HLA-F修饰的细胞和方法与流程

hla-f修饰的细胞和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年08月23日美国临时专利申请号63/069,141的优先权，其公开内容通过引用并入本文。
发明领域
3.本公开内容一般地涉及细胞生物学、免疫学和细胞移植疗法。特别地，本公开内容涉及用于基于外源性hla-f蛋白或其变体在待移植到对象中的供体细胞中的强制表达的细胞移植疗法的组合物和方法。


背景技术：

4.细胞移植疗法是患者接受供体细胞以替换受损细胞或通过供体细胞维持生物学功能的程序。细胞移植疗法的主要风险之一是移植细胞被受体的免疫系统排斥，特别是当供体细胞来自外来宿主时。为了降低移植排斥的风险，通常需要在供体和受体之间匹配经典的人白细胞抗原(hla)i类和ii类分子。然而，通常很难找到具有与受体完全匹配的hla分子类型的供体。尽管免疫抑制剂可以治疗或改善一定程度的移植排斥反应，但是免疫抑制剂的治疗往往会引起严重的不良反应。
5.已证明细胞移植疗法是治疗血癌等疑难病症的重大突破。两种使用嵌合抗原受体(car)设计的t细胞疗法——吉利德公司kite治疗非霍奇金淋巴瘤和b细胞急性淋巴细胞白血病的yescarta，诺华公司治疗非霍奇金淋巴瘤的kymriah——是2017年美国fda批准的首批细胞药物。然而，这两种获批的细胞疗法是自体细胞疗法：从患者提取治疗细胞，离体修饰，然后移植回同一患者体内，以避免供体细胞的免疫排斥。这种个性化的细胞疗法不仅成本高昂(kymriah每次治疗475,000美元，yescarta每次治疗373,000美元)而且耗时，这在某些情况下是生死攸关的。如果可以将供体细胞设计为低免疫原性，则这些细胞可以“现成的”用于同种异体移植给更多患者，其免疫排斥反应减少或没有免疫排斥反应。更重要的是，患者将获得及时的挽救生命的治疗，而无需等待细胞在移植前进行工程改造。因此，需要用于细胞移植疗法的新组合物和方法。


技术实现要素：

6.本公开内容在一个方面中提供了一种适于移植到有需要的对象中的基因修饰的哺乳动物细胞。在一些实施方式中，所述基因修饰的哺乳动物细胞包含编码在所述基因修饰的哺乳动物细胞的细胞表面上表达的hla-f蛋白或其变体的外源性核酸。在一些实施方式中，与相同类型但不具有所述外源性核酸的哺乳动物细胞相比，所述基因修饰的哺乳动物细胞具有降低的免疫原性和/或改善的免疫抑制。在一些实施方式中，所述基因修饰的哺乳动物细胞可以用作通用供体细胞，用于治疗各种类型的损伤或病症，例如，通过减少或消除供体细胞和受体之间匹配经典hla分子类型的要求。
7.在一些实施方式中，将所述hla-f蛋白表达为包含胞外区的嵌合hla-f蛋白，所述
胞外区包含hla-fα1结构域、hla-fα2结构域、hla-fα3结构域和β2m蛋白。在一些实施方式中，所述hla-fα1结构域具有seq id no:8的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。在一些实施方式中，所述hla-fα2结构域具有seq id no:9的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。在一些实施方式中，所述hla-fα1结构域具有seq id no:10或11的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。在一些实施方式中，所述β2m结构域具有seq id no:15的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
8.在一些实施方式中，所述hla-fα3结构域与所述β2m蛋白通过接头连接。在一些实施方式中，所述接头具有seq id no:16的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。在一些实施方式中，所述嵌合hla-f蛋白的胞外区具有seq id no:20或21的氨基酸序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
9.在一些实施方式中，所述嵌合hla-f蛋白还包含跨膜结构域。在一些实施方式中，所述跨膜结构域具有seq id no:12的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
10.在一些实施方式中，所述嵌合hla-f蛋白还包含胞质结构域。在一些实施方式中，所述胞质结构域具有seq id no:13或14的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
11.在一些实施方式中，所述修饰的哺乳动物细胞是人细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、猴细胞或猪细胞。在一些实施方式中，所述修饰的哺乳动物细胞是干细胞/祖细胞。在一些实施方式中，所述经修饰的哺乳动物细胞是胚胎干细胞或诱导的多能干细胞(ips细胞)。在一些实施方式中，所述经修饰的哺乳动物细胞是完全分化的细胞。在一些实施方式中，所述经修饰的哺乳动物细胞是从干细胞/祖细胞分化的完全分化的细胞(例如，ips细胞)。在一些实施方式中，所述经修饰的哺乳动物细胞是t细胞或nk细胞。
12.在一些实施方式中，所述基因修饰的哺乳动物细胞还包含编码hla-g蛋白的外源性核酸。在一些实施方式中，所述hla-g蛋白是包含胞外区的嵌合hla-g蛋白，所述胞外区包含hla-gα1结构域、hla-gα2结构域、hla-gα3结构域和β-2微球蛋白(β2m)蛋白。在一些实施方式中，所述hla-gα1结构域具有seq id no:24的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。在一些实施方式中，所述hla-gα2具有seq id no:25的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。在一些实施方式中，所述hla-gα1结构域具有seq id no:26的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
13.在一些实施方式中，所述hla-gα3结构域与所述β2m蛋白通过接头连接。在一些实施方式中，所述接头具有seq id no:16的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
14.在一些实施方式中，所述嵌合hla-g蛋白还包含跨膜结构域。在一些实施方式中，所述跨膜结构域具有seq id no:27的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
15.在一些实施方式中，所述嵌合hla-g蛋白还包含胞质结构域。在一些实施方式中，所述胞质结构域具有seq id no:28的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
16.在一些实施方式中，所述嵌合hla-g蛋白具有seq id no:29的氨基酸序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
17.在一些实施方式中，所述基因修饰的哺乳动物细胞还包含编码cd95l的外源性核酸。在一些实施方式中，所述cd95l具有seq id no:31的氨基酸序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
18.在一些实施方式中，所述经修饰的哺乳动物细胞还包含嵌合抗原受体(car)。在一些实施方式中，所述修饰的哺乳动物细胞是car-t细胞或car-nk细胞。在一些实施方式中，所述car-t细胞或所述car-nk细胞是从ips细胞分化的。
19.在一些实施方式中，所述hla-f蛋白或其变体由基因修饰的哺乳动物细胞表达至少5、6、7、8、10、15、20、25或50周。
20.在一些实施方式中，与不具有所述外源性核酸的所述哺乳动物细胞相比，所述基因修饰的哺乳动物细胞具有降低的免疫原性和/或改善的免疫抑制是通过nk细胞细胞毒性分析确定的。
21.在另一个方面中，本公开内容提供了一种细胞移植疗法。在一些实施方式中，所述方法包括向有需要的对象注射、植入或移植细胞或组织的组合物，所述组合物包含一群基因修饰的细胞，其中所述基因修饰的细胞包含编码在所述基因修饰的细胞的所述细胞表面上表达的hla-f蛋白的外源性核酸。在一些实施方式中，所述hla-f蛋白表达为嵌合hla-f蛋白，其包含hla-fα1结构域、hla-fα2结构域、hla-fα3结构域和β2m蛋白。在一些实施方式中，与所述基因修饰的细胞相比，对象具有至少一个错配的经典hla i类或hla ii类分子。在一些实施方式中，与没有所述外源性核酸的相同类型的细胞相比，基因修饰的细胞群表现出降低的免疫原性和/或改善的免疫抑制。
22.在一些实施方式中，至少一个错配的经典hla i类或hla ii类分子选自以下：hla-a、hla-b、hla-c、hla-dp、hla-dq和hla-dr。
23.在一些实施方式中，所述降低的免疫原性和/或改善的免疫抑制是通过nk细胞细胞毒性分析确定的。
24.在一些实施方式中，基因修饰的细胞群是在体外从干细胞/祖细胞(例如，胚胎干细胞或ips细胞)分化的。在一些实施方式中，基因修饰的细胞群是t细胞或nk细胞。在一些实施方式中，基因修饰的细胞群是car-t细胞或car-nk细胞。
25.在一些实施方式中，所述基因修饰的细胞群不被所述对象的免疫系统排斥至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、36、48或52周。
附图说明
26.并入本文的附图构成说明书的一部分。连同该书面描述，附图进一步用于解释本公开内容的原理，并使相关领域的技术人员能够做出和使用本公开内容。
27.图1是说明涉及免疫识别和对同种异体移植物反应的先天性和适应性免疫调节途径的示意图。
