用于分析液体样品的方法和装置与流程

1.本发明涉及用于定量检测液体样品中分析物的存在或不存在的方法和装置，其具有改善的灵敏度、精度和总测定时间。具体地，本发明涉及用于定量检测血液样品中生物标志物的存在或不存在的方法和部件试剂盒(kit of parts)。


背景技术：

2.可以通过监测体液样品中存在或不存在特定分析物(诸如标志物或生物标志物)，特别是通过监测血液样品中存在或不存在特定分析物来监测许多疾病。
3.当监测此类疾病标志物时，用于分析的设备和方法的灵敏度、精度和总测定时间(tat)始终是重要的问题。
4.在用于分析诸如血液等液体的即时检测设备和方法中，使用大于50μl的样品尺寸在实践上是不可接受的。通常，样品尺寸被限制为存在于1-2滴血液中的液体的量，即，约40μl或20μl，或更少。当以这种小体积的样品工作时，用于分析的设备和方法的灵敏度、精度和tat变成非常重要的问题，而提高设备和方法的灵敏度、精度和/或tat的方式总是具有挑战性的。
5.以前，当分析少量的液体样品(例如血滴)时，已经以一系列不同的方式实现灵敏度、精度和tat的改善。
6.一些方法和设备聚焦于提供关于准确计量样品的改进，借此可获得更高的精度。该技术涉及使用具有多孔亲水性尖端的采样器，其使得能够收集小的、准确的和精确的血液体积。收集过程通常花费大约2-4秒，而不管hct水平如何。干燥后，可存储、运输或直接分析样品。由于其简单性和成本效益，该技术越来越受关注。该技术的目的是通过提供固定体积的血液样品并以最少的指令促进自采样来提高测试可靠性。
7.其它则聚焦于提供能够准确地混合特定样品的成分和检测要素(荧光团、透射、吸光度等)的改进的方法和设备，由此可以获得增加的灵敏度和精度。
8.其它方法聚焦于改进用于分析的样品材料的品质(例如，通过去除样品的不期望的成分)。然而，对存在于液体样品中的特定分析物的准确分析代表了本领域中普遍存在的问题，尤其是对于用于即时家庭应用的方法和设备。
9.因此，本发明的一个目的是基于光学测量来改善现有装置和方法的灵敏度、精度和tat，所述光学测量能够定量检测液体样品(例如包含小于50μl的液体样品)中的一种或多种分析物的存在或不存在。
10.基于光学的方法应理解为依赖于光学测量系统的方法，其中电磁辐射源照射存在于容器(例如，比色皿)中的液体样品，随后监测来自比色皿中的样品的电磁辐射的吸收和/或发射。


技术实现要素：

11.根据本发明的一个重要的改进在于，进入分析程序的样品的计量和引入专门通过
利用毛细管力来执行。
12.发明人体会到，通过在即时检测装置中手动地计量样品材料和使用外力来施加样品的任何步骤将不可避免地导致测定不准确性的增加，并且对于提供精确和可靠的测定结果带来问题。该问题通过专门经由毛细管力计量样品材料来解决。
13.在本发明的一个非常优选的实施方式中，通过使用容器收集计量的量的液体样品来进行计量，所述容器能够通过毛细管力从较大的液体样品中容纳和收集计量的量的样品，随后使填充样品的容器与能够容纳至少计量的量的样品的过滤材料接触，并且随后使含有样品的过滤材料与分析反应液接触。
14.因此，在一个非常优选的方面，本发明涉及一种用于测量液体样品中分析物的量的方法，该方法包括以下步骤：
15.a.提供一组部件，其包括：
16.i.用于收集液体样品材料的容器，
17.ii.过滤材料；和
18.iii.包含反应液体的检测装置；
19.b.向所述容器中添加计量的量的液体样品材料；
20.c.将计量的量的液体样品材料从所述容器转移至所述过滤材料；
21.d.使含有计量的量的样品材料的过滤材料与反应液体接触，并混合反应液体和过滤材料，从而获得检测液体，
22.e.测量通过检测液体的一个或多个波长处的电磁辐射的透射和/或来自检测液体的一个或多个波长处的电磁辐射的发射；
23.f.通过将在步骤e中获得的结果与内部标准进行比较来检测样品中分析物的量。
24.该方法的特征在于，在步骤c中通过使用毛细管力将计量的量的样品从所述容器转移至所述过滤材料。
25.本发明体现在下面在实施例中使用的egoo装置胶囊中。根据下面的实施例，本发明的技术益处是显而易见的。
26.定义
