一种药物化合物在治疗实体瘤中的新用途

1.本发明涉及一种药物化合物在制备治疗实体瘤肺癌药物中的应用，特别是s-(5
′‑
腺苷)-l-甲硫氨酸氯化物二盐酸盐(sam)的制药新用途，更具体的包括sam在小细胞肺癌(small cell lung cancer)治疗中的应用，属于生物医药领域。


背景技术：

2.肺癌是中国致死率领先的恶性肿瘤，每年有超过70万的新增病例，5年生存率低于17％。肺癌大体可以根据其病理特征分为小细胞肺癌(sclc)和非小细胞肺癌(nsclc)。sclc是具有神经内分泌特性的一类肺癌，占所有肺癌的15％。sclc因为在早期就有极强的转移能力，通常不进行手术治疗。初诊的sclc往往对放化疗敏感，目前通常使用1980年代以来推行的依托泊苷 顺铂(ep)的化疗方案。但大多数患者很快复发耐药。最新的免疫治疗的效果也十分有限。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于：针对现有技术存在的肺癌致死率高，传统害化疗药物复发率高的问题，提供一种药物化合物在治疗肺癌中的新用途。
4.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
5.s-(5
′‑
腺苷)-l-甲硫氨酸氯化物在制备治疗实体瘤的药物中的用途。
6.进一步，所述实体瘤是肺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌。优选地，所述肺癌是非小细胞肺癌或小细胞肺癌。特别是针对小细胞肺癌作用较好。
7.进一步，所述s-(5
′‑
腺苷)-l-甲硫氨酸氯化物是s-(5
′‑
腺苷)-l-甲硫氨酸氯化物二盐酸盐。
8.优选地，所述s-(5
′‑
腺苷)-l-甲硫氨酸氯化物二盐酸盐的结构式如下：
[0009][0010]
s-(5
′‑
腺苷)-l-甲硫氨酸氯化物二盐酸盐的cas号为86867-01-8；
[0011]
其分子式为c
15h23
cln6o5s
·
2hcl。
[0012]
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
[0013]
1、发明人通过细胞实验和动物实验，验证确认了s-(5
′‑
腺苷)-l-甲硫氨酸氯化物对于肺癌细胞或肺癌组织的高效率抑制作用，确定s-(5
′‑
腺苷)-l-甲硫氨酸氯化物对于肺癌细胞具有显著抑制作用，并且细胞毒性可控，具有全新治疗肺癌的药物开发潜力。特别是
对于肺癌细胞转移情具有抑制作用，防治肺癌疗效显著。
[0014]
2、本发明s-(5
′‑
腺苷)-l-甲硫氨酸氯化物在制备治疗实体瘤的药物中的用途，增加了实体瘤治疗用药物可选范围，特别是对于肺癌的防治作用显著，相较于传统化疗药物更具有针对性，对于肺癌的抑制率更高。
附图说明
[0015]
图1a是s-(5
′‑
腺苷)-l-甲硫氨酸氯化物二盐酸盐的化学结构式。
[0016]
图1b是利用不同浓度的sam药物处理小鼠小细胞肺癌类器官后在48h、72h、96h、120h的相对类器官数量。
[0017]
图1c是0.02mm sam作用后小细胞肺癌类器官形态发生改变，药物作用后突触变少。
[0018]
图1d是药物作用后带有突触的类器官的比例。
[0019]
图2是体内验证sam对小鼠小细胞肺癌的生长和转移具有抑制作用结果图。其中，(a)利用荧光素酶活体成像系统检测给药组和溶剂组小鼠肺部的荧光信号强度；(b)流式分析两组小鼠循环肿瘤细胞比例；(c)两组小鼠循环肿瘤细胞比例统计图；(d)给药组和溶剂组小鼠肝转移对比图；(e)肝脏转移灶统计图；(f)肝脏切片he染色。
[0020]
图3a是利用不同浓度的sam药物处理小细胞肺癌病人hx20200923类器官后在48h、72h、96h、120h的相对类器官数量。
[0021]
图3b是利用不同浓度的sam药物处理小细胞肺癌病人hx20201103类器官后在48h、72h、96h、120h的相对类器官数量。
具体实施方式
[0022]
下面结合附图，对本发明作详细的说明。
[0023]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明使用的试剂除特殊说明均为商业购买获得。
