用于治疗大疱性表皮松解症的基因编辑

1.本发明涉及使用成簇的规律间隔的短回文重复序列(crispr)系统来治疗大疱性表皮松解症，特别是隐性营养不良亚型(rdeb)。该技术提供设计单向导rna(sgrna)的可能性，将该单向导rna(sgrna)整合到crispr相关蛋白(cas9)中以识别且诱导在特定靶位置的dna双链断裂。在存在用于大疱性表皮松解症基因修复的供体序列下，将通过同源重组(hr)来修复dna双链断裂。在大疱性表皮松解症的情况下，这允许修复导致疾病的突变。


背景技术：

2.大疱性表皮松解症是一组以皮肤极度脆弱为特征的罕见遗传病。隐性营养不良亚型rdeb是该疾病最严重的表型，导致皮肤和粘液水疱形成、假性并指和高风险的转移性鳞状细胞癌发展。在表达vii型胶原蛋白(c7)的col7a1基因上的突变，在将该基因确定为rdeb精准医学疗法的靶标的这些患者中存在很大比例。
3.在过去几年中，已经探索了能够在dna中进行双链断裂的不同位点特异性核酸酶作为基因组编辑的工具，例如大范围核酸酶、锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应核酸酶(talen)和crispr/cas9。基于基因组编辑的方法利用由核酸酶诱导的双链断裂(ds-break)触发的细胞的天然dna修复机制以在基因序列(nhej)中引入插入缺失(indel)或者借助供体模板(hdr)对其进行精确校正的优势。nhej修复途径比hr更加频繁，但是最近的工具开发增加这种基于供体的校正在不同细胞类型中的效率。
4.主要地，角质形成细胞和成纤维细胞已被强调为eb基因治疗校正的细胞靶标。在2013年，osborn等人通过在rdeb患者来源的成纤维细胞中使用talen和寡核苷酸供体(odn)证明2％的hdr校正。后来，izmyrian(2016)和合作者借助大范围核酸酶开发了基于hdr的校正，实现4％的col7a1校正。此外，hainzl等人示出使用用于hdr的基于minicircle的crispr/cas9对患者来源rdeb角质形成细胞系的基因和功能上的校正。最近，izmiryan等人已经示出对含有外显子2的突变rdeb原代细胞的精确校正，在以整合缺陷型慢病毒引导进行递送的rdeb角质形成细胞和成纤维细胞中实现接近30％的插入缺失(indel)生成频率。在供体模板递送后，它们在角质形成细胞和成纤维细胞中在未经抗生素选择下分别实现11％和15.7％的校正col7a1 mrna表达。在其它类型的eb中，借助携带针对lamb3基因的内含子2定制的cas9/向导rna(grna)的腺载体和带有两侧为同源臂的无启动子的准完整lamb3 cdna的整合缺陷型慢病毒载体，benaty及其同事使用hr以原位恢复交界性大疱性表皮松解症(jeb)永生化角质形成细胞中的lamb3表达。
5.在该领域，我们最近使用由电穿孔递送的作为核糖核蛋白复合物的crispr/cas9系统，在原代rdeb角质形成细胞中实现高效率的插入缺失(indel)(接近95％)。另一方面，腺相关病毒(aav)已经作为用于供体模板递送的载体的先导，提供比idlv更高的效率，提高hdr比率，但不损害生物安全性。因此，aav与crispr/cas9的结合可以是感兴趣的选择，其作为基因组编辑工具以在原代角质形成细胞中采用hdr，并且因而成为rdeb原代细胞的基因校正策略。
6.尽管我们小组最近已经针对含有外显子80的突变rdeb患者测试了有效的基于nhej的方法，但是hr校正可以覆盖在经设计的供体长度内的大量外显子，提供一种治疗系统以校正col7a1中的不同突变外显子，能够使大队列的rdeb患者受益。
7.除了皮肤中的主要细胞类型之外，在过去几年中，一直考虑将同种异体骨髓移植(bmt)作为eb的替代性治疗方法(fujita 2010，petrof等人，2015；kaneda等人2015；cl ebens等人.2019)。事实上，ebens等人今年已经在bmt后随后输注对接受者来说安全性可接受的全身性msc的rdeb患者中显示出益处。这些患者中的一些表现出锚原纤维(af)增加和c7免疫染色增加。由于bmt在rdeb治疗中的潜在潜力，我们在这项工作中还包括利用相同的crispr/cas9系统在来自三个健康供体的cb分离的cd34 细胞和原代msc中进行基于hdr的基因编辑的原理证明，证实本方法作为基因校正和细胞治疗平台的潜力。