27.在本发明中，词“过滤器”和“膜”用作同义词。在本发明的上下文中，过滤材料意指任何市售的过滤(膜)材料，例如fusion 5或whatman903，或任何其他能够容纳和被动保留一定量的液体材料的亲水性过滤材料，并且还能够将液体样品分离成液相(例如血浆或血清)和保留物相(例如血细胞)，即保留特定样品的某些组分(例如血细胞、细胞膜组分或高分子量物质)。优选的过滤材料是“fusion 5”，其是单层基质膜过滤器，其可用于替换来自侧向流测试试剂盒的传统模块化部件。
28.优选地，过滤材料用作直径小于50mm的扁平圆盘。甚至更优选的是，根据本发明的过滤材料的直径小于10mm，例如小于5mm，或者小于3mm或甚至小于2mm。在最优选的方面，过滤材料具有5mm以下的直径。
29.在本发明中，词语“容器”意味着包括能够容纳液体样品的隔室，例如管或移液管等。优选地，容器是能够通过毛细管力抽出计量的量的样品的中空圆柱体。
30.精度
31.分析过程的精度表示在规定条件下从均匀样品的多次采样获得的一系列测量之
间的一致性(散射程度)的接近度。可以以三个水平考虑精度：1)可重复性，2)中间精度，以及3)再现性。可重复性表示在短的时间间隔内的相同操作条件下的精度。可重复性也被称为测试内精度。中间精确度表示实验室内变化：不同的天数、不同的分析师、不同的设备等。再现性表示实验室之间的精度(协作研究通常应用于方法的标准化)。应该使用均匀的、真实的(全尺寸)样品来调查精度。然而，如果不可能获得全尺寸样品，则可以使用先导规模或实验室规模的样品或样品溶液对其进行研究。分析过程的精度通常表示为一系列测量的方差、标准偏差或变化系数。
32.准确性
33.准确性是系统误差的描述、统计偏差的度量，因为这些导致结果与“真”值之间的差异。在最简单的术语中，给定来自相同数量的重复测量的数据点的集合，如果所述值彼此接近，则可以说所述集合是精确的，而如果所述集合的平均值接近所测量的量的真值，则可以说所述集合是准确的。准确性和精度的概念彼此独立，因此可以说特定的一组数据是准确的或精确的，既准确又精确，既不准确也不精确。
34.样品的计量
35.常规地，液体样品的精确计量和其精确添加到测定试剂是由实验室技术人员在临床环境中使用临床移液设备来执行的。然而，这在即时设施中是不可行的。因此，已经设计和销售一次性使用的移液管，其能够通过毛细管力从较大的源取出和容纳精确的样品体积。这样的移液管被设计成当用户按压移液管的主体端时释放样品，同时在其中阻挡空气孔，从而迫使所计量的液体样品离开移液管。
36.然而，在获得本发明的研究期间，发现对这些移液管的主动处理(例如，根据预期用途进行处理，其中用户按压移液管的主体端，同时阻挡气孔)会导致所提供的计量样品的测量的严重不准确性。
37.因此，发现必须仅通过毛细管力从移液管中收回样品材料。这是通过引入从计量移液管抽出计量的量的样品的过滤材料来实现的，此后对包含样品的过滤材料进行进一步的测定操作。
具体实施方式
38.在本发明的一个方面，令人惊讶地发现，通过将含有计量的量的样品的过滤材料直接添加到检测液体(或使其与分析液体接触)，而将液体样品材料添加到检测测定中，在准确度和精度方面产生了显著优异的结果。
39.此外，可以添加精确计量的量的样品，同时提供对样品的期望纯化，因为过滤材料能够扣留某些样品污染物。
40.因此，本发明的要点依赖于计量样品并通过毛细管力在测定室之间转移样品。
41.在本发明的一个实施方式中，如下面描述的egoo检测系统所执行的，使过滤器(包含经计量的样品)与胶囊的主比色皿中的液体接触，并且通过振荡混合动作简单地从过滤器中去除样品成分，由此过滤材料排空产生检测液体的样品成分。在egoo胶囊中，通过穿透相应隔室的foal密封分离使过滤材料与主比色皿中的液体接触，随后通过将检测液体涡旋而将包含在过滤材料中的样品材料释放到测定溶液中，由此释放整个计量的量的样品，从而产生检测液体。
42.因此，在一个方面中，本发明涉及一种测量液体样品中分析物的量的方法，所述方法包括以下步骤：
43.a.提供一组部件，其包括：
44.i.用于收集液体样品材料的容器(例如能够计量精确体积的液体样品的移液器)，和
45.ii.过滤材料；
46.iii.包含反应液体的检测装置；
47.b.向所述容器添加计量的量的液体样品材料；
48.c.将计量的量的液体从所述容器转移至所述过滤材料；
49.d.使含有经计量的样品材料的过滤材料与反应液体接触，并混合所述液体和过滤材料，从而提供检测液体，
