于碳源葡萄糖(转录减少142倍，log2(倍数变化)＝0.007)和乳糖(转录减少62倍，log2(倍数变化)＝0.016)测定cgt转录物的显著降低。当细胞在具有降低量麦芽糖的麦芽糖基础培养基(此处：44.4g
·
l-1
，而不是72.06g
·
l-1
)上生长时，观察到cgt基因的转录降低2.9倍(log2(倍数变化)＝0.345)(图11b)。
[0495]
基因缺失突变体δcgt的分析
[0496]
在不同碳源上或在碳限制条件下的δcgt
[0497]
cgt相关于碳源的差异转录谱表明在糖代谢中的功能，如之前所认为的(ortseifen 2016)。ortseifen(2016)(ortseifen 2016)表明cgt在carbophore模型的背景中负责保留作为能源的碳。在液体培养物中，在不同碳源上测试野生型和crispr/cas9缺失突变体δcgt的生长。
[0498]
之前，在omnilog表型微阵列系统(biolog inc.，hayward，united states of america)中进行预筛选实验，其允许通过在多孔板中在总共190种不同碳源上测量细胞呼吸活性来进行快速表型筛选。其中，游动放线菌在103种碳源上显示出呼吸。除了阿拉伯糖和乳糖之外，在剩余的101种碳源上对于δcgt没有观察到差异呼吸特征。为了在生长水平上验证这些结果，在摇瓶培养中进一步测试碳源阿拉伯糖和乳糖。此外，测试了标准实验室糖麦芽糖和葡萄糖，和复合碳源淀粉以及二糖纤维二糖，以模拟生境土壤的天然碳源。对于δcgt没有观察到对生长的限制(图12和图13)。
[0499]
此外，在m2p-labs的-系统中测试在碳限制条件(此处：1g
·
l-1
、2g
·
l-1
、3g l-1
、4g l-1
和5g
·
l-1
淀粉)下的生长。与野生型相比，在碳源限制的情况下没有观察到δcgt突变体的生长劣势(图14)。
[0500]
δcgt对渗透压耐受性或ph耐受性没有影响
[0501]
cgt多聚体已被建议通过多聚化形成表面层(wendler et al.2015a)。这可能表明在针对环境变化如干旱、ph和渗透压方面的保护中的潜在作用。
[0502]
在-系统中的固体培养基上以及液体培养物中进行ph筛选。对于在固体培养基上筛选，制备ph范围从ph4到11的sfm-琼脂板(在步骤1中)，并且应用野生型和缺失突变体δcgt的孢子系列稀释的液滴。突变体和野生型都能从ph 5生长到11。在琼脂板上没有观察到生长或孢子形成的差异。
[0503]
由于耐旱性的影响难以评估，本发明人分析了细菌菌苔表面上的菌落和孢子形成，并且发现野生型和δcgt之间没有差异。
[0504]
对于液体培养中的ph筛选，制备ph范围为4至7的麦芽糖基础培养基。在液体培养物中不能测试较高的ph值，因为培养基组分倾向于沉淀。两种菌株均从ph 4.5生长至7(图15)。关于最终细胞干重，没有观察到差异。
[0505]
对于渗透压筛选，用在3.6至108.1g
·
l-1
的一水麦芽糖范围的不同麦芽糖浓度和在323.5至681.0mosmol kg-1
范围的渗透压的制备麦芽糖基础培养基(表e11)。在野生型和缺失突变体δcgt之间没有观察到显著的生长差异(图16)。
[0506]
此外，肌醇作为渗透剂进行测试，因为它不会被游动放线菌消耗。此处，渗透压在388.5至695.0mosmol kg-1
的范围内，但是没有观察到生长差异(图17)。
[0507]
通过使用复合培养基nbs，测试在159-190mosmol kg-1
之间的较低渗透压。此外，在野生型菌株和缺失突变体δcgt之间没有观察到显著的生长差异。
[0508]
表e10筛选实验的表格总结。在本研究中用于筛选渗透压和ph的不同基础培养基的最终细胞干重、最终阿卡波糖浓度、ph和渗透压。用于ph筛选的培养基中不同的渗透压是通过加入校正剂引起的。