8.因此，本发明是对不同相关细胞类型进行基因校正的离体有效的无标志物的基于hr策略用于rdeb治疗的证据。
附图说明
9.图1.a)用于精确col7a1校正的基于hdr策略的方案。aav6递送的供体模板与crispr/cas9组合作为用于rdeb的基因编辑策略。crispr/cas9诱导的致病突变附近的双链断裂将用于触发hdr修复。b)col7a1内含子79内插入缺失生成的tide分析。该分析揭示原代rdeb角质形成细胞中高效的插入缺失生成(接近90％)。
10.图2.a)原代角质形成细胞中的aav血清型测试。我们评估8种不同的aav血清型，示出aav6的转导效率最高(39.7％)。b)rdeb原代角质形成细胞中基于hdr的校正的基因分型。分析揭示用测试的两种不同供体模板(对称臂和不对称臂)的精确基因校正效率接近40％。
11.图3.基因校正的rdeb多克隆角质形成细胞群体中的胶原蛋白vii表达。用crispr/cas9和含供体模板的aav6处理rdeb原代角质形成细胞并且通过免疫荧光和蛋白质印迹对细胞提取物评估c7表达恢复。a)c7免疫荧光分析。左上的小图：阳性对照，健康供体角质形成细胞。右上的小图：未经处理的rdeb p1角质形成细胞，示出无效的c7表达。左下的小图：aav6-对称供体加rnp处理的rdeb角质形成细胞。右下的小图：aav6-不对称供体模板加rnp处理的rdeb角质形成细胞。比例尺：50μm。b)未处理的、健康的和处理的患者rdeb细胞中c7恢复的蛋白质印迹分析，示出与免疫荧光图像一致的良好c7表达。
12.图4.hdr校正的rdeb移植物中表皮-真皮粘附和c7表达的恢复。将含有大量经编辑的rdeb角质形成细胞群体、未处理的rdeb角质形成细胞和健康角质形成细胞的皮肤等效物移植到裸鼠上。移植物的组织学分析(h&e染色)(图4的a、d、g)示出p1移植物中的表皮脱离。c7表达分析示出在hdr校正(p1 hdr)的角质形成细胞和健康供体(hd)角质形成细胞的bmz处连续的c7沉积，并且在未处理的rdeb角质形成细胞(p1)的移植物中未检测到c7(图4的b、e、h)。人外皮蛋白(h-inv)评估示出所示的所有移植物的表皮分化正常(图4的c、f、i)。
13.图5.a)利用rnp加含供体模板的aav6的经处理的p2 rdeb细胞的pcr基因分型。在两名经处理的rdeb患者之间观察到相似的基因校正比率。b)用于c7表达检测的免疫荧光。p2的c7表达无效。处理后，c7表达在大量的细胞中恢复。
14.图6.a)来自三名健康供体的cd34 细胞中基于hdr的基因编辑。b)三名健康供体的msc中基于hdr的基因编辑。
具体实施方式
15.定义
16.如本文所用，除非另有说明，否则以下术语具有赋予它们的含义。
17.如本文所用的术语“一个(a)”、“一种(an)”或“该(the)”不仅包括具有一个成员的方面，而且还包括具有多于一个成员的方面。例如，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”或“该(the)”包括复数指代对象，除非上下文另有明确规定。因此，例如，对“细胞”的提及包括多个这样的细胞并且对“药剂”的提及包括对本领域技术人员已知的一种或多种药剂的提及，如此等等。
18.术语“基因”是指多核苷酸元件的组合，当以天然或重组方式可操作地连接时，提供一些产物或功能。术语“基因”将被广义地解释，并且可以包括基因的mrna、cdna、crna和基因组dna形式。
19.术语“同源定向修复”或“hdr”是指细胞中的使用同源模板来指导修复以准确且精确地修复双链dna断裂的机制。hdr潜在的机制是同源重组(hr)。
20.术语“同源重组”或“hr”是指在两个相似的dna分子之间交换核苷酸序列的基因过程。细胞使用同源重组(hr)来准确地修复发生在两条dna链上的有害断裂，称为双链断裂或产生突出序列的其它断裂。
21.术语“单向导rna”或“sgrna”是指靶向dna的rna，该靶向dna的rna包含将cas核酸酶靶向靶基因组dna的向导序列和与cas核酸酶相互作用的支架序列(例如，tracrrna)。