50.e.测量通过检测液体的一个或多个波长处的电磁辐射的透射和/或来自检测液体的一个或多个波长处的电磁辐射的发射；
51.f.通过将在步骤e中获得的结果与内部标准进行比较来检测样品中分析物的量。
52.该方法的特征在于，在步骤c中通过使用毛细管力将计量的量的样品从所述容器转移至所述过滤材料。
53.最初推测，通过使用能够仅包含精确计量的量的样品材料的过滤材料，可以获得精确的计量。然而，发现这不是可行的。相反，发现有必要在过滤材料中具有过量的容量，并通过计量容器进行对样品的计量。因此，在本发明的一个高度优选的方面中，在步骤b中，过滤材料能够包含比添加到容器中的计量的量的液体样品材料更多的液体。
54.还令人惊讶地发现，将过滤材料定位成使得过滤材料中的纤维平行于液体样品流出容器的流动方向，可增强液体样品材料从容器到过滤器的有效和准确的转移。
55.此外，在一个实施方式中，本发明包括用于执行上述方法的部件试剂盒。所述部件试剂盒包括：
56.i.容器，其用于通过毛细管力收集计量的量的液体样品材料；
57.ii.过滤材料，其能够通过毛细管力从所述容器中收集计量的量的液体样品材料；以及
58.iii.检测装置，其包含反应液体。
59.所述部件优选还包括：
60.iv.检测组件，其包括电磁辐射源、用于检测电磁辐射的单元、以及用于接收包含液体样品的检测装置的单元。
61.v.用于在检测组件的圆形或椭圆运动时提供快速振荡的单元。
62.根据本文所述的发明，任何光学方法可最终用于检测样品中分析物的存在。这些方法包括分析的光谱法和分光光度法。分光光度计的使用跨越各种科学领域，例如物理、材料科学、化学、生物化学和分子生物学。
63.光谱法和分光光度法通常用于定量测量材料(分析物)的吸收、反射和/或透射性质，其作为样品吸收/发射的光的波长的函数。这些技术的使用在本领域中是公知的。
64.吸收光谱法是指由于其与样品的相互作用而测量作为频率或波长的函数的辐射吸收的光谱技术。样品从辐射场吸收能量，即光子。吸收的强度作为频率的函数而变化，并
且该变化是吸收光谱。吸收光谱是跨电磁光谱执行的。
65.吸光度光谱法(通常称为分光光度法)是基于在给定波长下测量由样品吸收的光的量的分析技术。光谱测定法，特别是在电磁光谱的可见光和uv部分中的光谱测定法，是化学和生命科学中最通用和广泛使用的技术之一。吸收光谱用作分析化学工具，以确定样品中特定物质的存在，并且在许多情况下，定量存在的物质的量。红外和紫外可见光谱在分析应用中特别常见。在分子和原子物理、天文光谱和远程感测的研究中也采用吸收光谱法。
66.存在用于测量吸收光谱的广泛的实验方法。最常见的布置是在样品处引导所生成的辐射束并且检测穿过其的辐射的强度。透射的能量可用于计算吸收。源、样品布置和检测技术根据实验的频率范围和目的而显著变化。
67.荧光光谱法是快速、简单且廉价的方法，以基于荧光性质确定溶液中分析物的浓度。它可以用于相对简单的分析，其中待分析的化合物(分析物)的类型是已知的，例如以执行定量分析从而确定样品中分析物的浓度。荧光主要用于测量溶液中的化合物。
68.在荧光光谱中，电磁波穿过比色皿中的溶液，并且样品中的分析物吸收来自光束的能量。该能量作为具有不同波长的电磁束(光)发射。由样品吸收和发射的光的量与样品中分析物的存在成比例。在荧光光谱法中，可以测量激发光谱(由分析物吸收的光)和/或发射光谱(由离开的分析物发射的光)。分析物的浓度与发射的强度成正比。
69.比浊法是测量由于悬浮在其中的颗粒的散射效应而导致的透射光的强度损失的过程。光穿过滤光器，产生具有已知波长的光，然后使其穿过含有测定溶液的比色皿。光电检测器收集穿过比色皿的光。然后给出吸收光的量的测量值。
70.免疫比浊法是临床化学广泛诊断领域中的重要工具。它用于确定用经典临床化学法不能检测到的蛋白质。免疫比浊法使用经典抗原-抗体反应。抗原-抗体复合物是可通过光度计光学检测的颗粒。更详细地，将液体样品添加到缓冲液中，并与针对结合于胶乳的分析物的单克隆抗体的悬浮液混合。分析物与结合于胶乳的抗体结合，并凝集。由颗粒尺寸的增加引起的光散射用作分析物浓度的量度。光散射的量与样品中分析物的浓度成比例。
71.当执行光学检测法时的一般程序