28.图2是说明hla分子在同种异体移植细胞上的相互作用，以及其各自在受体的免疫细胞(例如，nk细胞和t细胞)上的潜在受体/配偶体的相互作用的示意图。
29.图3是说明hla-f分子的肽呈递模式的示意图。肽结合的hla-f和空的hla-f开放构象(oc)分子被nk细胞上的不同受体识别。
30.图4是说明hla-f分子与免疫细胞如nk细胞上的不同受体组相互作用的示意图。hla-f分子可以有不同的构象形式，形成不同的复合物，可以与免疫细胞上的激活受体和抑制受体相互作用。
31.图5是hla-f-β2m融合蛋白结构的示意图。图5a显示了与β2m非共价结合的hla-f异二聚体。图5b显示了通过15个氨基酸接头与β2m融合的hla-f。图5c显示了hla-f-β2m融合蛋白的设计，该融合蛋白包含hla-fα1结构域、hla-fα2结构域、hla-fα3结构域，其通过15个氨基酸接头与β2m蛋白连接，随后是跨膜结构域和胞质结构域。图5d显示了
32.图6说明了hke293细胞中外源性嵌合hla-f蛋白的表达降低了nk细胞介导的细胞毒性。
33.图7说明了在targtt主ipsc细胞系中产生位点特异性基因插入的示意图。在ast-3070供体质粒的mcs(多克隆位点)处克隆转基因，并与ast-3071整合酶质粒共转染。在attp和attb之间重组后，转基因插入h11基因座。
34.图8说明了位点特异性cag-mcs整合的确认。图8a显示了在位点特异性基因插入后包含基因分型引物的基因组区域。图8b显示了在5’和3’连接处使用2组引物的pcr凝胶电泳，提示位点特异性基因插入带，575bp和848bp。图8c显示了基因分型结果。
35.图9说明了经修饰的ipsc细胞系的示意性设计。细胞系一包含hla-f-β2m和hla-g-β2m；和细胞系二包含hla-f-β2m、hla-g-β2m和cd95l。
36.图10说明了cd19car-ink的示意性设计。使用bxb1整合酶，表达cd19car和il-15的供体质粒上的attb位点与ipsc基因组中的bxb1 attp位点重组。这导致用cd19car-il15表达盒替代gfp报告表达盒。*in attp*和attb*表示不同核心序列形成attp和attb，以控制定向重组。
37.图11说明了hla-f的过表达在ipsc中具有免疫抑制活性。使用表达hla-f-β2m(hla-fb)的ipsc进行了类似的nk介导的毒性分析，但使用cd56 nk细胞代替pbmc作为效应细胞。使用了几种比例，包括1:1、2:1和4:1的效应物(nk细胞)与靶细胞(ipsc)。每组包含3个样品。效应物:目标物＝2:1的比率显示细胞死亡率从59％降低到39％，“p”值为0.0231，表明对hla-fb表达的免疫保护具有统计学显著性。
具体实施方式
38.在更详细地描述本公开内容之前，应当理解，本公开内容不限于所描述的特定实施方式，并且因此当然可以变化。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并不旨在限制，因为本公开内容的范围将仅由所附权利要求限制。
39.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管在本公开内容的实施或测试中也可以使用与本文所述的那些相似或等效的任何方法和材料，但是现在描述优选的方法和材料。
40.在本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，就如同每个单独的
出版物或专利都被明确地和单独地指示为通过引用并入本文并且通过引用并入本文以公开和描述与引用出版物相关的方法和/或材料。任何出版物的引用是针对其在申请日之前的公开内容，不应被解释为承认本公开内容无权因在先公内容开而早于此类出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，可能需要单独确认。
41.本领域技术人员在阅读本公开内容后将意识到，本文描述和说明的各个实施方式中的每一个都具有分立的组分和特征，在不脱离本公开内容的范围或精神的情况下，其可以容易地与其他几个实施方式中的任一个的特征分离或组合。任何叙述的方法都可以按照所叙述的事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序来执行。
42.定义
43.提供以下定义以帮助读者。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术术语、符号和其他科学或医学术语(term)或术语(terminology)旨在具有生物学和医学领域技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清楚和/或便于参考，本文定义了具有普遍理解含义的术语，并且本文中包含的此类定义不应被解释为与本领域通常理解的术语定义存在实质性差异。
44.如本文所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式的“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数引用。
[0045]“抗原”指引起免疫应答的分子。这种免疫应答可以是体液或细胞介导的应答，或者两者兼而有之。本领域技术人员将理解任何大分子，包括几乎所有的蛋白或肽，都可以用作抗原。很明显，本公开内容包括作为抗原引发免疫应答的自身抗原。
[0046]“同种异体”细胞指源自同一物种的不同对象的任何细胞。
[0047]
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“car”指人工构建的杂合蛋白或多肽，其包含与结构域或信号转导(例如，t细胞信号转导或t细胞激活结构域)连接的抗体的抗原结合结构域(例如，单链可变片段(scfv))，其激活免疫细胞，例如，t细胞或nk细胞(参见，例如，kershaw等，同上，eshhar等，proc.natl.acad.sci.usa,90(2):720-724(1993)，以及sadelain等，curr.opin.immunol.21(2):215-223(2009))。car能够利用单克隆抗体的抗原结合性质，以非mhc限制的方式将免疫细胞特异性和反应性重定向到选定的靶点。非mhc限制性抗原识别使表达car的免疫细胞能够独立于抗原加工识别抗原，从而绕过肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在t细胞中表达时，car有利地不会与内源性t细胞受体(tcr)α和β链二聚化。
[0048]“hla”或“人白细胞抗原”是指一组由人体主要组织相容性复合物(mhc)基因复合物编码的相关蛋白，负责调控免疫系统。hla基因可分为i类基因和ii类基因。hla i类基因包括三个主要基因，即，hla-a、hla-b和hla-c，以及三个次要基因，即，hla-e、hla-f和hla-g基因。β2m蛋白与主要和次要i类hla蛋白结合产生异二聚体。hla ii类基因包括三个主要基因，即，hla-dp、hla-dq和hla-dr基因，以及两个次要基因，即，hla-dm和hla-do基因。ii类hla蛋白结合形成异二聚体(αβ)蛋白受体，通常在抗原呈递细胞表面表达。
[0049]
在多肽或多核苷酸的情况下，“同一性”或“序列同一性”的百分比是通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列来确定的，其中与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可以包含添加或缺失(即，空位)以用于两条序列的最佳比对。百分比通过确定两条序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数来计算以
产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数，然后将结果乘以100，得到序列同一性的百分比。
[0050]“可操作地连接”指两个或更多个多核苷酸序列之间的功能关系。在编码蛋白(如本公开内容的hla-f蛋白的多肽连)的多核苷酸的上下文中，该术语是指两个或更多个多核苷酸序列连接在一起，使得由这些区段编码的氨基酸序列保持在阅读框架内。在转录或翻译调控的上下文中，该术语指调控序列与编码序列的功能关系，例如，在编码序列的正确位置和方向上的启动子以调控转录。
[0051]“免疫原性”或“免疫原的”指外来物质如抗原在对象体内引发免疫应答的能力。免疫原性应答通常包括细胞介导的和抗体介导的免疫应答。
[0052]“多核苷酸”或“核酸”指核苷酸的链。如本文所用，多核苷酸包括通过本领域可用的任何方式获得的所有多核苷酸序列，包括但不限于重组方式和合成方式。
[0053]“多肽”和“蛋白”可以互换使用，是指通过肽键共价连接的氨基酸残基链。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
[0054]“t细胞受体”或“tcr”指t细胞表面的蛋白复合物，负责将抗原片段识别为与mhc分子结合的肽。
[0055]“治疗有效量”或“有效量”是指如本文所述的细胞、组合物、制剂或任何材料有效实现所需生物学结果的量。这样的结果可以包括但不限于替代受损细胞、允许改善对象的整体状况以及刺激组织再生或修复。
[0056]
如本文所用，蛋白(例如，hla-f)的“变体”指具有与其衍生变体的亲本蛋白不同的氨基酸序列但保持作为亲本蛋白的生物学功能的蛋白。变体的实例包括但不限于包含亲本蛋白的融合蛋白和亲本蛋白的突变体。在一些实施方式中，变体与亲本蛋白具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列，或者具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基不同于亲本蛋白的序列。