[0024]
简要说明本发明实验方法如下：获取新鲜的小鼠小细胞肺癌组织，采用胶原酶消化为单细胞，与基质胶混合构建3d培养环境，在包含fgf10、rspo1、wnt3a等生长因子的条件培养基中于37℃，5％co2培养箱中培养小细胞肺癌类器官。采用原位移植技术进行类器官移植，通过小动物荧光素酶活体成像监测肿瘤形成，通过h&e染色、免疫荧光染色对肿瘤进行病理分析，该模型的成功构建为体内外药物试验提供了新方法。该模型可被应用于药物筛选、药物毒性试验、免疫治疗试验等。
[0025]
具体而言，本发明细胞实验、动物实验技术方案按照以下实施例1-3共计三个部分进行试验分析。
[0026]
实施例1
[0027]
体外验证s-(5
′‑
腺苷)-l-甲硫氨酸氯化物二盐酸盐对小鼠小细胞肺癌类器官的生长具有抑制作用
[0028]
利用基质胶(bd matrixgel)和多种细胞因子体外3d培养小鼠小细胞肺癌类器官。在96孔板中，用多个浓度梯度的sam药物进行处理，浓度为0.0，0.1，0.5，2.5mm。利用显微镜
拍照统计类器官数量，以溶剂组为对照，计算每个孔的相对类器官数量。统计带有突触的类器官的数量，计算其比例，以此评价小细胞肺癌细胞的转移能力。
[0029]
具体地，实验方法包括以下步骤：
[0030]
(1)取小鼠新鲜小细胞肺癌组织冰上剪碎。
[0031]
(2)胶原酶(1mg/ml胶原酶i和0.5mg/ml胶原酶iv)重悬剪碎的组织块置于50ml离心管中，用10ml移液枪吹打以促进组织块的裂解。剪碎的组织块量为1～2克，胶原酶的用量为10ml。
[0032]
(3)将装有胶原酶和组织块的50ml离心管置于37℃摇床，速度220rpm，消化10min，再取出用移液枪吹打，使组织细胞充分分散开来。
[0033]
(4)置于摇床消化10min，再取出用移液枪吹打。
[0034]
(5)将步骤(4)处理好的含有小鼠肺癌细胞的液体用100μm细胞筛网过滤细胞。
[0035]
(6)过滤后，室温，1500rpm，5min离心处理去除上清液。
[0036]
(7)加入5ml dmem/f12(gibco,gref#c11330500bt)重悬，室温，1500rpm，5min离心，去除上清。
[0037]
(8)细胞计数后，约每10000个细胞混合30μl martrigel，滴于48孔板孔的正中。
[0038]
(9)转移至37℃、5％co2的培养箱，凝固martrigel，凝固时间为10-20min。
[0039]
(10)每孔加入150μl细胞培养基，在细胞培养箱中培养。
[0040]
(11)培养2-3天后，将孔里的培养基去除，用tryple将细胞重悬到离心管中，在37摄氏度水浴锅中水浴10min。中途取出吹打一次。
[0041]
(12)室温，1500rpm，5min离心，去除上清。细胞计数后，约每3000个细胞混合10μl martrigel，滴于96孔板孔的正中。
[0042]
(13)24h后，将细胞的培养基换成含有sam药物的培养基，浓度梯度为0.0，0.1，0.5，2.5mm。
[0043]
(14)分别在药物作用48h、72h、96h和120h后，利用显微镜拍照统计类器官数量。
[0044]
(15)与溶剂对照组相比，计算每个孔的相对类器官数量。计算方法：以sam孔为例，相对类器官数量＝(sam孔的类器官数量)/(溶剂孔加药前的类器官数量)。
[0045]
实验结果如图1b、图1c、图1d所示，可见，体外验证sam对小鼠小细胞肺癌类器官的生长具有抑制作用实验结果显示sam浓度为2.5mm，在给药后48小时肺癌类器官生长完全受到抑制；sam浓度为0.1mm时，作用96小时后肺癌类器官存活率基本为零。
[0046]
图1b显示利用不同浓度的sam药物处理小鼠小细胞肺癌类器官后在48h、72h、96h、120h的相对类器官数量。
[0047]
图1c显示0.02mm sam作用后小细胞肺癌类器官形态发生改变，药物作用后突触变少。
[0048]
图1d显示药物作用后带有突触的类器官的比例。
[0049]
实施例2
[0050]
体内验证s-(5
′‑
腺苷)-l-甲硫氨酸氯化物二盐酸盐对小鼠小细胞肺癌的生长和转移具有抑制作用
[0051]
