一种通过基因工程改造CENH3蛋白提高玉米单倍体诱导系诱导率的方法

一种通过基因工程改造cenh3蛋白提高玉米单倍体诱导系诱导率的方法
技术领域
1.本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种通过基因工程改造cenh3蛋白提高玉米单倍体诱导系诱导率的方法。


背景技术：

2.玉米是一种利用杂种优势的模式作物，我国97％以上的玉米播种面积使用的是杂交种。杂种优势的利用中，最为关键的环节是纯系的选育，常用的有两种方法：第一种为系谱法，即通过连续多带的自交或回交，通常需要5-7年的时间获得纯系；另一种是双单倍体(double haploid,dh)育种技术，利用单倍体诱导系诱导产生的单倍体加倍后成为纯合的二倍体，在1-2年内即可获得纯系。dh育种在玉米商业化育种流程中扮演着越来越重要的角色，与分子育种技术、转基因技术等已成为现代玉米育种的核心技术。
3.单倍体，是指细胞内具有配子染色体数目的个体。单倍体只有一套染色体，隐性基因跟显性基因都能在当代显现出来，所以在早代可以进行优良性状的筛选，及时淘汰不良性状，有利于产量、抗性等有利等位基因的快速聚合。单倍体被加倍后，就可以直接得到纯合的个体，无基因分离现象，与常规育种系谱法相比得到纯系的时间短。另外，单倍体育种中由于没有基因互作，通过分子标记辅助选择，可以提高选育的效率及准确性。此外，利用dh系还可以快速产生作图群体、染色体代换系、反向育种亲本和无融合生殖工程等等。
4.目前，在玉米dh育种的实际应用中，单倍体后代的获得主要是通过玉米stock6种质衍生的单倍体诱导系进行母本单倍体的诱导产生。stock6玉米单倍体诱导系在1959年首次被报道，具有2.3％-3.2％的母本单倍体诱导率。在随后的数十年里，世界各地的玉米育种家通过杂交或回交，不断对stock6诱导系进行改良，使玉米单倍体诱导系的诱导率得到显著提升。
5.除了基于stock6种质的单倍体诱导系选育方法之外，cenh3介导的单倍体诱导技术是未来最有可能被应用于商业化育种程序中的另一种单倍体获取手段。cenh3基因编码了着丝粒特异的组蛋白，是核小体组蛋白h3的变异体，对着丝粒在染色体上的定位起重要的作用。目前的研究表明，利用基因工程的手段，通过对玉米、水稻、拟南芥等植物的cenh3基因进行敲除或突变，可以使植株的配子体或孢子体具备诱导产生单倍体后代的能力，从而创制单倍体诱导系。
6.然而，以上两种单倍体诱导系的选育或创制方法，仍存在着明显的缺陷。对于通过改良stock6种质选育玉米单倍体诱导系的方法，目前主要有以下缺点：1、即使通过多年的回交选育，单倍体诱导系的诱导率的提升速度仍然较慢。2、由于受到种质资源的限制，单倍体诱导系的农艺性状改良与单倍体诱导率的提升二者无法做到完全兼顾，导致具有诱导率较高的材料，其农艺性状可能较差，而无法用于商业化育种应用。
7.对于通过基因工程改造cenh3基因而创制玉米单倍体诱导系的方法，目前有以下缺点：1、单倍体诱导系的诱导率仍然较低，且创制的诱导系群体中，各单株之间的单倍体诱
导率不稳定。2、由于大部分玉米常规系的遗传背景中没携带颜色标记基因，导致用其创制的诱导系诱导的单倍体的鉴定比较困难。


技术实现要素：

8.为此，本发明提供一种通过基因工程改造cenh3蛋白提高玉米单倍体诱导系诱导率的方法，以解决现有玉米单倍体诱导率提升缓慢、单倍体鉴定效率低、诱导系农艺性状差等问题。
9.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
10.根据本发明提供的一种通过基因工程改造cenh3蛋白提高玉米单倍体诱导系诱导率的方法，所述方法包括以下步骤：
11.步骤一，将玉米cenh3基因中n末端的序列替换为玉米h3基因的n末端序列，得初步改造基因1，再将基因1克隆到以ubiquitin(ubi)为启动子,且含有大分子量标签的植物过表达载体pcambia3301-rfp中，构建形成过表达着丝粒特异融合蛋白的载体ubi:m-tailswap-rfp，将该过表达载体转化到玉米受体中，得阳性转化株系lh244
m-tailswap-rfp
；