[0509]
[0510][0511]
δcgt显示在麦芽糖基础培养基上阿卡波糖的形成改善
[0512]
尽管在测试条件下没有观察到明显的生长表型，但是缺乏高度表达的cgt蛋白似乎节省了细胞的代谢资源，例如atp和氨基酸。这些可用于细胞生长或其它合成代谢过程。在实验中，δcgt没有显示出显著的生长优势。然而，与野生型相比，对于缺失突变体δcgt检测到显著更高的最终阿卡波糖浓度(表e10)。对于在复合培养基中的培养，这在生长期期间是最显著的(图18)。
[0513]
通过在麦芽糖基础培养基中进行三次独立的摇瓶培养，证实了阿卡波糖-产生表型的改善(图19和表e11)。从上清液中定量阿卡波糖显示与野生型相比，缺失突变体的阿卡波糖产率系数增加。最终阿卡波糖产率的差异是显著的(通过双侧t检验进行检验，p值＝0.04608)。因此，在δcgt中，达到最终阿卡波糖浓度8.3％至16.6％的增加(参见表e11)。
[0514]
表e11.在阿卡波糖生产条件下生长实验的表格总结。δcgt和野生型在麦芽糖基础培养基中的三个独立培养的最终阿卡波糖浓度、最终细胞干重和重复数n。
[0515][0516]
δcgt对阿卡波糖生物合成基因的表达没有影响
[0517]
发现高度表达的基因cgt的缺失对在各种条件下生物体的生长或生存力没有负面影响，但是产生增强的阿卡波糖产生表型是令人惊讶的。由于此，并且为了排除对阿卡波糖生物合成(acb)基因调节的直接影响，进行了代表性acb基因的rt-qpcr。为此，使野生型和δcgt在麦芽糖基础培养基上生长，并且从早期生长期的样品中分离rna。与野生型相比，计算δcgt的阿卡波糖生物合成簇基因acbz、acbw、acbv、acba、acbb、acbd和acbe的相对转录物量(图20)。基因acbv是阿卡波糖生物合成基因簇的主要操纵子内几个多顺反子(polycistronically)转录基因中的第一个(wolf et al.2017b)。编码细胞外阿卡波糖代谢蛋白的单顺反子转录基因acbd和acbe已显示受阿卡波糖调节子acrc的强烈调节(wolf et al.2017a)。基因acba、acbb和acbz也是单顺反子转录的，并且分别注释为阿卡波糖生物合成(acbab)及其细胞外代谢(acbz)的酶。acbw是acbwxy操纵子的第一个基因，推定编码abc转运蛋白。对于所有选择的转录物，与野生型相比，在缺失突变体δcgt中没有测量到相对转录物水平的显著变化(图20)。
[0518]
讨论
[0519]
碳水化合物代谢和阿卡波糖生物合成的关系是高度令人感兴趣的。最近的研究指出了碳利用在野生型中阿卡波糖和进一步的阿卡维基代谢物的生物合成背景中的重要性(wendler et al.，2014)。
[0520]
在此情况中，淀粉结合蛋白cgt是显著的。其是游动放线菌se50/110中表达最强的基因之一(schwientek et al.2013)，占整个分泌蛋白质组的约8％(本发明人的未公布数据)。其基因产物被输出到细胞外空间中(wendler et al.2013)。过量生产和输出意味着细胞的高成本：仅对于翻译过程，每个肽键需要4个atp(campbell和reee 2011；purves2006)，即不包括rna合成、氨基酸产生、蛋白质折叠和输出的额外成本。因此，本发明人得出结论，cgt在游动放线菌se50/110生理学中具有重要作用。本文提出并分析了cgt的两种不同功能：在糖代谢中的作用和作为表面蛋白的作用。
[0521]
由于淀粉结合结构域，ortseifen(2016)(ortseifen 2016)提出在carbophore模型的背景下，cgt可能参与能量源的结合和保留(wehmeier2003)。在此还通过rt-qpcr给出