72.常规地，光学检测方法依赖于将液体样品直接引入到容器(例如，“比色皿”)中并测量由样品的存在产生的光信号的变化。通常，容器在引入样品之前含有无样品的液体。反应液体可含有某些试剂，所述试剂可与样品中的分析物相互作用以在分析物存在下产生信号。或者，在引入样品之后添加这样的试剂。容器可以例如在某些方法中包含荧光团，在容器中的液体到达时，荧光团可以被溶解。
73.可执行样品空白测量以提供背景参考。执行背景测量以便校正用于非特定信号(“噪声”)的样品测量以及系统(例如，容器)对信号的影响，所述非特定信号是由除检测液体中的分析物之外的其它成分产生的信号。非特异性信号可以例如由影响经过滤血浆/血清的品质的血液溶血产生。因此，所产生的方法包括通过测量在时间t0时通过第一液体的一个或多个波长下的电磁辐射的透射和/或发射来提供样品空白测量的步骤。
74.在这方面，在引入样品之前测量t0测量值，或者可选地，在引入试剂之前(或紧接之后)引入试剂，从而提供来自样品的辐射的透射/发射的定量变化，并且提供由样品中的背景产生的信号。可执行重复测量以便增加空白测量的精度。
75.所引入的样品/试剂改变通过检测液体的一个或多个波长下的电磁辐射的透射或
发射，并且改变程度反映所引入的样品中分析物的存在程度。换句话说，样品/试剂的引入在可检测的基于辐射的信号中产生改变，并且改变与存在的样品量(例如，通过使用具有已知样品浓度的内部标准确定)定量地成比例。
76.在将样品引入试剂后，必须彻底混合所产生的检测液体的成分，以便产生准确且精确的样品测量。
77.本发明的优选实施方式
78.在一个实施方式中，利用如下面更详细描述的egoo装置来执行本发明。
79.egoo装置
80.egoo装置是能够执行本发明的微型光机电装置。整个egoo装置由光学单元和用于测量人类血液中生物标志物的egoo胶囊组成。一次性测定胶囊含有用于进行测定的所有测定试剂。将测定胶囊插入egoo装置中，然后自动进行测定。
81.实质上，egoo装置由检测组件组成，所述检测组件由光源和检测器组成，所述检测器定位成使得测定比色皿可放置在光源与检测器之间。egoo装置还包括用于当将egoo胶囊添加到组件时涡旋整个检测组件的单元。egoo装置补充有包含测定比色皿的胶囊和包含可添加液体样品的过滤材料的单独腔室。
82.因此，egoo装置是被设计用于由未体验用户使用的即时检测应用的部件试剂盒。
83.部件试剂盒包括测量装置和用于接收样品材料的胶囊。
84.egoo光学单元
85.egoo光学单元包括传统光学测量系统，其包括：包括电磁辐射源的“检测组件”，用于检测电磁辐射的单元，以及用于接收包括液体的容器(“比色皿”)的单元，所述单元和容器定位在电磁辐射源和检测单元之间，使得电磁辐射从电磁辐射源通过液体照射到检测单元。在接收包含样品液体的容器之后，与仅包括液体的容器的振荡是标准的常规装置和方法相反，所述装置能够使整个光学测量系统(检测组件)经受振荡运动(“涡流”)。
86.位于检测组件内部的光学系统由两个光路组成。在光路1中，使用led570nm作为光源和光电二极管1作为测量吸光度信号的检测器在570nm处测量透射率。在光路2中，光源是led390，并且光电二极管1是用于测量荧光信号的检测器。
87.egoo胶囊
88.egoo胶囊包括主比色皿(有时称为反应室)以及单独的隔室。
89.一个隔室(隔室1)包括亲水性过滤材料，所述亲水性过滤材料能够容纳(至少)对应于计量的量的样品材料的一定量的液体。
90.其它隔室是含有测定试剂的流体填充容器(隔室2-4)。此外，胶囊包含柱塞/密封件破碎器(seal breakers)，柱塞/密封破碎器可被激活，使得来自每个隔室的试剂或材料可在液体不可渗透密封件破裂之后与主比色皿中的液体流体连通，和/或通过经由密封件注入比色皿中而进入主比色皿。
91.样品材料
92.优选地，液体样品是由小于40μl的液体组成的样品。这样的样品尺寸对于自动化的方法和设备是相关的。更优选地，液体样品是由小于20μl的液体组成的样品。这样的样品尺寸对于即时检测设备和方法是相关的。
93.在高度优选的实施方式中，待分析的样品是血液样品。在一个优选实施方式中，血
样是全血。在另一优选实施方式中，血液样品是血浆样品。
94.混合
95.在上述方法中，非常优选的是，通过以至少1000rpm的速度以圆形的椭圆运动快速振荡检测液体离子，从而执行检测液体的内容物的混合。优选地，通过以圆形的椭圆运动(涡旋)快速(1000至4000rpm)振荡检测液体来进行混合。