12.步骤二，将所述阳性株系与受体亲本玉米cau5进行杂交1代，随后以cau5为轮回亲本回交2代，接着再自交至少4代，最后形成具有高诱导率的新型单倍体诱导系。
13.进一步的，所述步骤一中，大分子量标签为rfp荧光蛋白。
14.进一步的，所述步骤一中，着丝粒特异融合蛋白具体为将玉米着丝粒特异组蛋白cenh3的n端氨基酸序列替换为玉米核小体组蛋白h3的n端氨基酸序列，并在cenh3蛋白的c端连接上大分子量荧光标签rfp的融合表达蛋白。
15.进一步的，所述步骤一中，转化采用的是农杆菌浸胚法。
16.进一步的，所述步骤一中，玉米受体株系采用的是lh244株系。
17.进一步的，所述步骤二中，受体亲本玉米为stock6来源的玉米单倍体诱导系cau5。
18.本发明的培育方法选用玉米cenh3的c端拼接玉米h3基因n端并连接荧光蛋白的目的是：h3与cenh3拼接形成的嵌合基因仍在着丝粒中特异表达，将其导入到玉米中，可以使荧光标记在细胞核中稳定表达。另外，由于拼接了h3蛋白n端序列的cenh3嵌合蛋白可能不具备与野生型cenh3蛋白完全一致的功能，且其c端融合了外源大分子荧光蛋白标签rfp，导致在其整合到着丝粒时，对着丝粒功能产生一定影响，在与来源于母本的天然cenh3蛋白竞争时，可能由于整合到着丝粒上的时间节点滞后，或是在竞争纺锤丝牵拉效率方面不及正常的母本中天然的cenh3蛋白，所以含有拼接cenh3融合蛋白(m-tailswap-rfp)的染色体更容易在有丝分裂中滞后而丢失。
19.本发明具有如下优点：
20.本发明的培育方法显著提高玉米单倍体诱导系的诱导率，带有荧光标记的玉米单倍体诱导系不仅可以作为单倍体诱导系，使后代中产生单倍体，还可稳定表达荧光融合蛋白，这就大大的简化鉴别过程；提高田间鉴别单倍体的效率并简化鉴别过程。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅
仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
22.本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
23.图1为本发明提供的一种将玉米cenh3蛋白的n端替换为玉米h3蛋白的n端，并在嵌合cenh3蛋白的c端连接红色荧光蛋白标签(rfp)的载体(ubi:m-tailswap-rfp)的构建示意图；
24.图2为本发明提供的利用h3的n端和cenh3的c端拼接后序列扩增引物对转基因系的鉴定结果；其中，泳道1和泳道2是lh244
m-tailswap-rfp
的两个阳性植株dna的生物学重复，泳道3是marker，最亮的条带指向750bp；
25.图3为本发明提供的利用实时荧光定量pcr(qrt-pcr)对lh244
m-tailswap-rfp
阳性过表达株系与对照系进行cenh3基因表达量比较；
26.图4为本发明提供的组配群体的流程图；
27.图5为本发明提供的将ubi:m-tailswap-rfp过表达载体通过回交选育导入到玉米cau5诱导系过程中，各世代单倍体诱导率的数据比较图；
28.图6为本发明提供的cau5与新选育的新型诱导系cau5
m-tailswap-rfp
的花粉活力染色图比较图；
29.图7为本发明提供的cau5与新选育的新型诱导系cau5
m-tailswap-rfp
的5种活力等级花粉的比例比较图；
30.图8为本发明提供的选育的新型荧光诱导系cau5
m-tailswap-rfp
与cau5的植株照片比较图。
具体实施方式
31.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.实施例通过改造玉米cenh3基因以提高玉米单倍体诱导系诱导率的方法
33.说明：
34.玉米cenh3基因核苷酸序列，见序列表《210》1，no.1 seq，2 ambystoma laterale x ambystoma jeffersonianum-1；由玉米cenh3基因核苷酸序列推导的氨基酸序列，见序列表《210》2，no.2 seq，2 ambystoma laterale x ambystoma jeffersonianum-2。