了证据，其显示了与在麦芽糖、高级麦芽糖糊精和纤维二糖上生长的培养物相比，在葡萄糖-、半乳糖-和乳糖-生长培养物中的基因cgt差异表达。这与碳源麦芽糖和葡萄糖上的差异蛋白质组分析一致(wendler et al.2015a；wendler et al.2015b)。这些结果表明cgt的碳依赖性表达。阐明调节机制将是令人兴奋的。然而，仍有待考虑的是，超过900种基因被推定参与游动放线菌se50/110中的转录调节，其中根据wolf et al.(2017b)的注释，697种被注释为转录调节子(genbank:lt827010.1)。
[0522]
cgt的糖依赖性表达可能表明在麦芽糖、高级麦芽糖糊精和-潜在的-还有纤维二糖利用中的功能。然而，我们对缺失突变体δcgt的研究没有揭示关于碳利用的表型差异。这是对总共105种不同的碳源进行测试的，其中103种在omnilog筛选系统中进行分析，六种在液体培养物中进行分析。
[0523]
由于cgt的功能在过量碳源下可能是可忽略的，但是当在限制碳源的条件下生长时是必不可少的，本发明人已经测试了缺失突变体δcgt和野生型在具有低浓度淀粉的基础培养基上的生长。由于cgt的淀粉结合活性，选择淀粉作为碳源，这在本文的淀粉结合测定中得到证实。然而，在限制碳源的条件下不能观察到突变体的生长表型。
[0524]
糖代谢内的另一个功能可能在于结合可能导致结构变化的不溶性结晶底物，其增加底物的可接近性并增强其它水解酶如淀粉酶的活性。这种机制已经描述在土壤细菌粘质沙雷氏菌中用于几丁质裂解(vaaje-kolstad et al.2005)和褐色嗜热裂孢菌(thermobifida fusca)中用于细胞分解(moser et al.2008)。在游动放线菌se50/110的基因组中，几种基因编码推定的α-糖苷功能，其中三种，α-淀粉酶/支链淀粉酶acbe、acbz和pula，显示在细胞外空间中积累(wendler et al.2015a)。另外，在淀粉结合测定中鉴定了另一种功能和淀粉结合能力未知的小细胞外蛋白(acsp50_6253)。通过细胞外淀粉酶的异源表达及在存在和不存在-cgt和acsp50_6253-两者的情况下的酶测定，可以在未来的实验中检测在淀粉降解期间的支持功能(supporting function)。
[0525]
除了糖代谢之外，还可以想到作为表面层蛋白的功能，这得到cgt形成多聚体的事实的支持(ortseifen 2016；wendler et al.2013)。wendler et al.(2015)(wendler et al.2015a)鉴定了cgt蛋白中的两个跨膜结构域，其中一个作为前导肽的部分参与通过sec途径的易位，第二个被认为是多聚化所需的。尽管cgt不太可能物理锚定在膜中(wendler et al.2015a)，但是由于流体流动减少，cgt蛋白可作为多聚体保留在菌丝体的网中。在这种情况下，淀粉结合结构域也可以用作锚。
[0526]
在作为推定的表面蛋白的作用中，本发明人最初认为在ph和渗透压应激或干旱(drought)的情况下具有保护性功能。然而，筛选实验表明，在液体培养物中，在不同ph下，cgt基因的缺失不会导致显著的生长抑制。根据在固体培养基上的筛选实验，没有迹象表明cgt在ph或干旱的情况下可能具有保护功能。
[0527]
通过在不同量的麦芽糖上生长的野生型的逆转录定量pcr给出了在渗透调节背景下推定功能的提示。此处，本发明人观察到与72g
·
l-1
相比，当在44.4g
·
l-1
麦芽糖上生长时，基因cgt的转录降低2.9倍，这可能是渗透压的影响。本发明人在几个筛选实验中，在培养基范围为159mosmol kg-1
至681mosmol kg-1
的液体培养物中分析了缺失突变体δcgt的生长。在所有测试条件下，与野生型相比，没有观察到缺失突变体δcgt的生长和活力的差异。
[0528]
令人惊奇的是，无论是在过量使用不同碳源时还是在限制条件下，无论是在不同