96.电磁辐射源
97.检测组件包括电磁辐射源，电磁辐射源被定义为发射电磁辐射的单元。相关电磁辐射原则上可以是任何合适的波长。然而，优选波长为300nm至900nm的电磁辐射。
98.用于检测电磁辐射的单元
99.分析物检测组件包括用于检测电磁辐射的单元，用于检测电磁辐射的单元被定义为用其检测电磁辐射(即，被吸收并转换为电能)的装置。待检测的相关电磁辐射原则上可以是任何合适的波长。然而，鉴于由源发射和/或由样品发射的电磁辐射，待检测的电磁辐射必须是合适的。
100.分析物
101.通常，本发明的方法和设备可用于测量临床化学、癌症诊断和所有其他相关诊断领域内的所有血液生物标志物。
102.然而，本发明的方法和设备优选地用于检测以下血液标志物(分析物)中的一种或多种：苯丙氨酸(苯丙酮尿症患者)、crp、hs-crp、脂质组(炎症和心血管血管疾病生物标志物)、脂质分布(总胆固醇、hdl和甘油三酯)、hba1c(糖尿病生物标志物)、alat(肝脏生物标志物)、维生素d和d-二聚体。
103.在本发明的优选实施方式中，反应液体包含与样品中存在的分析物结合的物质，例如用于hba1检测的荧光团曙红-硼酸。
104.实施例
105.以下实施例的目的是描述本发明和使用所描述的发明比较测定精度，％cv(标准偏差/平均值*100)。
106.在实施例1中，在用于计量和收集样品的精确研究中测试五种不同的方法-其中之一是根据本发明的方法。
107.在实施例2中，使用所描述的发明和现有的标准方法，收集和分析血液样品中的苯丙氨酸，从而测试关于血液样品的苯丙氨酸测定的精度。
108.在实施例3中，使用所描述的发明或替代方式，进行计量和血液收集过程，从而测试关于血液样品的血红蛋白测定的精度。
109.本发明可以在egoo装置上执行
110.实质上，egoo装置由检测组件组成，所述检测组件由光源和检测器组成，所述检测器定位成使得测定比色皿可放置在光源与检测器之间。egoo装置还包括用于当将egoo胶囊添加到组件时涡旋整个检测组件的单元。egoo装置补充有包含测定比色皿的胶囊和包含可添加液体样品的过滤材料的单独隔室。
111.实质上，egoo装置由检测组合件组成，所述检测组合件由光源和检测器组成，所述检测器经定位以使得测定比色皿可放置在光源与检测器之间。egoo装置还包括用于当将egoo胶囊添加到组件时涡旋整个检测组件的装置。egoo装置补充有包含测定比色皿的胶囊
和包含可添加液体样品的过滤材料的单独腔室。在egoo装置的操作期间，可以将过滤材料(和试剂)从单独腔室转移至测定试管，由此可以针对在装置的操作期间吸收和/或发射电磁辐射而测定样品材料和试剂。
112.更精确地说，egoo胶囊由样品注射器隔室r1、流体室r2、r3和主比色皿r4组成。取决于相关的测定，egoo装置可将r1、r2和/或r3的组分添加到主比色皿(r4)。
113.实施例1.用于计量和收集样品的精确性研究
114.为了探究所描述的发明，指示五个用户以五种不同的方式执行样品收集和计量过程。每个计量过程由用户重复十次。使用蓝色染料作为样品材料。所用的膜是由聚乙烯和聚丙烯材料的混合物组成的porex r34436。
[0115][0116]
表1.五种计量和收集方法
[0117]
使用的试剂和材料
[0118]
egoo胶囊
[0119]
egoo胶囊由样品注射器隔室r1、流体室r2、r3和主比色皿r4组成。根据相关的测定，egoo装置可将r1、r2和/或r3的组分添加到主比色皿(r4)。
[0120]
计量移液管
[0121]
使用15μl pts收集毛细管(ce标记)。这些移液管是设计用于收集和转移15μl样品
的一次性移液管。移液管由毛细管组成，该毛细管包含在15μl处的毛细管止挡件，以及在移液管末端上的小本体，其被按下(同时阻挡空气孔)以释放所收集的样品。移液管末端上的主体部分还包含小孔，该小孔允许空气逸出，由此毛细管力可将15μl样品拖入移液管中(直到毛细管止挡件)。在预期使用期间，用户通过使样品与移液管的端部接触来收集15μl样品，由此15μl的蓝色染料通过毛细管力进入移液管。此后，在预期使用期间，用户通过用手指阻挡移液管的本体部分中的孔并按压移液管的本体部分来释放样品。
[0122]
染料
