一种大观霉素的提取纯化方法与流程

1.本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种大观霉素的提取纯化方法。


背景技术：

2.大观霉素(spectinomycin)又称奇美霉素或壮观霉素，一种碱性水溶性抗生素。这是一族由氨基环醇为主体和氨基糖术类以忒键结合而成的抗生素。可以用于对于庆大霉素和妥布霉素耐药的患者，对于四环素以及青霉素耐药的病人，使用大观霉素具有很强的敏感性。对于青霉素以及头孢菌素类过敏的病人，可以使用大观霉素进行治疗。目前离子交换法是大观霉素大生产的通用方法，工艺为：发酵液酸化、过滤、离子交换、解析、活性炭脱色、浓缩、丙酮结晶、重结晶、真空干燥。
3.但本发明在实现本技术实施例中发明技术方案的过程中，发现上述技术至少存在如下技术问题：离子交换树脂需要高浓度酸溶液解析，树脂再生不仅需要丙酮，还需要使用酸和碱处理，结晶及重结晶工艺步骤也需要大量丙酮，在提取大观霉素方法树脂吸附量较低，成本相对较高，溶媒、酸、碱消耗高，成品收率低，对环境不友好等。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种大观霉素的提取纯化方法，通过大孔树脂分离方法与喷雾干燥联用的技术，解决了大观霉素提取纯化方法中离子交换树脂用盐酸、液碱的使用和排放问题，和重结晶步骤使用高成本丙酮的技术问题，优化了大观霉素提纯工艺，达到了收率高且降低了成本和环保压力。
5.为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
6.一种大观霉素的提取纯化方法，包括以下步骤：
7.(1)发酵液预处理步骤：将大观霉素发酵液酸化处理固液分离得到大观霉素发酵滤液；
8.(2)大孔树脂吸附解析步骤：将大观霉素发酵滤液经大孔树脂吸附解析步骤得到大观霉素解析液；
9.(3)解析液后处理步骤：将大观霉素解析液经后处理步骤得到大观霉素富集液；
10.(4)喷雾干燥步骤：将盐酸大观霉素富集液经喷雾干燥步骤得到大观霉素成品。
11.本发明在一些实施方式中，步骤(1)所述固液分离是采用板框压滤。
12.本发明在一些实施方式中，步骤(1)所述酸化ph值为2.0～4.0；
13.优选地，所述酸化试剂为草酸。
14.本发明在一些实施方式中，所述发酵液预处理步骤还包括ph值回调至5.0～7.0；
15.优选地，所述ph值回调试剂为氢氧化钠。
16.本发明在一些实施方式中，步骤(2)所述大孔树脂吸附解析步骤中吸附方式为两大孔树脂柱串联。
17.本发明在一些实施方式中，步骤(2)所述大孔树脂吸附解析步骤中解析剂为ph值
为4.0～6.0酸溶液。
18.优选地，所述酸溶液为盐酸溶液。
19.本发明在一些实施方式中，所述大孔树脂解析步骤中解析液用磷钨酸点样沉淀开始收集至废液效价低于220u/ml为终点。
20.本发明在一些实施方式中，步骤(3)所述解析液后处理步骤包括解析液活性炭脱色步骤和超滤步骤。
21.本发明在一些实施方式中，解析液后处理步骤还包括纳滤步骤。
22.本发明更具体实施方式如下：
23.一种大观霉素的提取纯化方法，包括以下步骤：
24.1、酸化
25.接发酵液降温到10～20℃，在搅拌情况下缓慢加入草酸酸化至ph值2.0～4.0，搅拌30～40分钟。
26.2、过滤
27.酸化液用板框进行过滤，进料完毕加入20％的顶洗水将残留在滤饼内剩余效价顶出。
28.3、回调复滤
29.滤液用氢氧化钠溶液在滤液池中调至ph值5.0～7.0后用陶瓷膜进行复滤，加20％的水对陶瓷膜浓浆透析，合并透过滤液和顶洗液得复滤液。
30.4、大孔树脂吸附
31.复滤液降温至10～15℃采用正吸附的方式使滤液自上而下通过dm-18型大孔树脂柱，控制流速0.5～1bv/h；采用两柱串联方式吸附，当磷乌酸检测有白色沉淀后，转入下一柱吸附，第一个树脂柱作为饱和树脂断开，以此类推。
32.5、洗水
33.吸附饱和的树脂，用10～15℃去离子水正洗2～3倍树脂体积，然后用去少量离子水反洗，反洗至流出洗液澄清透明为止，水洗流速1bv/h。洗水转入下一树脂或专门的洗水树脂，以防止效价流失。
34.6、解析