ph下还是在渗透压条件下，缺失cgt基因都没有观察到明显的生理影响，很可能cgt的功能仅在其天然环境中和在可能与其它土壤生物的竞争中变得明显。有趣的是，本发明人在17个其它原核物种中发现了类似的独立单一cbm-20结构域蛋白，其中大多数属于放线菌目。尽管罕见，但是这至少显示了特定的分布，并且显示cgt不是菌株特异性蛋白。大多数携带单结构域cbm-20蛋白的物种与土壤生境相关。连同cgt在游动放线菌se50/110中高度表达的事实一起，这支持了蛋白质如cgt在生活在该生境内的细菌中实现关键功能的假设。cgt的功能将来可以通过与其它微生物竞争物直接接触的共培养来测试。
[0529]
虽然令人惊讶的是，cgt在测试的实验室条件下证明是不必要的，但是本发明人观察到关于阿卡波糖生产的阳性表型。通过缺失cgt获得了阿卡波糖产率增加8.3％至16.6％。尽管最终产物产率在批培养之间略有不同，但是δcgt突变体总是运行得显著更好。这在三个独立的摇瓶和在麦芽糖基础培养基中进行的几次微量培养中经几个月的时间显示(数据未显示)。因此，改善的生产在长时间段内和在不同的培养设置中是稳健的。
[0530]
我们认为这是由于在野生型中cgt基因表达的代谢负担引起的，其在δcgt中带来能量和游离资源的缓解。这些资源可能被重定向到阿卡波糖生物合成，其是生长相关的产物。没有观察到cgt缺失对acb基因表达的直接调节作用。
[0531]
类胡萝卜素形成的功能相关性分析
[0532]
光依赖性类胡萝卜素形成和氧化应激减少游动放线菌se50/110中的阿卡波糖产生
[0533]
已知游动放线菌产生多种可溶性色素，包括类胡萝卜素类的黄色、橙色和粉红色色素(parenti和coronelli 1979)。游动放线菌se50/110的色素为橙色。当暴露于光培养时，其形成增强。由于在上清液中同样发现了色素，所以其似乎可溶于水溶液中。在细胞提取和通过薄层色谱分离之后，光谱分析显示吸收最大值位于450、475和505-510处，这通过hplc分离期间进行的吸光度扫描得到证实。与这些发现一致，计算机模拟重建显示游动放线菌se50/110具有产生与来自热带盐孢菌cnb-440的sioxanthin相似的c40-类胡萝卜素的完整的遗传装置(richter et al.，2015，wolf et al.，2017b)(图21和表e12)。
[0534]
表e12.在游动放线菌se50/110中类胡萝卜素合成的重建。通过antismash分析(blin et al.2017；weber et al.2015)鉴定两个萜烯合成基因簇，其可以被归因于形成与来自在热带盐孢菌cnb-440中的sioxanthin基因簇相似的c40-类胡萝卜素(richter et al.，2015)(萜烯簇1-2)。此外，通过blastp分析(altschul et al.2005)和kegg(kanehisa et al.2014)鉴定了莰烯样单萜基因簇(萜烯簇3)、mep/doxp途径的所有基因和编码番茄红素降解的基因。
[0535]
[0536]
al.，2017b)似乎是小单孢菌科特征性的。
[0541]
此外，在se50/110的基因组中发现了通过mep/doxp-途径合成构建块ipp和dmapp的基因(表e12)、编码莰烯样单萜合酶(萜烯簇3，表e12)以及类胡萝卜素裂解双加氧酶(acsp50_5522，表e12)的基因。后两者可能参与有气味物质的形成(yamada et al.，2015)。本发明人观察到，强色素沉着与生产损失相关。这通过比较暴露于光和避光的培养物的生长和阿卡波糖产率得到证实(图22)。在诱导类胡萝卜素形成时，当暴露于强度为22-44μe(1μe＝μmol
光子
m-2
s-1
)的灯光时，游动放线菌se50/110的阿卡波糖产生和生长强烈减少。总之，监测到最终阿卡波糖浓度损失39％。