22.术语“cas多肽”或“cas核酸酶”是指成簇的规律间隔的短回文重复序列相关的多肽或核酸酶，其切割dna，以在由包含在crrna分子内的20个核苷酸向导序列指定的位点处的双链断裂处产生平末端。cas核酸酶需要crrna和tracrrna二者来进行位点特异性dna识别和切割。crrna通过部分互补的区域与tracrrna结合以将cas核酸酶引导至靶dna中的与crrna同源的区域，称为“前间隔序列(protospacer)”。
23.术语“核糖核蛋白复合物”或“rnp复合物”是指包含sgrna和cas多肽的复合物。
24.术语“腺相关病毒载体递送的供体模板”或“含有供体模板的腺相关病毒载体”是指可以经由在靶细胞(例如，原代细胞)中的同源定向修复来递送用于基于crispr基因编辑的重组供体模板的腺相关病毒颗粒。
25.术语“重组供体模板”是指核酸链，例如dna链，其是在由受损dna修复机制(在一些情况下，由双链断裂引起)引发的同源重组链入侵期间的供体链。供体多核苷酸作为模板材料以指导受损dna区域的修复。在本发明中，我们优选地设计且构建缺少一个或多个内含子(尤其是含有向导rna靶序列的内含子)的dna供体片段或重组供体模板，，特别是供体模板不含有靶核酸的包含cas识别的前间隔序列邻近基序(pam)序列的内含子区域。通过使用这种供体dna设计，我们避免了可能由不需要的核酸酶活性引起的潜在基因剪接或编码序列改变。在col7a1基因的外显子附近的插入缺失(indel)生成会导致基因的开放阅读框变化，导致vii型胶原蛋白的氨基酸序列的改变，从而造成非功能性蛋白质变体。此外，内含子序列的缺失易于通过pcr检测，这有助于对重组等位基因进行基因分型。优选地，重组供体模板是外显子79和外显子80的融合体，缺少内含子79，其中向导rna包含其靶序列(在该处sg2进行切割)。仍更优选地，重组供体模板是外显子79和外显子80的融合体，缺少内含子79，没有pam序列，以避免hdr修复事件后的nhej事件。
26.在两个或多个核酸或多肽的上下文中，术语“序列同一性”或“百分比同一性”是指在与第二分子比较且比对最大对应性时，如使用序列比较算法(例如，通过blast比对或技术人员已知的任何其它算法)或可选地通过目视检查所测量的，相同(“同一的”)或者具有同一氨基酸残基或核苷酸的特定百分比(“同一性百分比”)的两个或更多个序列或子序列。
27.术语“同源”是指在它们天然地或人工地源自共同的祖先蛋白质或氨基酸序列时的两种或更多种氨基酸序列。类似地，在核苷酸序列天然地或人工地源自共同的祖先核酸时，它们是同源的。
28.术语“原代细胞”是指直接地从多细胞生物体分离出的细胞。与连续(肿瘤或人工永生化)细胞系相比，原代细胞通常经受了非常少的群体倍增并且因此更能代表其来源的组织的主要功能成分。在某些情况下，原代细胞是已被分离然后立即使用的细胞。在其它情况下，原代细胞不能无限地分裂并且因此不能在体外长时间培养。
29.术语“基因修饰的原代细胞”或“基因组编辑的原代细胞”是指在某些情况下已将异源核酸引入至它的内源基因组dna的原代细胞。
30.术语“药物组合物”是指生理可接受和药理学可接受的组合物。在一些情况下，该组合物包括用于在储存中缓冲和保存的试剂，并且可以包括用于适当递送的缓冲剂和载体，取决于给药途径。
31.术语“药学上可接受的载体”是指有助于将药剂(例如，cas核酸酶、修饰的单向导rna、基因修饰的原代细胞等)施用于细胞、生物体或对象的物质。“药学上可接受的载体”是指可以被包含在组合物或制剂中并且不会对患者造成显著不利毒理学影响的载体或赋形剂。药学上可接受的载体的非限制性实例包括水、nacl、生理盐水、乳酸林格氏液、正常蔗糖、正常葡萄糖、粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和色素等。本领域技术人员将认识到其它药学上的载体可用于本发明。
32.术语“施用(administering)或“施用(administration)”是指将本文公开的药剂、组合物、剂型和/或组合递送至对象用于治疗或预防目的的过程。考虑对象的临床病况、施用的部位和方法、剂量、对象年龄、性别、体重和医生已知的其它因素根据良好的医学实践施用本文公开的组合物、剂型和/或组合。例如，术语“施用(administering)”或“施用(administration)”包括由临床医生或其它临床专业人员提供、给予、给药和/或开处方本文公开的药剂、组合物、剂型和/或组合。