35.加盐酸调ph4.0～6.0作为解析剂，正进料，流速0.2～0.5bv/h，解析液收集前的料头套入不饱和的吸附树脂，大孔树脂解析步骤中解析液用磷钨酸点样沉淀开始收集解析液至废液效价低于220u/ml为终点。解析液需骤降至20℃以下保存。
36.7、树脂再生
37.由于树脂吸附的选择性好，在滤液吸附过程中，吸附的杂质、蛋白、色素量很少的优点，同时由于大孔树脂，基本不吸附无机盐离子，因此解析后的树脂，可以直接用于下批滤液的吸附。同时为防止解析过程中影响吸附效果，需要先自然降温或冷水串联降温后再吸附下一批滤液。
38.8、脱色
39.按10～30kg/m3解析液加入活性炭，搅拌30～60分钟，钛棒或板框过滤，料液过滤完毕，顶水用20～40％纯化水或去离子水，脱色液和顶洗水进入脱色液储罐。
40.由于大孔树脂良好的选择性，解析液颜色比离子交换工艺浅很多，基本和原工艺
的脱色液的颜色相似，所以，本工艺脱色主要目的是除热源，活性炭加量只有原工艺加量的15～30％。
41.9、超滤除蛋白和内毒素
42.脱色液用截留分子量为3000的超滤膜进行超滤，超滤截留液约加入20％的去离子水顶洗，料液温度控制在20℃以下。
43.10、浓缩
44.脱色液用截留分子量为200的纳滤膜进行纳滤浓缩，约浓缩到4～8万u/ml停止浓缩，浓缩过程注意降温，料液温度控制在20℃以下，然后减压浓缩至10～15万u/ml停止浓缩。
45.11、喷干
46.浓缩液无菌过滤后进入喷雾干燥塔喷干，控制进风温度110～140度，出风温度45～55℃，得到盐酸大观霉素无菌粉；喷干收粉系统需装除湿降温装置，以便于把喷干粉很快降温，防止成品高温下分解。大观霉素成品按照中国药典2020版检测：水分16.0～20.0％；大观霉素含量78～85％；灰分0.2～0.7％，ph值3.9～5.6，符合《中国药典》：16.0～20.0％；灰分不得过1.0％；大观霉素含量不得少于77.9％；ph值3.8～5.6的质量标准。产品按照epx标准检测，折干后(4r)～二盐酸二氢大观霉素及二盐酸大观霉素之和含量达到97～99％，符合epx要求的96～102％标准。
47.本发明的技术方案具有以下有益的技术效果：
48.1、本发明用大孔吸附树脂代替离子交换树脂，大孔吸附树脂具有稳定性好，吸附效果好，解析后解析液可重复利用，特别是重金属；工艺简单，操作方便，费用低；适用范围广且受外界条件影响小，对天然产物的分离和提取有显著效果且损失少，设备简单、生产周期短、能耗和成本低、容易再生，可以反复使用，对环境友好，大幅降低环保压力等优点。
49.2、本工艺吸附选用大孔树脂，其选择性好，解析液处理后，不再用丙酮进行结晶和重结晶，直接用喷干塔喷干即可得到合格产品，与通用的使用丙酮进行两次结晶工艺才能得到合格产品相比，避免了占生产成本最大的丙酮的使用和消耗，生产成本大幅度下降。
50.3、喷干工艺和结晶工艺相比，本工艺不用丙酮进行结晶和重结晶，不仅工艺路线缩短，干燥过程非常迅速，瞬间蒸发单位损失小，可直接干燥成粉末，可有效提高产品质量，
51.4、干燥室有一定负压，保证了生产中的卫生条件，避免粉尘在车间内飞扬，提高产品纯度；生产效率高，操作人员少，且大幅提高生产过程的安全性和收率，可连续化大生产。
具体实施方式
52.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
53.下述实施例中的大观霉素发酵液是由壮观链霉菌streptomyces spectabilis发酵而得的，其发酵工艺为常规工艺，其发酵培养基中常用的碳源主要是葡萄糖、淀粉；常用的氮源主要是玉米浆、硫酸铵等。发酵周期一般在100～160h左右，发酵培养结束，效价在
6000～8000u/ml。
54.实施例1