[0542]
se50/110中merr的缺失在不暴露于光的情况下诱导类胡萝卜素形成
[0543]
由于自然光或灯光能够诱导类胡萝卜素形成(图22b，c)，本研究在se50/110中寻找可能的调节基因。在萜烯簇1内发现了merr-调节子(acsp50_0145，图23)。
[0544]
merr-家族主要由活化剂组成，其能够响应环境刺激，如氧化应激、重金属或抗生素(brown et al.，2003)。实际上，merr-家族的几个成员已经被描述为非光合细菌中类胡萝卜素生物合成的光依赖性活化剂或阻遏剂，所述非光合细菌例如在相关放线菌天蓝色链霉菌(s.coelicolor)(takano et al.，2005；takano et al.，2006)、革兰氏阴性嗜热栖热菌(thermus thermophiles)hb27(takano et al.，2011)和革兰氏阳性巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)qm b1551(takano et al.，2015)中的litr。在此，钴胺素(维生素b12)充当辅因子，其介导光敏感性，因为其能够吸收紫外光和蓝光：通过与调节剂共价结合或在光激发之后脱落，其能够调节调节剂的构象和活性(van der horst et al.，2007)。调节机制和结合位点非常不同：而在嗜热栖热菌和巨大芽孢杆菌中，litr/crtb(takano et al.，2011)或litr和crti(takano et al.，2015)的启动子区域在黑暗中被抑制并且在光照之后被释放，天蓝色链霉菌中的litr似乎是相邻定位的lits的主要光诱导的转录激活剂，其编码ecfσ因子并指导类胡萝卜素生物合成基因的转录(takano et al.2005)。编码ecfσ因子的基因不存在于se50/110的基因簇内。在革兰氏阴性细菌黄色粘球菌(myxococcus xanthus)中，b12依赖性merr调节子是包括八个其它的调节基因的复杂调节级联的一部分(fontes et al.2003；galbis-martinez et al.2012)。实际上，通过blastp-分析在se50/110的基因组中没有鉴定到来自黄色粘球菌的调节网络的同源物(数据未显示)。
[0545]
游动放线菌se50/110的merr家族调节子acsp50_0145含有n-末端hth基序和c-末端b12结合结构域(根据blastp分析和cdd搜索(marchler-bauer et al.2015；marchler-bauer et al.2010；altschul et al.2005))。hth结构域的位置构成转录阻遏物(p
é
rez-rueda和collado-vides 2000)。
[0546]
通过se50/110中相应基因的crispr/cas9缺失，在不暴露于光的情况下强烈诱导类胡萝卜素形成(图24b，c)。这证实了作为转录阻遏物的功能。
[0547]
实际上，必须注意的是，阻遏物/操纵子系统是有漏洞的(leaky)，因为在野生型中在不暴露于光的情况下也产生典型的橙色。据此，在黑暗条件下，与野生型相比，基因crtebi和idi(acsp50_0146-0149)的转录仅在δmerr中加倍(图24e)。这些差异对于crte、crtb和idi是显著的。观察到对acb基因转录没有影响。
[0548]
然而，在本研究的情况中，检查了δmerr中的色素形成是否影响精细化学品阿卡波糖的形成的问题。再次，较高的类胡萝卜素形成与较低的阿卡波糖形成相关(图24a，d)。
当照明时，野生型和δmerr都强烈着色，并且两种菌株的最终阿卡波糖浓度类似，达到约0.52g
·
l-1
(图24b、d)。这相当于在黑暗条件下与野生型相比，阿卡波糖形成减少约38％(达到0.83g l-1