[0123]
溴苯酚蓝溶液(0.04重量％水溶液。sigma-aldrich 313744批次mkcd9662
[0124]
测试程序
[0125]
1.将15μl蓝色染料添加到上述表1中所述的血液计量转移移液管中。
[0126]
2.每个人在1小时内执行每个方法10次。
[0127]
3.通过测量时间t0的吸光度来进行样品空白测量。
[0128]
4.将15μl溴苯酚蓝色溶液(0.04重量％水溶液。sigma-aldrich 313744批次mkcd9662)通过表1中概述的五种不同程序添加到egoo phe胶囊中。
[0129]
5.使用振荡(涡旋)移动将蓝色染料与r1试剂混合。
[0130]
6.在t1，进行吸光度测量，并且结果计算为吸光度＝2-log(t1/t0.x100)
[0131]
7.％cv计算为标准偏差/平均值*100。
[0132][0133]
表2.每个人执行三种不同的方法的精度结果。由于方法4和5不适合于即时检测分析并且需要使用移液管进行一些训练，因此仅实验室技术人员执行该方法。
[0134]
讨论
[0135]
实施例1的目的是探究使用所描述的发明将计量的量的蓝色染料转移至egoo胶囊上的收集膜的可能性，并将所描述的发明与四种其它方法进行比较。
[0136]
低％cv值指示所测量值倾向于接近数据集的平均值(也称为预期值)，而高％cv值指示所述值在较宽范围内展开。
[0137]
如可以观察到的，使用根据本发明的方法3(通过未经训练的即时检测用户)的精度与由经训练的实验室技术人员使用经校准的移液管获得的精度相当(方法4和5)。还可以观察到，将任何种类的主动压力施加到转移移液管(方法1和2)在由即时检测用户执行时导
致显著增加的％cv值，并且即使当程序(方法1和2)由熟练的实验室技术人员执行时，也观察到实质上增加的％cv值。
[0138]
实施例2.在苯丙氨酸测定中，将根据本发明的样品计量和转移方法的精度与现有的用于计量和转移血液样品的标准方法进行比较。
[0139]
实施例2的目的是探索将众所周知的基于荧光的苯丙氨酸(phe)测定与所描述的发明整合在一起的可能性，并将该设置与收集和计量家庭收集的血液样品的标准方法进行比较。
[0140]
苯丙酮尿症(pku)是由肝苯丙氨酸羟化酶(pah)活性的缺乏引起的常染色体隐性遗传病症。在高加索人群体中，约50分之一是携带者，而10.000分之一受到pku的影响。由于pah缺乏，苯丙氨酸不被转化为酪氨酸氨基酸。这导致过量的phe和毒性代谢物积聚在身体的所有部分中，包括脑、血液中和尿液中。这些过量产生导致各种程度的精神延迟的化学不平衡。在过去十年期间，若干供应商已经测试了各种测定方法以鉴定用于在家测量phe水平的最佳方法，即必须与在家测量患有糖尿病的人的血糖相当的方法。不幸的是，与葡萄糖(mm)相比，苯丙氨酸分子在血液(m)中的存在浓度低500-1000x。到目前为止，鉴定基于家的方法的所有尝试都已经致力于与测定相关的参数，例如测定灵敏度、测定精度、测定稳定性、测定比较和测定复杂性。本发明在克服上述测定相关的挑战方面已成功。
[0141]
使用本发明，与现有技术的基于实验室的设备相比，可以在用户家中在小型egoo poc装置中执行这样的phe测定，并具有相同或甚至更好的分析性能。
[0142]
phe测定原理
[0143]
苯丙氨酸测定使用了荧光茚三酮测定方法。测定程序是对由mccaman和robin,lab clin.med 59,第885-890页在1962年首次公布的荧光测定程序的改进。该测定基于旨在定量测定血液中phe的化学方法。
[0144]
根据本发明的phe测定程序的概述
[0145]
如实施例1、方法3所述，将精确体积的毛细管血液(15μl)从手指转移至血液计量转移移液管。将血液计量转移移液管插入到egoo胶囊的胶囊入口中，在此使其与膜材料(whatman-903)接触。当计量转移移液管与膜材料物理接触时，血液从移液管中的毛细管通道被动地流入膜材料中。在干燥时段之后，将膜注入到主比色皿中，其中通过使用提取溶液(r1)和在egoo装置内的比色皿的振荡(涡流)移动从膜中提取氨基酸苯丙氨酸(和所有其它氨基酸)。接下来，将r2试剂注入到主比色皿中并混合。在48℃(45-80℃)下温育后，phe现在形成具有茚三酮的荧光化合物。二肽l-亮氨酸-l-丙氨酸的存在极大地增强了荧光响应和特异性。反应期间的ph由琥珀酸缓冲液严格地控制在5.8 /-0.1，以使特异性最大化。在茚三酮反应之后，通过将r3溶液注入到主比色皿中而将ph调节到＞8.0，以进行最佳荧光检测。在激发波长为390nm的情况下，以450nm测量荧光分子。