[0057]“载体”指可以将多核苷酸可操作地插入其中以递送、复制或表达多核苷酸的载剂。载体可以包含多种调控元件，包括但不限于复制原点、启动子、转录起始序列、增强子、选择标记基因和报告基因。载体还可以包括有助于其进入宿主细胞的材料，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或者离子或两亲性化合物。
[0058]
需要注意的是，在本公开内容中，诸如“包含(comprises)”、“包含(comprised)”、“包含(comprising)”、“包含(contains)”、“包含(containing)”的术语具有美国专利法中赋予的含义；其是包容性或开放式的，不排除额外的、未列举的要素或方法步骤。“基本上由
……
组成(consisting essentially of)”和“基本上由
……
组成(consists essentially of)”等术语具有美国专利法中赋予的含义；其允许包含不会对要求保护的发明的本质和新颖特征产生实质性影响的其他成分或步骤。术语“由
……
组成(consists of)”和“由
……
组成(consisting of)”具有美国专利法赋予其的含义；即这些条款是封闭式的。
[0059]
基因修饰的细胞
[0060]
细胞移植疗法是一种很有前景的治疗方法，可用于治疗多种顽固性疾病或病症，如癌症、糖尿病、心脏病和神经退行性疾病。阻止细胞移植疗法在临床上实施的主要障碍之一是供体细胞的免疫排斥。同种异体细胞和组织移植的主要免疫障碍是高度多态性人类白
细胞抗原(hla)基因的表达，包括hla i类和ii类。hla i类抗原的功能涉及将抗原呈递给t细胞并作为在自然杀伤(nk)细胞、t细胞和髓细胞上表达的一组免疫受体的配体(boudreau je&hsu kc 2018；pecht i 2018.)。hla i类分子通过将肽抗原呈递给cd8 t细胞，在同种异体排斥中发挥核心作用。hla i类分子的异二聚体结构是一个共同的β2微球蛋白(β2m)亚基与不同的重链分子配对。hla i类家族可以进一步分为经典hla-ia，包括hla-a、-b和-c分子，以及非经典抗原hla-ib，包括hla-e、-f和-g分子。与在所有有核细胞上表达的高度多态性hla-ia抗原相比，hla-ib分子的特征在于特定的组织定位、低遗传多样性、有限的肽库和功能性质(persson等，2017)。下调hla i类分子的细胞可以被nk细胞检测和消除，当nk细胞上的抑制性受体(如cd94/nkg2a)未能与hla i类分子结合时，就会启动(bix等，1991；liao等，1991)。
[0061]
为了避免或最小化移植排斥，通常需要在供体和受体之间匹配经典hla i类和ii类分子的类型。然而，寻找具有与受体匹配的hla分子类型的供体通常很困难。
[0062]
本公开内容部分地基于以下发现，可以通过设计单个hla工程化ipsc(诱导多能干细胞)或esc(胚胎干细胞)系来规避对自体或仔细匹配患者的细胞系的需求，这些细胞系可以逃避同种异体反应和nk细胞的裂解。诱导多能干细胞(ipsc)具有分化为人体所有细胞类型的潜力。在一些实施方式中，通用供体细胞是通过工程化单个hla分子产生的低免疫原性ipsc。在一些实施方式中，ipscs可以通过设计一个着陆垫来修饰，以便将来插入基因。这些通用的可修饰ips细胞(um-ipsc)然后可以分化为特定的细胞类型并提供现成的细胞药物。
[0063]
因此，本公开内容在一个方面中提供了通过减少或消除在供体细胞和受体之间匹配经典hla分子类型的要求，适合用作通用供体细胞的基因修饰的哺乳动物细胞。在一些实施方式中，基因修饰的哺乳动物细胞表达特定的非多态性hla i类分子，如ib类分子hla-e、hla-f、hla-g及其变体，其能够抑制nk细胞介导的裂解而不刺激同种异体反应。hla-e与其他hla i类蛋白的信号序列结合并呈递肽，是cd94/nkg2a受体的配体(lee等，1998；braud等，1998)。gornalusse等，(2017)表明，在人类psc(多能干细胞)中强制表达最小多态性hla-e分子(之前已消除所有i类分子的表面表达)赋予这些细胞及其分化变体低免疫原性。这些hla-e工程化细胞不被cd8 t细胞识别为同种异体，不结合抗hla抗体，并且对nk介导的裂解具有抗性。他们的研究为细胞移植疗法提供了通用细胞的潜在来源。hla-g通常在不表达hla-a、b或c的胎盘细胞滋养层表面表达，其通过与抑制性受体kir2dl4和ilt2相互作用来保护这些细胞免受nk细胞介导的裂解(narvarro等，1999；pazmany等，1996；rajagopalan&long 1999)。美国专利号9714280表明hla-g在人类esc中的过表达持续为细胞提供了降低免疫原性和/或改善免疫抑制的特征，以使得这些细胞有望成为用于移植、细胞和组织再生或重建的通用或改进的供体细胞。
[0064]
对hla-f的功能知之甚少。自1990年geraghty及其同事(geraghty等，1990)发现hla-f以来，仅获得了少量关于其临床相关性的证据(kochan等，2013)。例如，已观察到hla-f的遗传变体和蛋白表达与不同类型疾病有关，如癌症(wu等，2017；tang等，2012；zhang等，2013)、感染(laaribi等，2018；lunemann等，2018)、生殖和自身免疫性病症(shobu等，2006；hackmon等，2017；santos等，2018；afroz等，2017)。在癌症病灶和外周血中发现了hla-f表达升高，这与癌症患者的不良生存期有关(zhang等，2013；wu等，2018)。hla-f被认为是妊娠期(burrows等，2016)和外周神经系统中的保护分子，其中抑制性kir3dl2识别hla-f可防止
肌萎缩侧索硬化症(als)进展中的运动神经元死亡(song等，2016)。
[0065]
在一些实施方式中，基因修饰的哺乳动物细胞包含编码hla-f蛋白的外源性核酸。在一些实施方式中，hla-f蛋白表达为嵌合蛋白，其包含hla-fα1结构域、hla-fα2结构域、hla-fα3结构域和β2m蛋白。在一些实施方式中，与没有所述外源性核酸的相同类型的哺乳动物细胞相比，所述基因修饰的哺乳动物细胞具有降低的免疫原性和/或改善的免疫抑制。
[0066]
hla-f和嵌合hla-f蛋白
[0067]
hla-f属于非经典i类hla重链分子。i类hla(或mhc-i)分子通过在细胞表面结合和展示自身和非自身肽而发挥作用，其将细胞标记为健康、感染或外来细胞。白细胞(如t细胞和nk细胞)通过多样化的抗原受体感知hla i类分子提供的信息，从而引发适当的免疫应答。尽管经典的i类hla分子(hla-a、hla-b和hla-c)普遍表达，但非经典的i类hla分子(hla-e、hla-f和hl-g)在组织定位、抗原呈递和功能方面更加特化。由于其多态性水平有限，非经典i类hla分子存在的肽库大大减少，其主要通过tcr(t细胞受体)非依赖性相互作用调节免疫。仅在一部分细胞膜中观察到hla-f，主要是b细胞和活化的淋巴细胞。因此，有人提出其作用涉及与在活化细胞的细胞膜中变得可用的特殊配体的结合。例如，hla-f可以作为ilt2和ilt4的肽结合剂。
[0068]
与其他hla家族成员类似，hla-f分子显然可以与免疫细胞(如nk细胞)上的激活和抑制受体相互作用，并且可以向t细胞呈递多种肽(goodridge等，2013；leptin等，2000；dulberger等，2017)。hla-f的晶体结构揭示了一种独特的肽呈递模式(dulberger等，2017)。在这种情况下，已经观察到hla-f分子的开放构象异构体(oc)直接与nk细胞上的免疫抑制受体(kir3dl1/2和ilt2)和免疫激活受体(kir2ds4和kir3ds1)结合(leptin等，2000；burian等，2016)。此外，根据肽结合的hla-f或hla-f oc的分子构象，hla-f已被证明可将肽呈递给t细胞并通过与不同nk细胞受体的相互作用来调节免疫(图3)。事实上，nk受体(nkr)区分肽结合和无肽(或oc)hla-f。载有肽的2m-hla-f而不是oc的复杂结构与抑制性lir1结合(图3)。这些重要发现提供了新的证据，证明hla-f在人类生理和病理条件下是一种重要的免疫调节分子(sim和sun 2017；vely等，2016)。
[0069]
免疫调节是一个复杂的过程，除了hla分子外，免疫识别和对同种异体移植物的反应还涉及很多因素。同种异体细胞的排斥涉及先天免疫细胞，如巨噬细胞和nk细胞，以及适应性免疫细胞，如cd4 和cd8 t细胞和b细胞(图1)(lanza等，2019)。先天性免疫细胞可以快速攻击同种异体细胞，而适应性免疫细胞在迁移到移植部位之前在外周淋巴器官中进行初眠和扩增。先天性和适应性免疫细胞都使用多种细胞毒性机制原位排斥同种异体细胞。自然界中发现的免疫隐藏策略使用特定的免疫调节因子来抑制这些途径并逃避排斥。非多态性hla i类分子如hla-e、f和g可以抑制nk细胞活性和免疫检查点分子，如程序性细胞死亡1配体1(pd-l1)，以及诱导凋亡的肿瘤坏死因子家族成员fasl(cd95)可以抑制或杀死cd4 和cd8 淋巴细胞。serpinb9等胞内分子是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂(spi6小鼠基因的人类直系同源物)，可以抑制颗粒酶b，而ccl21等趋化因子可以破坏树突状细胞(dc)的迁移并抑制其引发适应性免疫的能力。乳脂肪球egf-因子8(mfge8)和表面分子cd47(也称为整合素相关蛋白)和膜糖蛋白cd200等分子可以抑制单核细胞和巨噬细胞对细胞的吞噬作用，并削弱单核细胞和巨噬细胞产生促炎性分子的能力。抑制几种免疫原性途径的组合可能会改善同种异体移植。
[0070]
hla-f被认为是妊娠期(burrows等，plos genetics,2016)和周围神经系统的保护分子，其中抑制性kir3dl2识别hla-f可防止肌萎缩侧索硬化症(als)发展中的运动神经元死亡(song等，nat med,2016)。还表明，通过激活nk细胞上的kir3ds1识别hla-f会引发抑制hiv-r复制的抗病毒反应(garcia-beltran等，nat immunol.2016)。