)。这与本文所述的野生型的先前生长实验一致。
[0549]
在黑暗条件下，δmerr产生的阿卡波糖比野生型(0.70g
·
l-1
)少约15％(图24d)。这表明，这些生产损失归因于缺失突变体中类胡萝卜素形成对资源的浪费(图24c)。总之，在光照条件下的产量损失(38-39％)可能是由缺失突变体和野生型两者中的进一步光诱导应激引起的。
[0550]
使用微阵列技术在黑暗和光照条件下培养的野生型的比较转录组分析显示影响各种基因的转录水平的复杂反应(参见图25)。几个差异表达的基因表明对抗氧化应激的细胞反应。氧化应激由活性氧簇(ros)引起，其是由能量转移(导致单线态氧)或电子转移(导致超氧化物、过氧化氢和羟基自由基)形成(ziegelhoffer和donohue 2009)。在高浓度下，ros是有毒的，并引起蛋白质和膜的氧化和dna损伤(ziegelhoffer和donohue 2009；gout 2019)。
[0551]
在se50/110中，酪氨酸酶melc(acsp50_4950，以前：acpl_5017)(一种光保护剂，其参与褐色色素真黑素的形成(wolf et al.2016))，且核黄素生物合成的基因(acsp50_6437-40)当暴露于光时转录更强(图25)。核黄素是在374和445nm处吸收的水溶性光氧化敏化剂(silva et al.1999；kim et al.1993)。其是黄素单核苷酸(fmn)和黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)的前体。这些是蛋白质的辅因子，其参与细胞氧化还原代谢、光感测、dna修复和进一步的功能(综述于garcia-angulo(2017))。由此，核黄素及其衍生物是重要的微量营养素，其使细胞能够克服氧化应激(chen等人，2013)。
[0552]
据此，当暴露于光时，几种黄素依赖性加氧酶也转录更强。其中之一被注释为牛磺酸双加氧酶，其底物是半胱氨酸的降解产物。含硫氨基酸如半胱氨酸属于低分子量硫醇(lmw硫醇)的组，其能够捕获ros并起氧化还原缓冲剂作用(gout 2019)。与此相对应，可能参与半胱氨酸和甲硫氨酸代谢和转运的其他基因在暴露于光的细胞中转录更强。
[0553]
值得注意的是，几种转录调节基因和编码σ因子sige的基因(acsp50_0558)也转录更强(图25)。sige与光合细菌球形红球菌(综述于ziegelhoffer和donohue(2009)中)中的氧化应激反应相关，并与相关物种天蓝色链霉菌(hutchings et al.2006)和谷氨酸棒杆菌(park et al.，2008)中的包膜应激反应相关。sige可能参与se50/110中的氧化应激反应。
[0554]
有趣的是，与避光的野生型相比，类胡萝卜素生物合成和调节子merr的基因在暴露于光的野生型中转录没有显著更强。这是值得注意的，因为在野生型中可以观察到光对类胡萝卜素形成的明显影响。由于类胡萝卜素合成在黑暗和光照下都发生，并且调节子突变体中相对转录物量的增加相当适度(参见上文)，因此对转录水平的影响可能不明显。据推测可能存在在蛋白质水平或代谢组水平上类胡萝卜素合成的进一步调节，例如通过类胡萝卜素裂解双加氧酶(acsp50_5522)降解类胡萝卜素或萜类化合物前体。然而，根据从野生型的微阵列获得的结果，crt基因表达似乎不是总体氧化应激反应的主要靶标，类似于来自球形红球菌的发现(综述于ziegelhoffer和donohue(2009)中)。
[0555]
总之，光照触发氧化应激反应，并且似乎对代谢资源朝向生长、类胡萝卜素和阿卡波糖形成的分布具有重要影响。类胡萝卜素生物合成的调节似乎与对氧化应激的整体反应解偶联，这需要进一步研究。考虑到将代谢通量引导向阿卡波糖的产生，期望的是将来获得