35.玉米histone3.2(h3)基因核苷酸序列，见序列表《210》3，no.3 seq，2 ambystoma laterale x ambystoma jeffersonianum-3；玉米cenh3拼接玉米h3基因核苷酸序列见序列表《210》4，no.4 seq，2 ambystoma laterale x ambystoma jeffersonianum-4。
36.玉米cenh3拼接玉米h3基因核苷酸序列，见序列表《210》5，no.5 seq，2 ambystoma laterale x ambystoma jeffersonianum-5；玉米cenh3拼接玉米h3基因推导的氨基酸序
列，见序列表《210》6，no.6 seq，2 ambystoma laterale x ambystoma jeffersonianum-6。
37.报告基因rfp的核苷酸序列，见序列表《210》7，no.7 seq，2 ambystoma laterale x ambystoma jeffersonianum-7；报告基因rfp推导的氨基酸序列见序列表《210》8，no.8 seq，2 ambystoma laterale x ambystoma jeffersonianum-8。
38.h3的n端和cenh3的c端拼接后序列扩增引物：
39.f:5'atggcccgcacgaagcaga3'(见序列表《210》9，no.9 seq，2 ambystoma laterale x ambystoma jeffersonianum-9)
40.r:5'cctcggggaaggacagcttc3'(见序列表《210》10，no.10 seq，2 ambystoma laterale x ambystoma jeffersonianum-10)
41.zmpla1-引物序列
42.f:5'acggaaggagtaagaggatgttt3'(见序列表《210》11，no.11 seq，2 ambystoma laterale x ambystoma jeffersonianum-11)
43.r:5'cggtagtccttcccgttcac3'(见序列表《210》12，no.12seq，2 ambystoma laterale x ambystoma jeffersonianum-12)
44.bar基因的引物
45.f:5'gcaaagtctgccgccttacaac3'(见序列表《210》13，no.13 seq，2 ambystoma laterale x ambystoma jeffersonianum-13)
46.r:5'tgttatccgctcacaattccacac3'(见序列表《210》14，no.14 seq，2 ambystoma laterale x ambystoma jeffersonianum-14)
47.(一)玉米h3基因的n端拼接cenh3基因的c端，再连接红色荧光蛋白(rfp)的载体构建图及构建方法
48.玉米h3的n端拼接玉米cenh3的c端，再连接红色荧光蛋白(rfp)的载体构建示意图如图1所示，具体操作步骤如下：
49.1.对玉米自交系b73植株的新鲜叶片进行取材提取总rna，并将总rna反转录为cdna；
50.2.据玉米h3基因n端序列设计特异引物，在正向引物前加入酶切位点xbai，在反向引物后加入酶切位点spei，并通过pcr方法对上述cdna利用该特异引物进行扩增，获得含有酶切位点的拼接h3基因的目的片段；根据玉米cenh3基因c端序列设计特异引物，在正向引物前加入酶切位点spei，在反向引物后加入酶切位点kpni，并通过pcr方法对上述cdna利用该特异引物进行扩增，获得含有酶切位点的拼接cenh3基因的目的片段；
51.3.利用限制性内切酶xbai/spei和spei/kpni对上述h3和cenh3基因片段分别进行双酶切，同时利用对应的限制性内切酶xbai/kpni对pcambia3301-rfp载体进行双酶切，并分别对各个基因片段和载体的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收；