33.术语“治疗”是指用于获得有益或期望结果，包括但不限于治疗性益处和/或预防性益处的方法。治疗性益处是指治疗中对一种或多种疾病、病况或症状的任何治疗相关的改善或效果。对于预防性益处，可以将组合物施用于有发展为特定疾病、病况或症状风险的对象，或施用于报告为疾病的一种或多种生理症状的对象，即使该疾病、病况或症状可能还没有表现出来。
34.术语“对象”、“患者”和“个体”在本文中可互换使用以包括人或动物。例如，动物对象可以是哺乳动物、灵长类动物(例如猴子)、家畜动物(例如，马、牛、绵羊、猪或山羊)、陪伴动物(例如，狗、猫)、实验室试验动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、鸟)、具有兽医学意义的动物、或具有经济意义的动物。
35.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管本文描述了示例性方法、装置和材料，但与本文明确
描述的那些相似或等效的任何方法和材料都可以用于本技术的实践或测试中。例如，本文所述的试剂仅仅是示例性的并且其等价物在本领域中是已知的。除非另有说明，本技术的实施可以采用组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组dna的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。例如，参见sambrook和russell编辑.(2001)分子克隆(molecular cloning)：实验室手册，第3版；系列ausubel等人编辑(2007)分子生物学中的当前方法(current protocols in molecular biology)；酶学方法系列(academic出版社，inc.，ny)；macpherson等人(1991年)pcri：实用方法(practical approach)(牛津大学出版社的irl出版社)；macpherson等人(1995)pcr 2：实用方法(practical approach)；harlow和lane编辑.(1999)抗体，实验室手册(antibodies，a laboratory manual)；freshney(2005)动物细胞培养：基本技术手册(culture of animal cells：a manual of basic technique)，第5版；miller和calos编辑.(1987)哺乳动物细胞的基因转移载体(gene transfer vectors for mammalian cells)(冷泉港实验室)；和makrides编辑.(2003)哺乳动物细胞中的基因转移和表达(gene transfer and expression in mammalian cells)(冷泉港实验室)。
36.描述
37.基因修饰的干细胞为无法治愈的疾病提供了新的治疗解决方案领域。在血液学中，cd34 基因校正的细胞对于治疗严重血液疾病显示出很大益处。此外，最新的基因修饰技术已进入临床试验阶段(crispr)，为现代医学带来一场革命。此外，msc疗法在临床阶段对伤口愈合和免疫病治疗显示出益处，为再生医学提供安全的方法。
38.在皮肤病中，角质形成细胞和成纤维细胞是这些疗法的细胞来源，并且因此正在开发旨在为临床转化铺平道路的很多方法。大疱性表皮松解症是最具破坏性的皮肤罕见病之一，并且rdeb亚型完全不表达c7，被认为是最严重的亚型。已经说明了这些患者中的大量突变在col7a1基因中，使该基因成为校正rdeb的基因疗法策略的主要靶标。最近，作为经典的基因治疗方法，在移植了含有用表达cdna c7序列的γ-逆转录病毒处理的自体表皮干细胞的皮肤等效物的患者的i期离体临床试验中已经显示出益处。患者表现出伤口愈合改善和c7沉积和锚原纤维形成。
39.但是，新的基因编辑工具正在为更精确的基因校正疗法开辟道路。事实上，我们之前已经展示了用于rdeb患者细胞中的e80校正的基于基因编辑的高效方法。这项工作揭示crispr/cas9作为rnp作为原代角质形成细胞(被认为难以转染的细胞类型)的基因组编辑的最有效工具。在本发明中，我们已经首次测试大量aav血清型，以寻找尽可能最高的转导效率，并且我们发现在电穿孔后，aav6血清型提供最佳性能。因此，我们已经证明，由电穿孔递送的含有供体模板的aav6和rnp是用于角质形成细胞的基因组编辑的有效工具。