对这些过程的更好理解。σ因子sige可能负责氧化应激反应，因为其在暴露于光时转录更高。
[0556]
除了光应激之外，这项研究证实，大部分生产损失可以直接归属于类胡萝卜素形成。非光合细菌的类胡萝卜素被认为具有作为光保护剂的功能(lee和schmidt-dannert 2002)，因为它们已经显示出针对光动力学杀伤的保护(mathews和sistrom 1959)。由于光的影响可以通过简单的结构测量来排除，因此认为类胡萝卜素形成在实验室条件下是不必要的。为了改善阿卡波糖的产生，关闭同时发生的类胡萝卜素生物合成途径，例如通过缺失中心基因crti，可用于菌株开发。由于类胡萝卜素影响膜的流动性(gruszecki和strzalka 2005)，缺乏c40-类胡萝卜素也可以影响游动放线菌se50/110的表面和菌丝结构。关于生产，菌丝块的分解有利于增加菌丝体表面和生物化学上可用的细胞的数量。
[0557]
acbb和gtab的过表达
[0558]
测试表达载体psett4的基因acbb和gtab。两个基因acbb和gtab都可能参与氨基糖合成，氨基糖合成是阿卡波糖生物合成的进料分支：acbb催化dtdp-d-葡萄糖脱水为dtdp-4-酮-6-脱氧-d-葡萄糖，并且认为gtab参与前体葡萄糖-1p的供应。有趣的是，两种蛋白质在阿卡波糖生产者的细胞溶质中显示出蛋白质量增加。
[0559]
用于单基因过表达的psett4gap和psett4tip载体
[0560]
实施了一种新的克隆系统，其允许在游动放线菌属菌株如游动放线菌se50/110中容易地克隆和过表达单个基因。为此，将来自迟缓埃格特菌的基因gapdh的强启动子克隆到pset152-骨架中的lacz盒前面。基因lacz在lac-启动子的控制下转录，并且侧接限制性酶bsai的识别位点，其使得能够通过gibson assembly(gibson et al.2009)、限制性/连接克隆或golden gate克隆(engler et al.2008)由感兴趣的基因交换lacz。由于强表达需要强终止，因此在新表达系统的克隆位点之前和之后引入t4终止子。t4终止子已经成功地用于myronovskyi et al.(2011)开发的pgus克隆系统中。本文进行的pgus整合突变体的全轨道rnaseq分析显示，t4终止子有效阻断转录并防止从整合酶基因通读到感兴趣的基因中。如预实验所示，当经由pset152整合引入到游动放线菌se50/110中时，t4终止子对acb基因的转录没有任何副作用。
[0561]
此外，通过对来源于启动子筛选实验的富集的初级转录物文库进行测序，在反义方向上在感兴趣的基因后面鉴定出两个推定的启动子(图26)。在新的表达系统中除去这两个假启动子以防止反义转录。此外，在克隆位点后面以相反方向引入另外的(第三)t4终止子，以防止进一步推定的反义阅读。
[0562]
为了允许启动子序列的交换，引入ndei和kpni限制性位点。在本研究中，强gapdh-启动子被来自浅青紫链霉菌的中等-强tipa启动子交换。由此，表明可以容易地修饰该系统，例如针对放线菌目的其他物种进行调整。测试载体(命名为psett4gap和psett4tip)的基因acbb和gtab的强和中等强过表达。
[0563]
acbb的中等过表达引起阿卡波糖形成的改善
[0564]
dtdp-d-葡萄糖-4,6-脱水酶acbb似乎参与从d-葡萄糖-1p—阿卡波糖生物合成的进料途径产生活化的氨基糖(图1)：发现acbb-活性增加改善了修饰的前体的供应：简言之，基于本文别处所述的表达载体psett4建立两种过表达突变体。在这些突变体中，acbb在中等强tipa启动子或强gapdh启动子的控制下转录。如先前在(schaffert et al.，2019)中公