[0146]
phe测定试剂
[0147]
r1：含有膜的样品注射器
[0148]
r2：70mm茚三酮水溶液。
[0149]
r3：0.3m na2hpo4，0.05m naoh，ph＝11.5。
[0150]
r4：70％乙醇，0.2m琥珀酸缓冲液ph4.9，0.4％nacl，10mm l-亮氨酸-l-丙氨酸。
[0151]
egoo胶囊由样品注射器隔室r1、流体室r2、r3和主比色皿r4组成。取决于相关的测
定，egoo装置可将r1、r2和/或r3的组分添加到主比色皿(r4)。
[0152]
程序1.本发明中描述的血液计量和收集。在计量血液并将血液添加到测定胶囊之后，由egoo装置进行所有测定步骤。
[0153]
1.将15μl的全血添加到如实施例1、方法3所述的血液计量转移移液管中。
[0154]
2.将计量转移移液管插入到egoo phe胶囊的入口中。
[0155]
3.当计量转移移液管与r1中的whatman903膜材料物理接触时，血液被动地流入膜材料中，如实施例1、方法3中所述。在血液转移之后，丢弃计量转移移液管。
[0156]
4.血液转移至whatman-903膜后，将过滤器干燥3小时。
[0157]
5.在干燥之后，将来自r1的血膜注射到主比色皿中，其中提取溶液(r4)与振荡(涡旋)运动的结合将phe分子(和其它氨基酸)提取(释放)到提取溶液(r4)中。
[0158]
6.将r2试剂注入到主比色皿中，并引发荧光测定。
[0159]
7.通过测量时间t0的荧光进行样品空白测量。
[0160]
8.将测定混合物在48℃下温育30-90分钟。
[0161]
9.将r3试剂注入到主比色皿中，以将ph调节到＞8.0，以用于荧光增强。
[0162]
10.接下来进行t1荧光测量，并计算结果t1/t0。
[0163]
11.最后，通过使用校准曲线将原始荧光数据转化为最终phe浓度来计算phe浓度。
[0164]
程序2.金标准参考血液计量和收集。在计量血液和将血液添加到测定胶囊之后，由egoo装置进行所有测定步骤。
[0165]
在程序2中，使用标准血斑点(dbs)收集卡来收集血液。切掉血液填充膜材料的限定区域的样品(使用为该任务设计的切割装置“冲压出”)。将切割的(计量的)膜插入到egoo胶囊装置中。所有其它测定步骤均由egoo装置进行。(在常规程序中，在家中在将血液收集在dbs收集卡上之后，将卡邮寄给医院的中央实验室，其中受过培训的人员切除限定的区域，从而计量样品。
[0166]
程序2由以下步骤组成：
[0167]
1.将来自指尖的全血添加到whatman dbs血液收集卡(whatman903膜)，使用约4x70μl的血液，需要手指的强烈按摩以便产生所需量的血液。
[0168]
2.将过滤器干燥3小时(在常规使用期间，该卡片邮寄到医院实验室)。
[0169]
3.从含有血液的膜切出限定的膜区域。
[0170]
4.将含有血液的膜插入到egoo胶囊中，并且如上文所述在程序1中从步骤5开始使用egoo装置。
[0171]
结果
[0172]
确定以下分析性能特性测试：
[0173]
精度
[0174]-内精度(intra precision)研究(内部可变性)
[0175]-间精度(inter precision)研究(之间可变性)
[0176]
在两个程序中，测定含有约50μm和500μm苯丙氨酸的血液样品(血液样品1和血液样品2)。
[0177]
内精度.单个操作者在单个系列的phe测量(程序1或程序2)内在单个装置上经历的可变性。
[0178]
结果示于下表3中：
[0179][0180]
表3.用于phe测定的内精度研究。使用一个egoo装置n＝2x(2x15)＝60次运行，总共phe 60以两种浓度运行。
[0181]
间精度研究.间精度是在几天、不同仪器和不同操作者之间的实验室内的变化。
[0182]
结果示于下表4中。
[0183][0184]
表4.程序1和程序2之间的间精度
[0185]
讨论