40.测试不同的同源供体设计，我们在原代角质形成细胞中发现相似的基于hr的校正比率，与同源臂中相对于切割位点的对称程度无关。在我们的研究中，对称供体覆盖e74至e84，并且不对称供体模板从e77至e88，因此每种设计可以覆盖在col7a1的10个不同外显子内具有突变的患者。更重要的是，我们可以开发大量包含col7a1不同基因区域的aav，能够校正基因上的任何突变。相对于之前提出的nhej，这是重要的优势，因为有些外显子不适合外显子去除，例如尤其外显子1、2、3、24、27或113，其可以通过精确的hr介导的基因校正进行校正。除了eb治疗之外，这种方法还可以转移到原代角质形成细胞中的任何基因组编辑
应用，以治疗其它皮肤疾病甚至敲入基因(报告基因、治疗分子)的突变，并且创造具有新功能特性的皮肤。
41.以前的工作已经显示与eb治疗相关的不同细胞类型中基于hr的基因校正。事实上，以前的工作已经证明通过talen和含有选择盒的aav在患者来源的角质形成细胞系中实现hr校正的可行性。在对处理过的角质形成细胞进行选择处理后，分离出的34个克隆中的32个被基因校正。但是，尽管它证明在rdeb角质形成细胞系中由hr恢复c7的可行性，但药物选择和克隆分离使得此类疗法的临床转化非常困难。然而，其它人已经证明，通过整合缺陷型慢病毒引导的递送，在含有外显子2的突变rdeb角质形成细胞中的插入缺失(indel)产生频率接近30％，其与供体模板递送相结合，对rdeb细胞角质形成细胞和成纤维细胞分别实现11％和15％的col7a1校正的转录物，以及皮肤移植物中高达19％足以使af形成而没有真皮-表皮分离。
[0042][0043]
对于本发明，我们在原代角质形成细胞中提供了无标志物的高效方法，其能够在原代角质形成细胞中实现接近40％的校正转录本，超过以前基于hr的基因校正比率。此外，我们已经产生经过编辑的大量角质形成细胞群体，其能够在移植到裸鼠上时引起正常的人体皮肤再生，并且恢复真皮-表皮粘附。使用多克隆群体更易于转化至临床，避免费时且费力的表皮克隆分离。
[0044]
基于deb亚等位基因鼠模型中的野生型(wt)成纤维细胞注射实验，认为35％的正常c7水平对于皮肤机械稳定性是需要的。参考：georgiadis，c.，syed，f.，petrova，a.，abdul-wahab，a.，lwin，sm，farzaneh，f.，chan，l.，ghani，s.，fleck，ra，glover，l.，等人(2016).lentiviral engineered fibroblasts expressing codon-optimizedcol7a1restore anchoring fibrils in rdeb.j.invest.dermatol.136，284-292.)。
[0045]
因此，与其它方法相比，本文提出的方法超过需要充分地治疗或预防eb的原代角质形成细胞中的校正转录物的百分比。总体上，我们的发明提供离体有效基因组编辑工具的证据，以能够在许多不同的细胞类型中实现基因校正，为开发旨在eb治愈的不同细胞疗法提供来源。该技术涵盖更宽的eb突变谱，为大队列eb患者的临床获益铺平道路。
[0046]
因此，在本发明的第一方面，我们在此提供了一种用于在原代细胞、优选在原代角质形成细胞、成纤维细胞或皮肤干细胞中通过同源重组来诱导包含col7a1基因的引起大疱性表皮松解症、优选隐性营养不良性大疱性表皮松解症(rdeb)的一种或多种突变的靶核酸的稳定基因修饰的方法。该方法包括向原代细胞引入：(a)修饰的单向导rna(sgrna)，其包含与靶核酸互补的核苷酸序列和与crispr相关蛋白(cas)多肽相互作用的核苷酸序列，其
中rna组分可以是两个单独的rna分子(crrna和tracrrna)或单个rna分子(sgrna)；(b)cas多肽、编码cas多肽的mrna和/或包含编码cas多肽的核苷酸序列的重组表达载体，其中分开提供的修饰的sgrna、或crrna和tracrrna组分将cas多肽引导至待校正的靶基因组序列；和(c)同源供体，优选包含重组供体模板的野生型腺相关病毒血清型6(aav-6)或1(aav-1)，该重组供体模板包含含有靶核酸的两个非重叠的同源部分的两个核苷酸序列，其中该核苷酸序列位于对应靶核酸的核苷酸序列的5