开的，使用天然启动子的表达载体不会导致acb基因簇的基因的显著过表达。因此，在pset152-和pset4-载体背景中使用天然启动子作为对照。监测在麦芽糖基础培养基中的两个摇瓶培养中的生长和阿卡波糖形成(图27)。
[0565]
与对照菌株相比，具有在异源tipa-启动子控制下转录的acbb的突变体显示出增强的阿卡波糖产生：在两个独立培养中，与空载体对照相比，产率系数增加至48.6％和51.9％(图28)。通过使用强gapdh-启动子，阿卡波糖产率系数略微增加(图28)。
[0566]
在psett4tip::acbb中，与空载体对照相比，磷酸化葡萄糖/半乳糖和udp-葡萄糖的标准化峰面积类似或甚至略微增加(图29)。因此，活化葡萄糖部分的供应似乎得到保证。在该突变体中，发现质量m/z＝545[m-h

]的量增加(图29，约41％)。不受理论的束缚，该中间体通过中等acbb过表达积累，例如使用psett4tip::acbb。
[0567]
在生长期开始时，观察到acbb的表达增强在预期范围内：通过使用gapdh-启动子(log2(倍数变化)＝6.54)，接着使用tipa启动子(log2(倍数变化)＝4.06)获得最强的过表达(图30)。天然启动子的使用不会导致acbb的相对转录物量的显著增加。这在pset152-和psett4-载体背景中进行了测试(图30)。acb基因簇的其他基因不受显著影响，如acba和acbv所示(图30)。唯一的例外是psett4tip::acbb中acba的转录丰度略高(log2(倍数变化)＝1.87)。
[0568]
值得注意的是，线性生长期中的转录分布与早期生长期不同：此处，通过使用gapdh-启动子仅达到转录量的加倍(log2(倍数变化)＝2.05)，而通过使用tipa-启动子，acbb的过表达得以维持，但程度较低(log2(倍数变化)＝3.33)(图30、图31)。
[0569]
在包括异源启动子的过表达突变体中，acbb的相对转录在psett4tip::acbb中在两次取样时间之间从4.06倍降低至3.33倍(log2(倍数变化))，并且在psett4gap::acbb中从6.54倍降低至2.05倍。认为尽管在这些突变体中染色体acbb拷贝的转录下调，但是载体拷贝的转录由异源启动子维持。不同取样时间的acbb转录的差异进一步表明，与psett4tip::acbb相比，在psett4gap::acbb中acb基因转录的下调分别发生得更强和更早。acbb(psett4gap::acbb和psett4tip::acbb)的过表达似乎在线性生长期期间减速。
[0570]
总之，尤其是在培养基中，通过使用tipa启动子过表达acbb似乎对阿卡波糖的生产有益，而通过使用gapdh-启动子的强过表达似乎对阿卡波糖的形成仅具有较小的影响。阿卡波糖形成的进一步改善可以通过改变acbb的表达水平来实现，例如通过使用来自启动子筛选的替代启动子或通过引入多个基因拷贝。
[0571]
总之，本研究证实acbb的中等过表达提高了阿卡波糖产率，可能是由于改善了氨基糖供应。通过acbb的中等过表达(例如通过使用tipa-启动子)，观察到对阿卡波糖产生的积极影响，在两个独立培养中产生多约50％的阿卡波糖。因此，通过单个acb基因的过表达实现了阿卡波糖生物合成的改善。
[0572]
gtab的中等过表达导致阿卡波糖形成的改善
[0573]
gtab被认为催化udp-葡萄糖和葡萄糖-1p相互转化。令人惊讶地发现，gtab的过表达触发阿卡波糖形成。不受理论的束缚，这可以通过改善前体葡萄糖-1p的分布来发生。如麦芽糖基础培养基中的摇瓶培养所示(图32)，引入psett4tip中的gtab过表达突变体的阿卡波糖的最终产率系数增加至8.56％。
[0574]
有趣的是，阿卡波糖形成在线性生长期后期至稳定生长期中特别地增加。在过表
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