55.将大观霉素发酵液8m3，效价为7550u/ml，在搅拌情况下缓慢加入草酸调节ph值至2.5后，酸化液用板框进行过滤，过滤后的滤液用10％的氢氧化钠溶液在滤液池中回调至ph 6.5后，用陶瓷膜进行复滤，合并透过滤液和顶洗液得复滤液。大孔树脂吸附复滤液降温通过处理好的树脂装量为2m3的大孔树脂柱，树脂柱高径比约为1:3，采用两柱串联方式吸附，洗涤后的饱和树脂，用加盐酸调ph4.5，正进料进行解析，将磷钨酸点样沉淀较多时，开始收集解析液至解析液贮罐，当磷钨酸点样沉淀明显减少时，测得废液效价198u/ml，停止解析，向解析液加入制备好的活性炭67kg过滤，活性炭加量只有原工艺加量的28％，脱色收率明显提高。脱色液用截留分子量为3000的超滤膜进行超滤，超滤液用截留分子量为200的纳滤膜进行纳滤浓缩，浓缩液用孔径为0.22um的碳棒过滤器过滤后泵入50l/h的喷雾干燥塔喷干，喷干后得到米白色大观霉素无菌粉43.26kg；含量80.28％；水分15.0％.灰分0.48％，质量符合《中国药典》和欧盟epx标准及usp43要求。喷干收率：95.69％；从放罐到成品的总收率为64.27％。
56.实施例2
57.将大观霉素发酵液8m3，效价为6998u/ml，在搅拌情况下缓慢加入草酸调节ph至2.2后，继续搅拌30～40分钟。过滤后的滤液用20％的氢氧化钠溶液在滤液池中回调至ph5.2后，用陶瓷膜进行复滤，合并透过滤液和顶洗液得复滤液，收率：82.26％。大孔树脂吸附复滤液降温至10～15℃采用正吸附的方式使滤液自上而下通过处理好的树脂装量为2m3，大孔树脂柱，树脂柱高径比约为1:3，采用两柱串联方式吸附，洗涤后的饱和树脂，用加盐酸调ph5.0，正进料进行解析，将磷钨酸点样沉淀较多时，开始收集解析液至解析液贮罐。当用磷钨酸点样沉淀开始收集解析液，测得废液效价208u/ml，停止解析。向解析液加入制备好的活性炭70kg，用钛棒过滤，脱色收率明显提高。脱色液用截留分子量为3000的超滤膜进行超滤，超滤液再用截留分子量为200的纳滤膜进行纳滤浓缩，喷干，喷干收率：98.18％；从放罐到成品的总收率70.34％。
58.实施例3
59.将大观霉素发酵液8m3，效价为7319u/ml，缓慢加入草酸调节ph至2.3后，继续搅拌35分钟。酸化液用板框进行过滤，过滤后的滤液用15％的氢氧化钠溶液在滤液池中回调至ph 6.3后，用陶瓷膜进行复滤，合并透过滤液和顶洗液得复滤液12吨。大孔树脂吸附复滤液，自上而下通过处理好的树脂装量为2m3，大孔树脂柱，采用两柱串联方式吸附；洗涤后的饱和树脂，加盐酸调ph4.8，正进料进行解析，磷钨酸点样沉淀较多时，开始收集解析液至解析液贮罐，测得废液效价为183u/ml时，停止解析。收集解析液经检测ph值4.39，向解析液加入制备好的活性炭75kg过滤，本工艺脱色主要目的是除热源，活性炭加量只有原工艺加量的40％，脱色收率明显提高。脱色液用截留分子量为3000的超滤膜进行超滤，超滤液用截留分子量为200的纳滤膜进行纳滤浓缩，用钛棒过滤器过滤后泵入50l/h的喷雾干燥塔喷干，喷干收率：96.91％；从放罐到成品的总收率72.79％。
60.对比实施例1
61.将大观霉素发酵液8m3，效价为7054u/ml，搅拌降温到15℃，在搅拌情况下缓慢加入草酸调节ph至4.0后，酸化液用板框进行过滤，过滤后的滤液用15％的氢氧化钠溶液在滤
液池中回调至ph 6.79后，通过离子交换树脂，经盐酸洗脱，洗脱液经纳滤膜浓缩得到2.13吨,；加入活性炭后进行脱色、过滤，所得脱色液进行浓缩，丙酮结晶，过滤，将所得晶体干燥，得到大观霉素31.49kg，收率为50.28％，纯度为90.13％。
62.表1本发明实施例3中主要原材料消耗和收率与传统对比实施例1工艺对比表
63.序号项目发明工艺传统工艺1提炼总收率(％)66452丙酮单耗(kg/kg)04.83盐酸单耗(kg/kg)2.517.54液碱单耗(kg/kg)2.2405活性炭单耗(kg/kg)0.20.56草酸单耗(kg/kg)4.54.5
64.实施例工艺与传统工艺对比见表1，通过表1进一步表明：
65.1、本发明以大孔树脂替换离子交换树脂，大孔吸附树脂具有稳定性好，吸附效果好，解析后解析液可重复利用，特别是重金属；工艺简单，操作方便，费用低；适用范围广且受外界条件影响小，对天然产物的分离和提取有显著效果且损失少，设备简单、生产周期短、能耗和成本低、容易再生，可以反复使用。
66.2、由于本工艺采用大孔树脂和喷雾干燥联用，不再用传统工艺丙酮进行结晶和重结晶，使用喷雾干燥代替传统的丙酮二次结晶、离心、干燥工艺，杜绝了结晶用丙酮的使用，成本显著下降且减少有机溶剂的实用。本发明方法简便、环保、节约成本、收率显著提高，可连续化大生产。