[0071]
在i类hla家族中，有十个保守残基对于建立与所呈递的肽残基进行特定相互作用的结构至关重要。这十个残基中有五个在hla-f沟槽内发生了改变。有人提出hla-f可以多种亚型存在，具有不同的肽结合和抗原受体识别潜力。hla-f的晶体结构表明hla-f可以作为开放构象异构体(oc)和真正的肽呈递mhc分子存在。肽结合的hla-f和空hla-f oc被不同nk细胞受体识别(dulberger等，immunity,2018)。
[0072]
如本文所用，在基因修饰细胞中外源性表达的hla-f蛋白可以是天然存在的hla-f蛋白或由天然存在的hla-f蛋白修饰的工程化hla-f蛋白。
[0073]
天然存在的hla-f从n末端到c末端包含：hla-fα1结构域、hla-fα2结构域、hla-fα3结构域、跨膜结构域和胞质结构域。hla-fα1结构域和hla-fα2结构域形成肽结合沟槽。hla-fα3结构域与β-2微球蛋白结合，这是hla-f复合物稳定性所必需的。在一些实施方式中，天然存在的hla-f蛋白具有seq id no:1、2、3或4的氨基酸序列。在一些实施方式中，hla-f蛋白是由seq id no:5的多核苷酸序列编码的。
[0074]
在一些实施方式中，hla-f蛋白是嵌合蛋白。如本文所用，嵌合hla-f蛋白是指由hla-f修饰的蛋白，其中第二多肽(i)融合或插入hla-f蛋白或(ii)替换hla-f蛋白的氨基酸区域。在一些实施方式中，嵌合hla-f蛋白包含胞外区，其包含hla-fα1结构域、hla-fα2结构域、hla-fα3结构域和β2m蛋白。在一些实施方式中，hla-fα1结构域具有seq id no:8的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列，或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。在一些实施方式中，hla-fα2结构域具有seq id no:9的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列，或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。在一些实施方式中，hla-fα3结构域具有seq id no:10或11的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列，或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。在一些实施方式中，β2m蛋白具有seq id no:15的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列，或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。
[0075]
在一些实施方式中，hla-fα3结构域和β2m蛋白通过接头连接。在一些实施方式中，接头包含长度在2到20个氨基酸残基之间的甘氨酸-丝氨酸(gs)双联体。示例性的接头包含(g4s)3。
[0076]
在一些实施方式中，嵌合hla-f蛋白的胞外区具有seq id no:20或21的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。
[0077]
在一些实施方式中，嵌合hla-f蛋白还包含跨膜结构域。在一些实施方式中，嵌合hla-f蛋白的跨膜结果与是天然存在的hla-f蛋白的跨膜结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域具有seq id no:12的序列，或者与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。可以理解，本文所述的嵌合hla-f蛋白的跨膜结构域可以来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白，包括但不限于baffr、blame(slamf8)、cd2、cd3ε、cd4、cd5、cd8、cd9、cd11a(cd18、itgal、lfa-l)、cd11b、cd11c、cd11d、cd16、cd19、cd22、cd27、cd28、cd29、cd33、cd37、cd40、
cd45、cd49a、cd49d、cd49f、cd64、cd80、cd84、cd86、cd96(tactile)、cd100(sema4d)、cd103、cd134、cd137(4-1bb)、cd150(ipo-3、slamf1、slam)、cd154、cd160(by55)、cd162(selplg)、cd226(dnam1)、cd229(ly9)、cd244(2b4、slamf4)、cd278(icos)、ceacam1、crt am、gitr、hyem(lightr)、ia4、il2rβ、il2rγ、il7r a、itga1、itga4、itga6、itgad、itgae、itgam、itgax、itgb1、itgb2、itgb7、kir、ltbr、ox40、nkg2c、nkg2d、nkp30、nkp44、nkp46、nkp80(klrf1)、pag/cbp、psgl1、slamf6(ntb-a、ly108)、slamf7、t细胞受体的α、β或ζ链、tnfr2、vla1和vla-6。在某些实施方式中，本文所述的嵌合hla-f蛋白的跨膜结构域是合成的，例如，主要包含疏水残基，如亮氨酸和缬氨酸。
[0078]
在一些实施方式中，嵌合hla-f蛋白还包含胞质结构域。在一些实施方式中，本文所述的嵌合hla-f蛋白的胞质结构域是天然存在的hla-f蛋白的胞质结构域。在一些实施方式中，胞质结构域具有seq id no:13或14的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。
[0079]
在一些实施方式中，嵌合hla-f蛋白从n末端到c末端包含：hla-fα1结构域、hla-fα2结构域、hla-fα3结构域、接头、β2m蛋白、跨膜结构域和胞内域。在某些实施方式中，嵌合hla-f蛋白具有seq id no:17或18的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。在一些实施方式中，嵌合hla-f蛋白由seq id no:19的多核苷酸序列编码，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。
[0080]
表达hla-f的基因修饰的细胞
[0081]
如本文所公开的，可以产生多种表达本文所述hla-f蛋白的哺乳动物细胞。可用于此类修饰的细胞类型包括但不限于全能细胞、胚胎干细胞(例如，人胚胎干细胞)和分化细胞、诱导多能干细胞(ips细胞)和分化细胞、多能干细胞、表皮祖细胞，间充质干细胞，胰腺β细胞祖细胞，胰腺β细胞，心脏祖细胞，心肌细胞，肝祖细胞，肝细胞，肌肉细胞祖细胞，肌肉细胞，肾细胞，成骨细胞，造血祖细胞，牙囊细胞，毛囊细胞，视网膜色素上皮细胞、神经干细胞、神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞、内耳细胞和成纤维细胞(例如，真皮成纤维细胞)。在一些实施方式中，转基因细胞是具有免疫系统细胞类型的细胞，如淋巴细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞和树突细胞。此类哺乳动物细胞可以来自若干物种之一，包括，例如，人、小鼠、大鼠、猴或猪。本质上，可以修饰任何细胞类型以表达外源性hla-f蛋白或其变体，与不表达外源性hla-f蛋白或其变体的同类型哺乳动物细胞相比，其具有降低的免疫原性和/或改善的免疫抑制。
[0082]
在一些实施方式中，为获得表达外源hla-f或其变体的所需细胞类型的基因修饰细胞的显着富集群体，产生表达hla-f或其变体的基因修饰的多能干细胞系，如人胚胎干细胞系，或人诱导的多能干细胞系，或者具有多能性状的任何细胞系，包括间充质干细胞和免疫系统祖细胞，然后进行定向分化以获得表达hla-f或其变体并且基本上富集所需细胞类型的细胞群。在一些实施方式中，基本上富集的细胞群包含至少约2％至约100％的所需细胞类型，例如，至少约3％、4％、5％、7％、8％、10％、20％、22％、25％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、75％、80％、85％，或者从至少约2％至约100％的所需细胞类型的其他百分比。用于富集所需细胞类型的细胞的方法是本领域公知的。参见，例如，hantash的美国专利号8,647,871。
[0083]
用于获得人胚胎干细胞或诱导多能干细胞的方法是本领域公知的，如在例如美国
专利号6,200,806和7,217,569(用于人胚胎干细胞衍生)以及8,048,999、8,058,065和8,048,675(用于产生人诱导的多能干细胞)中描述的。
[0084]
可以通过本领域公知的多种方法中的任何一种产生基因修饰的哺乳动物细胞(例如，多能或专能干细胞系)以及完全分化的哺乳动物细胞，其稳定表达由外源性核酸编码的hla-f蛋白。
[0085]
在一些实施方式中，可以通过用一种或多种核酸表达载体稳定转染产生基因修饰的细胞，所述核酸表达载体包含编码本文所述的hla-f蛋白或其变体的核酸。可以将编码hla-f蛋白或其变体的核酸插入本领域公知的不同类型的载体中，例如，质粒、噬菌粒、噬菌体变体、动物病毒来源的病毒载体、粘粒、转座子、定点插入载体(例如，crispr、锌指核酸酶、talen)或自杀表达载体。在一些实施方式中，载体是dna或rna。
[0086]