52.4.将h3和cenh3的基因片段和pcambia3301-rfp载体的酶切回收产物，通过t4连接酶进行连接，随后将连接产物转化到大肠杆菌dh5α菌株中，通过pcr技术筛选含有连接产物的阳性单克隆；
53.5.将阳性的单克隆菌落进行扩增，并提取质粒，送至生物公司进行目的片段的测序，通过比对返回的测序结果，将含有所需的正确的目的基因片段的载体的菌液进行质粒提取，以供下一步遗传转化使用。
54.(二)转基因株系的获得
55.玉米的遗传转化采用的是农杆菌浸胚法，玉米受体株系采用的是lh244株系，具体操作流程如下：
56.1.将(一)中构建完成的载体质粒转入到农杆菌eha105菌株中，通过pcr技术筛选含有目的载体ubi:m-tailswap-rfp的阳性单克隆菌落，并将阳性农杆菌菌落进行扩繁。
57.2.选取自交授粉后10-12天的玉米lh244株系的果穗作为愈伤组织诱导的材料，在超净台对玉米果穗上的籽粒分离幼胚，将收集的幼胚暂存于高渗培养基中备用；
58.3.将含有目的载体ubi:m-tailswap-rfp的农杆菌菌液培养至od值等于0.8，离心收集菌体，并用含有乙酰丁香酮的重悬液重悬菌体，将上述收集的幼胚在农杆菌重悬液中浸泡5min，然后转移到共培养的培养基中，25℃暗培养7天；
59.4.将经过暗培养阶段的幼胚转移至含有抗性的梯度筛选培养基中，每两周转移一次，共筛选3轮；
60.5.将经过筛选并形成愈伤组织的幼胚转入分化培养基，培养2周获得再生植株；
61.6.将再生植株进行炼苗，随后转入大田或温室种植；
62.7.对大田或温室中的转化植株进行叶片取材，提取dna，利用pcr技术筛选含有目的载体ubi:m-tailswap-rfp的阳性转化植株；
63.8.提取阳性转化植株的叶片总rna，反转录为cdna，利用qrt-pcr技术，结合田间植株生长状态，筛选cenh3嵌合基因表达量高且植株生长状态良好的植株，并在开花授粉期对这部分选中植株进行自交，以获得纯合的转基因后代。
64.(三)高诱导率的新型玉米单倍体诱导系的构建过程
65.将鉴定为阳性的转基因株系自交三代稳定后，用诱导系cau5的花粉与转基因阳性植株和受体植株分别杂交授粉，对其后代f1、bc1f1、bc2f1、bc2f2、bc2f3和bc2f4世代分别统计群体诱导率的变化趋势及田间农艺性状。
66.在每代的选育过程中，通过分子标记辅助选择的手段，利用两对引物(h3的n端和cenh3的c端拼接后序列扩增引物和zmpla1-引物序列)，在后代株系中对玉米单倍体诱导基因位点zmpla1及玉米h3拼接cenh3的过表达载体(ubi:m-tailswap-rfp)进行筛选并保留，鉴定结果如图2所示；同时，在回交世代中，每一代均选择单倍体诱导率最高的株系进行回交，从而最终获得新型玉米单倍体诱导系cau5
m-tailswap-rfp
；构建过程如图4所示。
67.实验例1 pcr鉴定阳性植株的琼脂糖凝胶电泳
68.1.将得到的转基因系，利用bar基因的引物鉴定后的阳性植株，再次利用h3的n端和cenh3的c端拼接后序列扩增引物对阳性植株中的目标序列进行进一步的确定。
69.2.对转基因系和对照组中，基因的表达量进行了鉴定。鉴定方法为：
70.在田间取转基因系lh244
m-tailswap-rfp
及对照组lh244的叶片，在液氮中保存后提取总rna并反转录得到cdna。用oligo7软件设计引物，以actin基因为内参基因。实验中用到的tb green fast qpcr mix来自takara公司(货号：rr430s)，反应体系如表1所示：
71.表1反应体系
72.组分体积/μltb green fast qpcr mix15primer-f0.6
primer-r0.6cdna2h2o10.6dyeii1.2总体积30
73.荧光定量pcr仪器选用美国应用生物系统公司的abi7500。
74.反应程序为两步法pcr：95℃预热30秒；循环中程序为：95℃，15秒，60℃，33秒(收集荧光)，共设定40个循环。
75.相对表达量的计算方法：应用2-δδct
法，进行基因表达的相对定量。
76.将每份样品中的actin基因的表达量设定为1.0，与该样品中基因的相对表达量相减计算。每个样品做三次技术重复取平均值。
77.3.鉴定结果
78.结果如图2和图3所示，含有ubi:m-tailswap-rfp载体的阳性转化株系lh244