′
和3
′
端以进行同源重组；
[0047]
其中，靶核酸的稳定基因修饰包括通过引入包含校正供体模板的同源供体aav-6或aav-1载体来替换col7a1基因(靶核酸)的致病突变，该致病突变优选在col7a1基因的外显子73、74、75、80或105中的任一个中，优选在人群中具有高频率杂合性的那些致病突变。
[0048]
在原代细胞中、优选在原代角质形成细胞中的上述基因修饰策略优选地以治疗具有或患有大疱性表皮松解症、优选地隐性营养不良性大疱性表皮松解症(rdeb)的对象为目的而进行。值得注意的是，隐性营养不良性大疱性表皮松解症(rdeb)是由col7a1基因(胶原蛋白vii，c7)突变导致c7功能缺失引起的遗传性水疱性皮肤病。vii型胶原蛋白(c7)是一种大型同源三聚体三螺旋胶原蛋白分子，在其nc2端经受反平行二聚体形成，随后超分子组装成称为锚原纤维的附着结构，其将bmz的致密层连接到乳突状真皮。c7包含结合致密层中的层粘连蛋白332的较大的nc1结构域)和包裹乳突状真皮中的间质胶原纤维的胶原结构域。因此，rdeb中c7的缺乏会在乳突状真皮和致密层之间产生水疱。人类vii型胶原基因col7a1具有由总共118个独立外显子组成的复杂结构。然而，该基因相对紧凑，并且大多数内含子相对较小；因此，整个人类col7a1基因的大小仅为-32kb，编码-8.9kb的信使rna。col7a1已绘制到人类3号染色体的短臂，区域3p21.1。vii型胶原基因结构和编码的蛋白质一级序列非常保守，例如，小鼠基因示出在核苷酸上的同源性为84.7％以及在蛋白质水平上的同一性为90.4％。
[0049]
vii型胶原蛋白由培养中的表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞二者合成。在合成完整的pro-al(vii)多肽后，三个多肽通过它们的羧基末端缔结成三聚体分子，该三聚体分子在它的胶原蛋白部分折叠成三螺旋结构。然后将三螺旋分子分泌到细胞外环境中，其中两个vii型胶原蛋白分子排列成反平行二聚体，氨基末端结构域存在于分子两端。这种二聚体组装伴随着两个vii型胶原蛋白分子羧基末端的一部分的蛋白水解去除和分子间二硫键形成的稳定化。随后，大量的这些反平行二聚体横向聚集以形成锚原纤维。
[0050]
col7a三螺旋结构域中的甘氨酸取代突变(尤其是外显子73、74和75)在显性营养不良性大疱性表皮松解症(ddeb)中占主导地位。突变p.gly 2034arg和p.gly2043arg是最常见的引起ddeb的突变，占美国最大队列报告的主要突变的50％。甘氨酸取代以及其它氨基酸取代和该区域外的剪接点突变也可以在显性deb中发现。对于所有形式的deb，已经描述了跨越整个基因的大于400种造成隐性deb的突变。然而，每种突变在所描述的突变总数中所占比例不超过1％-2％。尽管已经描述了甘氨酸取代和其它氨基酸取代，但是空突变在rdeb中占主导地位。较温和的rdeb形式通常是由剪接点突变或其它错义突变引起的。
[0051]
因此，在其它实施方案中，靶核酸的稳定基因修饰包括通过引入包含校正供体模板的同源供体aav-6或aav-1载体来替换col7a1基因的任何上述致病突变。如已经陈述的，应注意术语“重组供体模板”或“供体模板”是指核酸链，例如，在由受损dna修复机制(在某些情况下，由双链断裂引起)引发的同源重组链入侵期间作为供体链的dna链。供体多核苷
酸作为模板材料以指导受损dna区域的修复。在本发明中，我们优选地设计且构建缺少一个或多个内含子(特别是包含向导rna靶序列的内含子)的dna供体片段或重组供体模板，更具体地，供体模板不包含靶核酸中含有cas识别的前间隔序列邻近基序(pam)序列的内含子区域。通过使用这种供体dna设计，我们避免可能由不需要的核酸酶活性引起的潜在基因剪接或编码序列改变。在col7a1基因的外显子附近的插入缺失(indel)产生会导致基因的开放阅读框变化，导致vii型胶原蛋白的氨基酸序列的改变，导致非功能性蛋白质变体。此外，内含子序列的缺失易于通过pcr检测，这有助于对重组等位基因进行基因分型。优选地，重组供体模板是外显子79和外显子80的融合体，缺少内含子79，其中向导rna包含它的靶序列(在该处sg2进行切割)。更优选地，重组供体模板是外显子79和外显子80的融合体，缺少内含子79，没有pam序列，以便避免hdr修复事件后的nhej事件。