在一些实施方式中，在用于表达hla-f或其变体的载体中，将编码hla-f蛋白或其变体的核酸可操作地连接至至少一个调控多核苷酸元件。典型的载体包含各种调控多核苷酸元件，例如，调控插入的核酸表达的元件(例如，转录和翻译终止子、起始序列和启动子)，调控在宿主细胞中载体复制的元件(例如，复制原点)和调控载体整合至宿主基因组的元件(例如，转座子的末端重复序列)。
[0087]
hla-f的表达可以通过将编码hla-f的核酸可操作地连接至启动子，并将构建体掺入载体中来实现。适宜的启动子包括但不限于中国仓鼠延伸因子-1α(chef-1α)启动子(参见running deer等，(2004),biotechnol.prog.,20:880-889；和genbank登录号ay 188393.1)、小鼠干细胞病毒(mscv)启动子的m-u3/r-变体启动子(如在swindle等(2004),j biol chem,279:34-41中所描述的)、磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子、人β-肌动蛋白启动子、泛素c启动子、cmv启动子、sv40启动子和mmtv启动子。
[0088]
在一些实施方式中，用于驱动外源hla-f转基因表达的启动子在一种或多种所需细胞类型中的表达水平高于其他细胞类型。本领域普通技术人员将理解，例如，当hla-f修饰的干细胞要分化成特定细胞类型时，选择在该特定细胞类型中具有活性或甚至对该特定细胞类型具有选择性的启动子可能是有利的。例如，对于给定的组织或细胞类型选择性启动子，与另一种细胞类型相比，所需细胞类型中的表达水平可以高约2倍至100倍，例如，约3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、70倍、80倍、90倍，或者与另一种细胞类型相比，在所需细胞类型中的表达水平高出另一种。组织和/或细胞类型选择性启动子的实例包括但不限于以下启动子：神经元特异性烯醇化酶(神经元)、突触蛋白(神经元)、camkii(前脑神经元)、hb9(运动神经元)和多巴胺转运蛋白(多巴胺能神经元)；胶质纤维酸性蛋白(星形胶质细胞)；白蛋白(肝脏)；a-肌球蛋白重链(a-mhc-心肌细胞)；神经原素3和胰-十二指肠同源盒1(胰腺)；角蛋白14(皮肤)；和bestrophinl(视网膜色素上皮)。
[0089]
为评估hla-f蛋白的表达，载体还可以包含选择标记基因或报告基因或者这两者，用于鉴定和选择引入载体的细胞。由此类载体编码的适宜的选择标记的实例包括赋予选择剂抗性的蛋白。此类蛋白及其相应的选择剂包括但不限于嘌呤霉素n-乙酰转移酶(嘌呤霉素)、潮霉素磷酸转移酶(潮霉素)、杀稻瘟菌素-s-脱氨酶(杀稻瘟菌素)和新霉素磷酸转移酶(新霉素)。有用的报告基因包括例如荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因。
[0090]
在一些实施方式中，载体是病毒载体。病毒载体可以衍生自例如逆转录病毒、腺病
毒、腺相关病毒(aav)、疱疹病毒和慢病毒。有用的病毒载体通常包含在至少一种生物体中具有功能的复制原点、启动子、限制性核酸内切酶位点和一种或多种选择标记。在一些实施方式中，载体是逆转录病毒载体，如慢病毒载体。慢病毒载体对于将编码hla-f的多核苷酸长期、稳定地整合到非增殖细胞的基因组中特别有用，这导致hla-f蛋白在转基因细胞中的稳定表达。
[0091]
在一些实施方式中，载体是基于转座子的表达载体。转座子是可以改变其在基因组中的位置的dna序列。在转座子系统中，编码hla-f的核酸的侧翼是末端重复序列，该末端重复序列可由介导转座子运动的转座酶识别。转座酶可以作为蛋白共同递送，在与hla-f相同的载体上编码，或在单独的载体上编码。转座子系统的非限制性实例包括睡美人(sleeping beauty)、piggyback、青蛙王子(frog prince)和白马王子(prince charming)。
[0092]
在一些实施方式中，载体是基于重组酶或整合酶的表达载体。重组酶或整合酶是一种高度特化的酶，可促进特定靶位点之间的dna重排(greindley等，2006；esposito,d.和scocca,j.j.nucleic acids research(1997)25,3605-3614；nunes-duby,s.e.,等，nucleic acids research(1998)26,391-406；stark,w.m.等，trends in genetics(1992)8,432-439)。在重组酶或整合酶系统中，编码hla-f或其变体的核酸与第一重组酶识别位点可操作地连接，其促进第一重组酶识别位点和第二重组酶识别位点在插入编码hla-f或其变体的核酸的靶基因座之间的重组。重组酶或整合酶可以作为蛋白或mrna共同递送，在与hla-f相同的载体上编码，或在单独的载体上编码。重组酶/整合酶系统的非限制性实例包括cre、flp、phic31、bxb1和tn3。
[0093]
可以通过本领域公知的任何方法，例如，通过物理、化学或生物手段将载体引入哺乳动物细胞。将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。生物学方法包括使用病毒载体，尤其是逆转录病毒载体，将基因插入哺乳动物，例如，人细胞。化学手段包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、小珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束、脂质纳米颗粒和脂质体。
[0094]
如本文所用，表达外源性hla-f蛋白的基因修饰的哺乳动物细胞相对于不表达外源性hla-f的相应哺乳动物细胞具有降低的免疫原性。例如，相对于不表达外源性hla-f的相应细胞类型，免疫原性可以降低至少约5％至约95％，例如，约6％、7％、10％、12％、15％、20％、30％、40％、50％、65％、70％、80％、85％、90％，或者相对于不表达外源性hla-f的相同细胞类型的细胞，免疫原性降低另一个百分比。
[0095]
确定细胞免疫原性的方法是本领域公知的。例如，在一些实施方式中，在存在同种异体自然杀伤细胞系(例如，nk-92)的条件下培养hla-f修饰的哺乳动物细胞(例如，人诱导多能干细胞，或由hla-f修饰的诱导多能干细胞分化的细胞，或修饰前已完全分化的细胞等)或未修饰的哺乳动物细胞，然后通过多种标准细胞活力测定中的任一种确定nk-92细胞对hla-f修饰细胞与未修饰细胞的细胞毒性。
[0096]
包含基因修饰的细胞的组合物
[0097]
本公开内容还提供了药物组合物、局部组合物、细胞移植物和人工组织，其包含或使用一种或多种hla-f修饰的哺乳动物细胞产生。
[0098]
稳定和持久的hla-f表达为转基因细胞提供了降低的免疫原性和/或改善的免疫抑制。此外，修饰的哺乳动物细胞可以从基因修饰的干细胞/祖细胞中分化出来，并且还具
有稳定和持久的hla-f表达，从而提供降低的免疫原性和/或改善的免疫抑制。因此，本文所述的hla-f修饰细胞可用于产生任何类型的通用供体细胞，无论是来自基因修饰的多能或专能细胞的定向分化，还是来自完全分化细胞的基因修饰。
[0099]
在一些实施方式中，提供了一种用于癌症治疗的治疗组合物，其包含表达如本文所述的外源性hla-f蛋白的基因修饰的car-t或car-nk细胞。car(例如，针对cd19的car)在基因修饰的car-t或car-nk细胞中的表达以非mhc限制的方式将car-t或car-nk细胞特异性和反应性导向选定的靶标，而hla-f或其变体的表达避免或降低了移植排斥的风险，使该组合物成为同种异体癌症免疫疗法的通用供体。在一些实施方式中，基因修饰的car-t或car-nk细胞是在体外从干细胞/祖细胞(如ips细胞)分化的。在一些实施方式中，干细胞/祖细胞(如ips细胞)被基因修饰以表达car和外源性hla-f蛋白或其变体。
[0100]
在一些实施方式中，提供了一种用于皮肤再生或修复的局部组合物，其包含表达如本文所述的外源性hla-f蛋白或其变体的基因修饰的真皮成纤维细胞。在另一个方面中，提供了一种用于注射的药物组合物，其包含表达如本文所述的外源性hla-f蛋白或其变体的基因修饰的真皮成纤维细胞。在另一个方面中，提供了一种皮肤移植物，其包含表达如本文所述的外源性hla-f蛋白或其变体的基因修饰的真皮成纤维细胞。在另一个方面中，提供了一种永久性皮肤移植组合物，其包含表达如本文所述的外源性hla-f蛋白或其变体的基因修饰的胚胎表皮祖细胞。
[0101]
治疗方法
[0102]
在一个方面中，本公开内容提供了一种用于细胞移植疗法的方法。由于表达本文所述的外源hla-f或其变体的基因修饰细胞具有降低的免疫原性和/或增加的免疫抑制，因此这些特征允许修饰细胞用作通用或改进的供体细胞或组织。这是因为提供给细胞的hla-f介导的免疫原性降低和/或免疫抑制的改善可以减少或消除在供体细胞和很多损伤、疾病或病症的受体之间匹配经典人类白细胞抗原(hla)i类和ii类分子类型的要求。因此，稳定表达hla-f蛋白(例如，本文所述的嵌合hla-f蛋白)的hla-f修饰细胞可用作治疗的通用供体细胞。
[0103]
疗法可以针对治疗疾病的原因；或者，疗法可以是治疗疾病或病况的影响。可以将基因修饰的细胞转移到或靠近对象的受伤部位；或者可以以允许细胞迁移或归巢到受伤部位的方式将细胞引入对象。转移的细胞可以有利地替换受损或受伤的细胞并允许改善对象的整体状况。在一些情况下，转移的细胞可以刺激组织再生或修复，包括皮肤再生或皮肤修复。在一些情况下，转移的细胞携带靶向和消除引起疾病的细胞(例如，癌细胞)的治疗分子。
[0104]
在一些实施方式中，将本文所述的hla-f修饰的哺乳动物细胞施用于患有多种病况中的任一种的对象，所述病况包括但不限于癌症、心血管疾病、眼病(例如，黄斑变性)、听觉疾病(例如，耳聋)、糖尿病、神经退行性疾病、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、多发性硬化症、骨质疏松症、肝病、肾病、自身免疫病、关节炎、牙龈疾病、牙齿病况或增殖性病症(例如，癌症)。在其他情况下，对象正在遭受急性健康病况，例如，中风、脊髓损伤、烧伤或创伤，或处于遭受其的风险中。在其他情况下，对象正在遭受组织损失，如脂肪萎缩或年龄相关的胶原蛋白损失。在其他情况下，对象患有不愈合的溃疡，或者需要药物来帮助闭合的缺陷，如尿道下裂。在其他情况下，对象需要用于伤口愈合或皮肤替代物的永久或暂时性皮肤移植