将小鼠小细胞肺癌细胞原位移植到小鼠肺部。10天后，通过荧光素酶活体成像系统检测小鼠肿瘤负荷，并开始灌胃给药。给药剂量为100mg/kg。连续给药14天，在给药过程
中通过荧光素酶活体成像系统检测小鼠肿瘤负荷。同时经小鼠眼眶采集外周血，利用流式分析循环肿瘤细胞的比例。给药完成后剖解小鼠，统计肺部原位肿瘤的大小以及其它器官的转移情况。
[0052]
具体而言，细胞实验方法包括以下步骤：
[0053]
(1)用trpl e消化小鼠肺癌组织，消化成单细胞。
[0054]
(2)取约1*105个细胞，用25μlpbs重悬细胞，再加入25μl matrigel，吹打混匀。
[0055]
(3)利用胰岛素针将细胞悬液原位移植到小鼠左肺。
[0056]
(4)移植后10天通过荧光素酶活体成像系统对小鼠体内的肿瘤进行检测。检测方法如下：小鼠腹腔内给予150mg/kg d-荧光素钾盐(biovision，cat#7903-10pk)，注射10-15分钟后在ivis光谱体内成像系统(perkinelmer)上成像。
[0057]
(5)根据荧光信号将小鼠分为给药组和溶剂组，每组3只小鼠，初始荧光信号值相似的两只为一对。
[0058]
(6)小鼠采用灌胃方式给药，每天一次，给药组的给药量为100mg/kg，连续给药14天。
[0059]
(7)在开始给药后7天和14天通过荧光素酶活体成像系统对小鼠体内的肿瘤进行检测。同时经小鼠眼眶采集外周血，利用流式分析循环肿瘤细胞的比例。
[0060]
(8)给药完成后剖解小鼠，统计肺部原位肿瘤的大小以及肝、淋巴结、肾脏等器官的转移情况。
[0061]
实验结果如图2所示，实验结果表明给药组比对照组的肿瘤负荷更小，流式分析显示循环肿瘤细胞明显减少。将小鼠剖解后发现，给药组比对照组肝转移数明显减少。
[0062]
图2显示sam对小鼠小细胞肺癌的生长和转移具有抑制作用。图2中，(a)利用荧光素酶活体成像系统检测给药组和溶剂组小鼠肺部的荧光信号强度；(b)流式分析两组小鼠循环肿瘤细胞比例；(c)两组小鼠循环肿瘤细胞比例统计图；(d)给药组和溶剂组小鼠肝转移对比图；(e)肝脏转移灶统计图；(f)肝脏切片he染色。
[0063]
实施例3
[0064]
体外验证s-(5
′‑
腺苷)-l-甲硫氨酸氯化物二盐酸盐对人小细胞肺癌类器官的生长具有抑制作用
[0065]
体外验证sam对人小细胞肺癌类器官的生长具有抑制作用。取小细胞肺癌病人胸水，收集肿瘤细胞，体外培养形成类器官。在类器官的培养基中加入sam药物，浓度为0.0，0.1，0.5，2.5mm。利用显微镜拍照统计类器官数量，以溶剂组为对照，计算每个孔的相对类器官数量。
[0066]
具体而言，细胞实验方法包括以下步骤：
[0067]
(1)取小细胞肺癌病人胸水，用100μm细胞筛网过滤。
[0068]
(2)过滤后，室温，1500rpm，5min离心处理，去除上清液。
[0069]
(3)用红细胞裂解液重悬细胞沉淀，冰上裂解红细胞3分钟，1500rpm，3min离心，去除上清。
[0070]
(4)加入5ml dmem/f12重悬，室温，1500rpm，5min离心，去除上清，收集肿瘤细胞。
[0071]
(5)细胞计数后，约每3000个细胞混合10μl martrigel(bd，cat#354230)，滴于96孔板孔的正中。
[0072]
(6)24h后，将细胞的培养基换成含有sam药物的培养基，浓度梯度为0.0、0.1、0.5、2.5mm。
[0073]
(7)分别在药物作用48h、72h、96h和120h后，利用显微镜拍照统计类器官数量。
[0074]
(8)与溶剂对照组相比，计算每个孔的相对类器官数量。计算方法：以sam孔为例，相对类器官数量＝(sam孔的类器官数量)/(溶剂孔加药前的类器官数量)。
[0075]
实验结果如图3a和图3b所示，实验结果表明在0.1mm、0.5mm、2.5mm的sam作用下，病人小细胞肺癌类器官的生长被显著抑制，且具有剂量依赖性。其中，图3a显示利用不同浓度的sam药物处理小细胞肺癌病人hx20200923类器官后在48h、72h、96h、120h的相对类器官数量。图3b显示利用不同浓度的sam药物处理小细胞肺癌病人hx20201103类器官后在48h、72h、96h、120h的相对类器官数量。