[0186]
实施例2的目的是探索将众所周知的基于荧光的phe测定与所描述的发明整合在一起的可能性。结果表明，基于所描述的发明的装置表现出与使用dbs收集卡的标准方法相当(或更好)的优异性能。
[0187]
如可以观察到的，与使用dbs收集卡收集和计量血液，然后在egoo装置上进行相同phe测定法相比，使用本发明的内精度和间精度显著改善。
[0188]
与标准收集和计量法相比显著更好的精度的原因可能是，根据本发明的计量与通过切割限定的膜区域进行计量(标准方法)相比，血液的计量更精确。
[0189]
总之，可以观察到，在精度方面，与众所周知的标准dbs收集卡方法相比，phe测定给出了显著更好的测定结果。
[0190]
实施例3.与执行计量和血液收集方法的替代方式相比，使用本发明的血红蛋白测定的精确度
[0191]
在实施例1中，使用五种不同的方法来计量样品和将其收集到egoo胶囊中。在实施例3中，使用血液和众所周知的血红蛋白测定重复这五种方法中的四种最好方法(方法2、3、4和5)。各计量过程使用四种方法和两种hb浓度重复10次。
[0192][0193]
表5.四种计量和收集方法，由于在实施例1中获得的数据的精度非常低，因此略去实施例1的方法编号1。
[0194]
血红蛋白测定原理
[0195]
血红蛋白是常规诊断参数。
[0196]
在该实施例中，使用众所周知的利用不含氰化物的十二烷基硫酸钠(sls)的sls血红蛋白检测方法。试剂裂解样品中的红细胞和白细胞。化学反应开始于改变球蛋白，然后氧化血红素基团。此后，sls的亲水基团可以结合到血红素基团并且形成稳定的彩色复合物(sls-hgb)，其使用光度测量法进行分析。
[0197]
在egoo装置中，发出单色光且通过移动穿过混合物光的led(570nm)被sls-hgb复合物吸收。吸光度通过光传感器测量并且与样品的血红蛋白浓度成比例。
[0198]
hb测定过程的总结
[0199]
将精确体积的毛细管血液(15μl)从指尖转移至血液计量转移移液管。将血液计量转移移液管插入到胶囊入口中并通过主动过程(参考方法2和4)或被动转移(根据本发明的方法3)转移至过滤器中或直接转移至测定比色皿中(参考方法5)。当血液平行于纤维进入膜时观察到方法3中的优异结果。此外，观察到当膜紧密地堆叠在一起时观察到优异的结果。将血液填充的膜注射到主比色皿中(方法2、3和4)，其中使用涡流运动立即从膜中提取血液。hb现在形成sls-hgb复合物，其在与r1试剂温育2分钟后可以在570nm测的。
[0200]
血红蛋白测定试剂
[0201]
r4：市售sls血红蛋白检测试剂(sysmex)。
[0202]
测定过程
[0203]
1.将来自手指针刺的15μl的全血添加到血液计量转移移液管中。
[0204]
2.将计量转移移液管插入到egoo hb胶囊的入口中，其中计量转移移液管与膜材料物理接触(方法2、3和4)。血液通过表5中的3种方法进入膜材料。在血液转移之后，丢弃计量转移移液管。
[0205]
3.通过测量时间t0的吸光度而进行样品空白测量。
[0206]
4.在血液转移至r1上的膜之后，将血液注入到主比色皿中，其中使用振荡(涡旋)运动将血液与r4试剂混合。在方法5中，直接在此时添加血液。
[0207]
5.2分钟后，进行t1吸光度测量，并计算结果t1/t0。
[0208]
6.最后，通过使用校准曲线将原始吸光度数据转化为最终hb浓度来计算hb浓度。
[0209]
分析性能特性
[0210]
内精度.内精度是单个操作者在单个系列的血红蛋白测量中在单个装置上经历的可变性。
[0211]
结果
[0212]
结果示于表6中。用于血红蛋白测定的内精度研究。
[0213]
使用四种方法和两种hb浓度运行10个hb测定。
[0214]
总计4x2x10＝80个hb分析在egoo上运行。
[0215][0216]
表6.方法1；方法2和方法4之间的可重复性。
[0217]
讨论
[0218]
实施例3的目的是探索将众所周知的基于吸光度的hb测定与本发明整合在一起的可能性。
[0219]
如表6中可以观察到的，使用所描述的发明的精度(方法3)与由经训练的实验室技术人员利用经校准的移液管执行的过程相比是相当的(或更好的)。还可以观察到，将任何种类的主动压力施加到转移移液管导致显著增加的％cv值(方法2)。