物。
[0105]
在一个方面中，本公开内容提供了一种将细胞或组织移植到有需要的对象中的通用方法，所述方法包括向所述对象注射或移植包含hla-f修饰的细胞群的细胞或组织组合物，其中与hla-f修饰的细胞群相比所述对象具有至少一个错配的经典hla i类或hla ii类分子，并且其中与相同类型没有所述hla-f修饰的细胞相比，所述hla-f修饰的细胞群显示出降低的免疫原性和/或改善的免疫抑制。可以确定降低的免疫原性和/或改善的免疫抑制，例如，通过在nk-92细胞毒性分析、人源化nsg肿瘤生长分析和/或pbmc增殖分析中对hla-f修饰的细胞与相同类型没有hla-f修饰的对照细胞进行比较。
[0106]
在另一个方面中，本公开内容提供了一种用于在有需要的对象中再生皮肤的方法，所述方法包括向所述对象上的皮肤损伤部位注射hla-f修饰的真皮成纤维细胞和/或hla-f修饰的胚胎表皮祖细胞群，其中与hla-f修饰的真皮成纤维细胞和或hla-f修饰的胚胎表皮祖细胞群相比，所述对象具有至少一个错配的经典hla i类或hla ii类分子。
[0107]
在另一个方面中，本公开内容提供了一种用于在有需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用hla-f修饰的car-t或car-nk细胞群。car(例如，导向cd19的car)能够将t细胞或nk细胞重新特异性和反应性导向选定的癌细胞。hla-f的表达使修饰的car-t或car-nk在同种异体癌症免疫疗法中成为通用供体，即，与hla-f修饰的car-t或car-nk细胞相比，所述对象可以具有至少一个错配的经典hla i类或hla ii类分子。在一些实施方式中，基因修饰的car-t或car-nk细胞在体外从ips细胞分化而来，ips细胞经过基因修饰以表达car和外源性hla-f蛋白。
[0108]
将向有需要的对象施用的hla-f修饰的细胞类型包括但不限于淋巴细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、树突状细胞、表皮祖细胞、间充质干细胞、胰腺β细胞祖细胞、胰腺β细胞、心脏祖细胞、心肌细胞、肝祖细胞、肝细胞、肌细胞祖细胞、肌细胞、肾细胞、成骨细胞、造血祖细胞、牙囊细胞、毛囊细胞、视网膜色素上皮细胞、神经干细胞、神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞或其任何组合。此类哺乳动物细胞可以来源于若干物种之一，包括例如人、小鼠、大鼠、猴或猪。
[0109]
疗法可以针对所治疗疾病的原因；或者，疗法可以是治疗疾病或病况的影响。可以将hla-f修饰的细胞转移到或靠近对象的受伤部位；或者可以以允许细胞迁移或归巢到受伤部位的方式将细胞引入对象。转移的细胞可以有利地替换受损或受伤的细胞并允许改善对象的整体状况。在一些情况下，转移的细胞可以刺激组织再生或修复。在一些情况下，转移的细胞携带靶向和消除致病细胞(例如，癌细胞)的治疗性分子。
[0110]
转移的细胞可以是从hla-f修饰的多能(或全能)干细胞分化而来的细胞。转移的细胞也可以是从多能hla-f修饰的细胞分化而来的专能干细胞。
[0111]
向对象施用治疗的次数可能会有所不同。将hla-f修饰和/或分化细胞引入对象可以是一次性事件；但在一些情况下，这种治疗可能会在有限的时间内引起改善，并需要一系列持续的重复治疗。在其他情况下，可能需要多次施用细胞才能观察到效果。如本领域普通技术人员将理解的，确切的治疗方案将取决于疾病或病况，疾病的阶段和被治疗个体对象的参数。
[0112]
hla-f修饰的细胞可以通过以下任何途径引入对象：胃肠外、静脉内、动脉内、肌内、皮下、透皮、气管内、腹膜内或脊髓液中。
[0113]
hla-f修饰的细胞可以分化成细胞，然后转移至患有多种疾病或病症的对象。
[0114]
可以将car-t或car-nk细胞用于治疗癌症(参见，例如，kershaw等，同上，eshhar等，同上，和sadelain等，同上)。在一些实施方式中，将来源于表达car的hla-f修饰的ips细胞的hla-f修饰的car-t或car-nk细胞施用于患有癌症的对象。
[0115]
可以将胰岛细胞(或朗格汉斯岛的原代细胞)移植到患有糖尿病(例如，1型糖尿病)的对象中，参见例如，burns等，(2006)curt stem cell res.ther.,2:255-266。因此，在一些实施方式中，将来源于hla-f修饰细胞的胰腺β细胞移植到患有糖尿病(例如，1型糖尿病)的对象中。
[0116]
在其他实例中，将来源于hla-f修饰细胞的肝细胞或肝干细胞移植到患有肝病(例如，肝炎、肝硬化或肝衰竭)的对象中。
[0117]
退行性心脏病，如缺血性心肌病、传导疾病和先天性缺陷可以从干细胞疗法中获益。参见，例如，janssens等，(2006),lancet,367:1 13-121。
[0118]
可以将来源于hla-f修饰细胞的造血细胞或造血干细胞(hsc)移植到患有血癌或其他血液或免疫病症的对象中。可能由造血细胞或hsc治疗的血液癌症的实例包括：急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性粒细胞白血病(cml)、霍奇金氏病、多发性骨髓瘤和非霍奇金氏淋巴瘤。通常，患有此类疾病的对象必须接受放射和/或化学治疗以杀死快速分裂的血细胞。将来源于hla-f修饰细胞的hsc引入这些对象可能有助于重新填充耗竭的细胞库。
[0119]
患有神经系统疾病或病症的对象尤其可以从hla-f修饰的细胞疗法中获益，尤其是当血脑屏障可能已经受损时。在一些方法中，hla-f修饰的细胞可以分化成神经干细胞或神经元或小胶质细胞，然后移植到损伤部位以治疗神经病况，例如，阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、多发性硬化症、脑梗塞、脊髓损伤或其他中枢神经系统病症，参见例如，morizane等，(2008),cell tissue res.,33l(l):323-326；coutts和keirstead(2008),exp.neurol.,209(2):368-377；goswami和rao(2007),drugs,10(10):713-719。
[0120]
对于帕金森氏病的治疗，hla-f修饰的细胞可以分化成多巴胺作用的神经元，然后移植到帕金森氏病患者的纹状体中。对于多发性硬化症(ms)的治疗，神经干细胞可以分化成少突胶质细胞或少突胶质细胞的祖细胞，然后将其转移到患有ms的对象中。
[0121]
对于任何神经疾病或病症的治疗，成功的方法可能是将神经干细胞引入对象。例如，为了治疗阿尔茨海默氏病、脑梗塞或脊髓损伤，hla-f修饰的细胞可以分化成神经干细胞，然后移植到受损部位。可以将hla-f修饰的细胞设计为响应可以将其迁移到大脑和脊髓损伤中的线索，参见，chen等，(2007),stem cell rev,3(4):280-288。
[0122]
任选地，用于细胞移植疗法的hla-f修饰的细胞也表达如本文所述的报告蛋白。在一些实施方式中，要使用的报告蛋白是一种有助于对引入的细胞进行体内检测(例如，成像)的报告蛋白。例如，这些细胞可能会表达一种发射远红光的荧光蛋白，如katushka，其长激发和发射波长非常适合在组织中成像。katushka是市售的，商品名为“turbofp635”(evrogen,moscow,russia)，
[0123]
实施例
[0124]
尽管已经参考特定实施方式(其中一些是优选实施方式)特别示出和描述了本公开内容，但是本领域技术人员应该理解，在不背离如本文所公开的本公开内容的精神和范
围的情况下，可以在其中进行形式和细节上的各种改变。
[0125]
实施例1
[0126]
本实施例说明了在转染或不转染外源性核酸的情况下，ips(ipsc 9211)和hek-293细胞中hla-f的表达水平。
[0127]
为测量细胞中hla-e、hla-f和hla-g的mrna水平，使用quick-rna microprep试剂盒(zymo research)从细胞中提取总rna。使用iscript cdna合成试剂盒(bio-rad)从总rna提取物中制备cdna。通过实时pcr使用go-tag绿色聚合酶(promega)和以下引物测定hla-e、f和g水平。
[0128]
表1：用于检测hla-e、f和g的引物
[0129]
引物序列seq id nohuhla-e-fttcgcctacgacggcaagga32huhla-e-rcccttctccaggtatttgtg33huhla-f-fggcagaggaatatgcagaggagtt34huhla-f-rctctgtgtcctgggtctgttc35huhla-g-fttgggaagaggagacacggaaca36huhla-g-raggtcgcagccaatcatccac37xc423-hla-g-f-1gagcgaggccagtgagtaa38xc424-hla-g-r-1tctcccaggtagagggtctg39xc425-hla-g-f-2gcctccctgatctcctgtag40xc426-hla-g-r-2gacggaccctcagaatcact41xc427-hla-e-f-1ctccgagcaaaagtcaaatg42xc428-hla-e-r-1cctagcccaagaaggagatg43xc429-hla-e-f-2taagtccaggctggtgtcaa44
[0130]
用于测定ips细胞中hla-e、f和g的mrna水平的qrt-pcr结果显示在下表2中。
[0131]
表2：在ipsc细胞系中的hla-e、f和g表达
[0132][0133]
实施例2
[0134]
本实施例说明了在修饰的和未修饰的hek293细胞中的hla-f表达。