m-tailswap-rfp
可通过载体特异引物扩增得到约750bp大小的核酸电泳条带如图2所示，且阳性转化株系lh244
m-tailswap-rfp
的中cenh3基因表达量显著高于对照株系lh244如图3所示。
79.实验例2单倍体诱导率的计算方法及比较
80.1.单倍体的鉴定方法：
81.本实验中用到的鉴定单倍体的方法是通过颜色标记选择法，即通过识别籽粒上的r-nj标记来判断单倍体和二倍体。我们利用这个方法来测定新型诱导系和对照组的诱导率。具体的试验方法为：以新型诱导系cau5
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和对照组cau5
lh244-intergressed
分别作为父本，与常规系杂交种郑单958进行杂交时，在杂交果穗上会产生紫色胚乳紫色胚(二倍体)和紫色胚乳非紫色胚(拟单倍体)。由于颜色标记在有些籽粒上可能会不好辨认，所以对于鉴定到的拟单倍体会在下一季种下去，通过单倍体的田间表现筛选出实际单倍体的数目。
82.单倍体诱导率的计算方法：
83.某一诱导系诱导率＝该诱导系做父本时杂交果穗上检测到的单倍体籽粒数/杂交果穗上总籽粒数。
84.2.新型诱导系与对照组的诱导率比较图见图5所示，其中cau5
lh244-introgressed
株系为转基因受体株系lh244采用与拼接cenh3株系相同的育种策略进行回交选育所得。结果表明，新型诱导系cau5
m-tailswap-rfp
的单倍体诱导率从bc2f1代开始显著高于对照诱导系cau5
lh244-introgressed
；并且在进入自交世代(bc2f2)之后，新型诱导系cau5
m-tailswap-rfp
的单倍体诱导率提升速度更快，在bc4f4选育世代的群体诱导率达到约16.3％，比对照组显著提升约6.1％。
85.实验例3花粉活力的计算方法及比较
86.花粉活力计算方法与判定标准
87.配制浓度为1％的ttc溶液，取一颗成熟花粉，在载玻片上轻轻挤压出花粉内容物，悬空滴一滴ttc溶液，缓缓盖上盖玻片，37℃恒温箱中静置5分钟后，放在普通相差显微镜下观察。花粉的染色程度共分为5级：第一级为高活力，表现为大面积花粉被染成红色；第二级为中活力，表现为花粉中大面积为粉红色，染色强度中等的花粉；第三级花粉为低活力，表现为花粉中大面积为粉白色的花粉；第四级为没有活力的花粉，表现为全部为纯白色的花
粉；而第五级为败育的籽粒，如图7所示。分别统计诱导系cau5、及新型诱导系cau5
m-tailswap-rfp
的五种花粉所占的比例。每个系至少检测10株不同位置的花粉。ttc溶液的配方：称取1.0g氯代三苯基四氮唑溶于1000ml的纯水中，上下颠倒混匀后分装至1ml离心管中，用锡箔纸包好避光保存，且注意使用时避光。
88.cau5与新选育的新型诱导系cau5
m-tailswap-rfp
的花粉活力染色图比较，见图6所示；cau5与新选育的新型诱导系cau5
m-tailswap-rfp
的五种活力等级花粉的比例比较，见图7所示。结果表明，新型诱导系cau5
m-tailswap-rfp
的整体花粉活力显著低于其供体亲本cau5的花粉活力，尤其是cau5
m-tailswap-rfp
的花粉中的低活力花粉比例显著增加，这表明诱导系花粉的活力可能与单倍体诱导能力存在一定的相关性。
89.实验例4选育的新型荧光诱导系与cau5的植株照片比较
90.选育的新型荧光诱导系与cau5的植株照片比较表型图见图8所示。由图可见，本发明方法培育的新型单倍体诱导系cau5
m-tailswap-rfp
，除单倍体诱导率显著提升之外，其农艺性状也较其供体亲本cau5有明显改善，具有较高的植株株高和较发达的雄穗花序。
91.综上所述，本发明方法操作可行性高，技术方案成熟，并且能够在较短的育种周期内显著提高玉米单倍体诱导系的诱导率，该发明方法将有效改善当前玉米单倍体育种技术在生产实践中的工作效率，具有重要的指导意义。
92.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
93.94.95.96.97.98.99.100.101.102.