[0135]
发明人此前已经使targatt
tm hek293细胞准备好用于基因插入(见图7)。使用targatt
tm hek293细胞，发明人产生了修饰的hek293细胞，其在安全港基因组h11基因座处包含hla-f或hla-g的单拷贝插入。进行相同qrt-pcr以测量mrna表达。表3中的数据表明，与ips细胞相比，hek293细胞具有更高的基础水平hla表达，其中在hek293中与hla-e相比表达的hla-f和g更多。一份外源性hla-f和hla-g的拷贝分别使hla-f和hla-g表达增加10倍和7倍。
[0136]
表3：在修饰的或未修饰的hek293细胞中hla-e、f和g的表达。出于比较目的，将ipsc包括在同一实验中。
[0137][0138][0139]
实施例3
[0140]
本实施例说明了在hek293细胞中hla-f变体的表达。
[0141]
天然存在的hla-f从n末端到c末端包含：hla-fα1结构域、α2结构域、α3结构域、跨膜结构域和胞质结构域。hla-fα1结构域和α2结构域形成肽结合沟槽。hla-fα3结构域与β-2为球蛋白(β2m)相结合，其是hla-f复合物稳定性所必需的。
[0142]
除了具有346个氨基酸的“规范”亚型1(seq id no:1或2)(在表4中为hla-f的短形式，称为“hla-f-s”)以外，hla-f存在多种亚型，主要是亚型3，其是最长的亚型，在其胞质区域中具有额外96个氨基酸序列(对于hla-f长形式，称为“hla-f-l”，seq id no:3或4)。
[0143]
本发明人产生了hla-f-β2m融合蛋白(图5c和图5d)，其从n末端到c末端包含信号肽、α1、2和3结构域、15个氨基酸(ggggs)3接头、β2m、跨膜和胞质结构域。发明人产生的hek293细胞包含hla-f短或长形式的融合。
[0144]
表4中的数据表明，(i)一个拷贝的外源性基因插入使hek293细胞中的hla-f和hla-f-β2m mrna表达水平增加100倍以上；(ii)所测试的所有三种hla-f变体的mrna表达水平相似。与表3数据相比，本轮实验中较高的基因表达水平可能是由于两个实验中使用的启动子不同导致的。表3实验使用cag启动子，而表4使用cef(cho ef1α)启动子。
[0145]
表4：在修饰的hek293细胞中hla-e、f和g的表达
[0146][0147][0148]
实施例4
[0149]
本实施例说明了外源性hla-f蛋白的表达降低了nk细胞毒性分析中hek-293细胞的免疫原性。
[0150]
为进行细胞毒性测定，将使用edta分离的5x 104个hek-293细胞与2.5x 106个pbmc细胞共培养4小时。然后，收集细胞，在pbs中洗涤2次，并用green dye(thermo fisher l23101)在4℃下避光染色30分钟。之后，将细胞离心，在2％fbs pbs中洗涤2次，并进行facs分析。在分析中使用三组细胞：表达对照mcherry基因的hek293；表达由cef启动子、cho ef1α启动子调控的hla-g基因的hek293细胞(cef-hla-g)(zhao等，2014；hantash 2017)；表达由cef启动子调控的hla-f-β2m融合基因的hek293细胞(cef-hla-f-β2m)。如来自3项独立实验的图6和表5所示，外源性hla-g和hla-f-β2m蛋白的表达显著降低nk细胞介导的细胞毒性，其中hla-g比hla-f略微更加有效。发明人决定使用hla-f长型融合，因为长型融合比短型融合提供更加一致的免疫保护结果。
[0151]
表5：hla-g和hla-f-β2m蛋白的外源性表达降低nk细胞介导的细胞毒性
[0152][0153]
实施例5
[0154]
本实施例说明了表达hla-f-β2m融合和hla-f的ipsc细胞系的产生。
[0155]
hla-f肽结合形式与抑制性nk细胞受体特异性相互作用，从而使细胞具有“缺失自我”信号。发明人在实施例4中表明，在hek293细胞中表达hla-f-β2m融合蛋白更能抵抗nk细胞的杀伤。生产含有hla-f-β2m的修饰ips细胞以测试其免疫保护活性。结果表明，表达外源性hla-f-β2m蛋白的基因修饰的ips细胞相对于不表达外源性hla-f-β2m的相应哺乳动物细胞具有降低的免疫原性。
[0156]
发明人建立了targatt
tm
主ipsc细胞系，其在h11安全港基因座含有着陆垫(attp)。该细胞系用于使用targatt
tm
技术插入hla基因(图7)，每个分别含有hla-f和hla-f-β2m。简言之，将hla基因在mcs(多克隆位点)克隆到供体质粒ast-3070中，然后与质粒ast-3071(含有phic31整合酶)共转染到targatt主ips细胞中。phic31催化attp和attb位点之间的重组，导致hla基因在着陆垫的整合。通过添加潮霉素和更昔洛韦(可杀死表达胸苷激酶(tk)的细胞)作为阴性选择标记，消除任何非整合体、随机或非特异性基因插入。首先用潮霉素选择阳性克隆，然后用更昔洛韦选择富集。结果表明，在使用该系统进行位点特异性基因插入时，潮霉素选择的效率为46％，而潮霉素和更昔洛韦选择的效率为67％(图8)。发明人使用qrt-pcr来测定这些修饰的ips细胞中的hla mrna水平，使用上述实施例1中描述的相同方法。发明人还进行了western印迹和免疫染色以测定hla蛋白分布(胞质对比细胞表面)和细胞中的表达。
[0157]
实施例6
[0158]
本实施例说明了用于考察实施例5中产生的细胞系中的免疫保护活性的分析的开发。
[0159]
在hek293细胞中的数据表明，在表达hla-f-β2m的细胞中nk细胞杀伤减少。
[0160]
nk介导的细胞毒性分析
[0161]
nk细胞毒性分析是基于ips细胞的特定培养条件开发的。与hek293细胞相比，ips细胞需要更多的生长因子，且常规的ipsc培养条件通常包含未知成分或动物成分。例如，matrigel通常用于包被培养皿以进行ipsc培养。这些未知组分和生长因子可能会干扰基于nk的细胞毒性分析。发明人使用确定的和无动物成分的试剂和培养基来培养ips细胞。发明人使用作为重组人蛋白的玻连蛋白来包被培养板并使用tesr-acf培养基(stem cell technologies)来培养ips细胞。nk细胞毒性分析是使用两种来源的nk细胞进行的：一种是商业购买的nk细胞(reachbio)，另一种是由发明人生产的，其是从ips细胞分化而来的ink细胞。使用细胞介导的细胞毒性试剂盒(分子探针，l7010)(thermofisher)进行分析。简言之，由il2激活的nk细胞(效应细胞)与靶细胞(在单细胞悬液中的ipsc及其分化细胞)以1:1、2:1、4:1和10:1的比例混合并在37℃下在湿润的5％co2培养箱中孵育4小时。根据生产厂商的说明书，通过facs分析确定活细胞/死细胞。每个分析条件重复进行三次。结果表明，与野生型ipsc相比，具有hla-f和hla-g表达的ipsc具有较少的细胞裂解。
[0162]
混合t淋巴细胞反应(mlr)分析
[0163]
发明人进行了mlr分析，以确定当与hla表达和对照ips细胞混合时的t淋巴细胞增殖。人外周血单核细胞(pbmc)购自san diego血库(其他来源包括hemacare，stem cell technologies)，并且根据生产厂商的方案解冻并立即用于分析。使用celltrace cfse细胞增殖试剂盒(thermofisher)测量人外周血混合t淋巴细胞的增殖。简言之，将pbmc用cfse标
记，ipsc用丝裂霉素c(sigma-aldrich)处理以灭活细胞分裂。将经处理的ips细胞解离成单细胞悬液，并以每孔1x 105个接种在96孔板中。将50μl中相同数量的人类cfse标记的pbmc添加到96孔板中。将细胞混合物在37℃下孵育24小时，然后进行流式细胞术分析。通过cfse信号确定t细胞增殖，通过ips细胞的自发荧光对荧光进行归一化。每个分析重复进行三次。结果表明，表达hla-f-β2m和hla-g的ips细胞对t细胞增殖有抑制作用。
[0164]
ipsc分化细胞的免疫特征
[0165]
最终用于同种异体移植的细胞是ipsc分化细胞。因此，测试分化细胞的免疫活性是重要的。为此目的，将ipsc分化成以下细胞类型，包括神经祖细胞(npc)、胰腺前体细胞(ppc)和造血祖细胞(hpc)。选择这3种类型的细胞是因为每一种都代表一种生发层类型的细胞。此外，发明人已经针对这些细胞类型开发了ipsc分化方案。使用发明人建立的方案将表达hla-g或hla-f-β2m的ipsc分化成npc、ppc和hpc。对分化的细胞进行细胞毒性和mlr分析。
[0166]
结果表明，与没有hla-f-β2m的细胞相比，表达hla-f-β2m的ipsc及其分化的细胞具有降低的免疫原性。
[0167]
实施例7
[0168]
本实施例说明了通用ipsc的生成，该通用ipsc表达hla-g-β2m、hla-f-β2m和cd95l的组合。
[0169]
已发现外源性hla-g的表达降低了人es细胞及其表皮衍生物的免疫原性(zhao等，2014)。hla-g与hla-f一样，通过与免疫细胞差异表达的lilrb1(ilt2/cd85j)、lilrb2(ilt4/cd85d)和kir2dl4(cd158d)等多种受体相互作用发挥其免疫调节功能。hla-g分子与抑制性受体的相互作用可诱导活化的cd8 t细胞凋亡(kapasi等，2000)，调节nk细胞(rajagopalan和long 1999)和树突状细胞(dc)(liang等，2008)的活性。lilrb1与其配体的相互作用，例如导致启动抑制级联反应的其基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itims)的磷酸化。这种相互作用发生在α3结构域和β2m(brown等，2004)。事实上，无β2m的hla-g分子不被lilrb1识别。为改善nk抑制途径，发明人表达了hla-g-β2m的融合，类似于hla-f-β2m，以便在供体细胞中获得比单独的hla-g更好的免疫保护。发明人产生了共表达hla-g-β2m和hla-f-β2m的ipsc供体细胞，以增强hla与多种nk抑制性受体的相互作用(lin和yan 2019；alegre等，2014)。发明人选择hla-g而不是hla-e或两者都选择是因为hla-g和hla-e在一些情况下作用于重叠的nk抑制性受体(gornalusse等，2017)。发明人还表达cd95l作为其他免疫掩蔽策略。cd95(fas)是一种细胞表面蛋白，当与其天然配体cd95l(fasl)结合或用于激动性抗体刺激时，可介导细胞凋亡(peter等，2015)。其在体内普遍表达，但在胸腺、肝脏、心脏和肾脏中尤其丰富。cd95l主要在活化的t淋巴细胞和自然杀伤细胞中表达，并在睾丸和眼睛等“免疫特权部位”的组织中组成性表达，表明其在免疫保护中的作用。结果表明，共表达hla-g、f和cd95l可阻断nk和t细胞介导的同种异体移植排斥。
[0170]
构建设计：发明人构建了三种ipsc细胞系：1)细胞系一包含hla-f-β2m；2)细胞系二包含(hla-f-β2m)-2a-(hla-g-β2m)；3)细胞系三包含(hla-g-β2m)-2a-(hla-f-β2m)-2a-cd95l(图9)。使用targatt
tm
基因插入技术产生这些细胞系。简言之，通过ipsc基因组中的假attp位点和供体质粒上的c31 attb(由phic31整合酶识别)之间的重组，使用phic31整合酶插入含有免疫转基因盒和着陆垫bxb1attp(由bxb1整合酶识别，橙色箭头)的供体质粒。修
饰的基因座包含免疫基因盒和报告基因盒，两侧是bxb1整合酶识别位点，bxb1 attp。使用bxb1整合酶将报告基因盒与任何所关注的基因“交换”出来，而cre重组去除绿色报告基因盒。这种设计使得在targatt
tm
通用ipsc细胞系中插入任何所关注的基因变得容易。
[0171]
产生修饰的ipsc细胞系：为了选择可能用于临床的ipsc细胞系，发明人使用最初源自nih的nhcdr-000750细胞系。其是与cgmp细胞系nhcdr-000740匹配的研究级细胞系。这使得向临床级细胞的过渡成为一个简单的过程。
[0172]
实施例8
[0173]
本实施例说明了通用主ipsc及其分化细胞的免疫原性特征。
[0174]
修饰的ips细胞的基因组分析：与crispr/cas9等其他基因编辑方法相比，targatt基因插入技术的脱靶事件非常低。发明人进行pcr和新一代测序以分析含有转基因的克隆并确保在修饰的细胞中仅存在所需的插入。还进行了全基因组测序(wgs)以排除ips基因组中的任何dna损伤。
[0175]
体外细胞毒性和免疫分析：如上述实施例4中所述，进行了nk细胞毒性分析和mlr分析。
[0176]
与同种异体cd8 t细胞的体内反应性：体内反应性分析是基于畸胎瘤的分析，其中ipsc在免疫缺陷小鼠中分化为全部3个生发层细胞以形成畸胎瘤。
[0177]
免疫缺陷小鼠nsg小鼠购自jackson laboratory(bar harbor,mn)。将未修饰的ipsc(野生型)，以及3个修饰的ipsc细胞系的每一个，以100万个细胞/接种部位，皮下注射到每个细胞系5只nsg小鼠中。在ipsc植入后第35天，将同种异体人cd8 t细胞(8.5x 105)激活并通过眶后窦静脉注射到每只小鼠体内。以重量和尺寸测量收获的畸胎瘤(在第56天)，并通过石蜡包埋切片的苏木精和伊红(h&e)染色进行分析。冰冻切片的抗人cd8抗体染色允许对组织切片中的cd8 t细胞浸润进行半定量分析。结果表明，由表达全部3种转基因的ipsc形成的畸胎瘤对cd8 t细胞的浸润或裂解具有最强的抗性。
[0178]
该方案中产生的通用供体细胞使内源性hla基因保持不变，因此维持内源性免疫防御稳态以对抗肿瘤发生或病毒感染。这在安全性上优于其他敲除hla 1类基因的通用细胞(gornalusse等，2017)。hla表达缺失或减少有助于肿瘤细胞逃避免疫应答(hicklin等，1998)。如果移植的hla阴性细胞发生恶变，通过正常的免疫机制将难以消除。因此，对移植的细胞群进行致癌突变筛查尤为重要。
[0179]
实施例9
[0180]
本实施例说明了使用通用ipsc平台开发治疗性car-ink产品。
[0181]
自然杀伤(nk)细胞和cd8 细胞毒性t细胞是两种类型的免疫细胞，其可以通过类似的细胞毒性机制杀死靶细胞。抗cd19嵌合抗原受体(car)t细胞疗法在b细胞癌中显示出显着的临床有效性。然而，car-t细胞会产生显著的毒性作用，并且细胞的制备很复杂。与car-t细胞相比，car-nk细胞可以提供一些显著的优势，包括：1)更好的安全性，如在自体环境中的细胞因子释放综合征和神经毒性(chou和turtle 2019)以及在同种异体环境中的移植物抗宿主病(lupo和matoseyic 2019)缺乏或最小化，2)激活细胞毒活性的多种机制，和3)“现成”制造的高可行性。可以将car-nk细胞设计成靶向多种抗原，增强体内增殖和持久性，增加对实体瘤的浸润，克服耐药性肿瘤微环境，最终实现有效的抗肿瘤应答。事实上，liu等，(2020)报告了其使用cd19-car-nk细胞治疗cd19 淋巴瘤的i/ii期研究，并在安全性
和有效性方面观察到了积极的临床结果。car-nk细胞的施用与细胞因子释放综合征、神经毒性或移植物抗宿主病的发展无关，并且炎症细胞因子(包括白介素6)的水平与基线相比没有增加。在接受治疗的11名患者中，8名(73％)有应答；在这些患者中，7名(4名淋巴瘤和3名cll)完全缓解，1名具有richter转化成分缓解，但cll持续存在。在所有剂量水平输注后30天内应答迅速且可见。输注的car-nk细胞扩增并以低水平持续至少12个月。
[0182]
表达cd19car和il15的工程化ipsc：发明人在um-ipsc中与il-15一起表达cd19-car，然后分化为nk细胞以产生cd19car-ink。已证明il-15可增强nk细胞在体内的存活和扩增(hermanson等，2016)。
[0183]
使用通用ips主细胞，发明人使用bxb1整合酶插入cd19-car和il-15(图10)。使用整合酶bxb1，将含有cd19car-il15表达盒的供体质粒上的attb位点与ipsc基因组基因座中的attp位点重组。这导致用cd19car-il15表达盒替代报告基因盒(绿色框)。attb*和attp*中的“*”表示与attb和attp不同的核心序列，以控制重组方向，因此只有转基因重组到基因组中，而不是质粒骨架。然后，将工程化的ipsc分化为nk细胞，通过facs分选进一步纯化，以达到95％以上的纯度。
[0184]
car-ink的体外功能：为了评估nk细胞毒性，通过使用细胞介导的细胞毒性试剂盒(分子探针，l7010)(thermofisher)以及在实施例6中公开的方法，发明人比较了car-ink与没有car的ink在多个e:t比率下杀死raji和nalm-6(atcc)cd19 癌细胞系的体外潜力。结果表明，与未修饰的nk细胞相比，car-ink对raji和nalm-6cd19 细胞系具有更高的杀伤潜力。为了进一步解决cd19-car-ink细胞的特异性杀伤能力，使用表达cd19的k562细胞(k562/cd19)和亲代k562细胞(cd19阴性)作为靶细胞。进行了相同的细胞毒性测定。结果表明，cd19-car-ink细胞比cd19-细胞更有效地裂解cd19 细胞。
[0185]
临床前动物模型研究：发明人制备了raji移植瘤模型来测试car-ink靶向肿瘤的作用。raji是从一名患有伯基特氏淋巴瘤的11岁黑人男性患者中分离出的第一个造血人类细胞系，是各种分子生物学应用的优秀转染宿主。raji b细胞淋巴瘤模型已很好地用于cd19-car细胞疗法(tsukahara等，2013)。为了测试car-ink在肿瘤部位的累积，对10-12周龄nsg小鼠(the jackson laboratory,bar harbor,me)皮下注射5x106个用荧光素酶报告基因转导的raji细胞(raji/luc细胞)。接种两周后，将107个cd19-car-ink细胞静脉注射到荷瘤小鼠体内。在ink细胞输注24小时后切除肿瘤，并使用抗cd56抗体通过免疫组织化学分析。
[0186]
为了进一步评价car-ink的抗肿瘤作用，在第0天给nsg小鼠静脉注射5x104个raji/luc细胞，然后在第3天通过单次静脉输注107个cd19-car-ink细胞或对照非修饰ink细胞过继转移。为了监测体内raji/luc细胞的进展，将荧光素酶底物d-荧光素腹膜内注射到小鼠体内(75mg/kg体重)，在第15、21和29天使用ivis成像系统和living image软件(xenogen,hopkinton,ma)进行生物发光成像。在ink细胞施用后第29天，分析以下数据，包括动物存活率、细胞因子水平(如ifn-γ和gm-csf、il-1a、il-1ra、il-2、il-2ra、il-6等)、gvhd、脾脏中人cd56的免疫组化染色、荷瘤小鼠的病变。在获得动物实验室所在的ouhsc(the university of oklahoma health sciences center)机构动物护理和使用委员会(iacuc)的批准后，所有小鼠实验均以人道的方式进行。
[0187]
结果表明，工程化的cd19car-ink在动物模型中是安全有效的，没有或很少有由
cd19-car-t细胞引起的gvhd、细胞因子释放综合征或神经毒性。
[0188]
实施例10
[0189]
本实施例说明了hla-f的过表达在ipsc中具有免疫抑制活性。使用表达hla-f-β2m(hla-fb)的ipsc进行与实施例4中类似的nk介导的毒性分析，但使用cd56 nk细胞代替pbmc作为效应细胞。来自一个此类实验的数据显示在图11中。使用了几种比例，包括1:1、2:1和4:1的效应物(nk细胞)与靶细胞(ipsc)之比。每组包含3个样品。效应物：目标物＝2:1的比率显示细胞死亡率从59％降低到39％，“p”值为0.0231，表明对hla-fb表达的免疫保护具有统计学意义。