[0052]
在一些实施方案中，原代细胞选自原代角质形成细胞或成纤维细胞，以及它们的组合。在一些实施方案中，在将修饰的sgrna、cas多肽和同源供体aav载体引入至原代细胞之前，从哺乳动物分离出原代细胞。例如，可以从人类对象收获原代细胞。在一些情况下，在将修饰的sgrna、cas多肽和同源供体aav载体引入至原代细胞后，将原代细胞或其子代返回至该哺乳动物。换言之，基因修饰的原代细胞经受自体移植。在其它情况下，基因修饰的原代细胞经受异体移植。例如，从供体对象分离出未经受稳定基因修饰的原代细胞，然后将经基因修饰的原代细胞移植至与供体对象不同的受体对象中。
[0053]
原代细胞可以包括原代细胞的群体。在一些情况下，原代细胞的群体包括原代细胞的异质群体。在其它情况下，原代细胞群体包括原代细胞的同质群体。
[0054]
在一些情况下，同源供体aav-6载体与aav6具有至少约90％的序列同一性。在其它情况下，同源供体是野生型aav6或具有与野生型aav6至少95％序列同一性，例如与野生型aav6具有95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的aav6变体。在一些实施方案中，编码aav-6载体的多种组分中的一种或多种的多核苷酸可操作地连接至诱导型启动子、阻抑型启动子或组成型启动子。此外，与该组分可操作地连接的调节序列可以包括激活子结合序列、增强子、内含子、多腺苷酸化识别序列、启动子、阻遏物结合序列、茎-环结构、翻译起始序列、翻译前导序列、转录终止序列、翻译终止序列、引物结合位点等。常用的启动子是组成型哺乳动物启动子cmv、efla、sv40、pgkl(小鼠或人)、ubc、cag、camkila和β-act，以及本领域已知的其它启动子(khan，kh(2013)
″
gene expression in mammalian cells and its applications”，advanced pharmaceutical bulletin 3(2)，257-263)。此外，可以使用哺乳动物rna聚合酶iii启动子，包括hi和u6。
[0055]
在一些实施方案中，重组哺乳动物表达载体能够优先指导核酸在特定细胞类型中的表达(例如，使用组织特异性调节元件来表达多核苷酸)。组织特异性调节元件是本领域已知的，并且包括但不限于白蛋白启动子、淋巴特异性启动子、神经元特异性启动子(例如，神经丝启动子)、胰腺特异性启动子、乳腺特异性启动子(例如，乳清启动子)，并且特别是t细胞受体和免疫球蛋白的启动子。还包括发育调节的启动子，例如鼠hox启动子和甲胎蛋白启动子。
[0056]
将aav-6或aav-1表达载体引入至宿主细胞的方法是本领域已知的并且通常基于宿主细胞的种类进行选择。
[0057]
在一些实施方案中，在大于约30％的原代细胞群体中，例如约35％、约40％、约
50％、约60％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的原代细胞群体中诱导靶核酸的稳定基因修饰。在其它实施方案中，在大于约80％的原代细胞群体中，例如约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的原代细胞群体中诱导靶核酸的稳定基因修饰。在其它实施方案中，在大于约90％的原代细胞群中，例如约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的原代细胞群体中诱导靶核酸的稳定基因修饰。
[0058]
在一些实施方案中，本发明第一方面的序列可以包含修饰的核苷酸，例如核糖基团、磷酸基团、核碱基或其组合中的修饰。在一些情况下，核糖基团的修饰包括核糖基团2
′
位置的修饰。在一些情况下，核糖基团2
′
位置的修饰选自2
′‑
o-甲基、2
′‑
氟、2
′‑
脱氧、
′‑
o-(2-甲氧基乙基)及其组合。在其它情况下，磷酸基团的修饰包括硫代磷酸酯修饰。在其它实施方案中，修饰的核苷酸选自2
′‑
o-甲基(m)核苷酸、2
′‑
o-甲基3
′‑
硫代磷酸酯(ms)核苷酸、2
′‑
o-甲基3
′‑
硫代pace(msp)核苷酸及其组合。
[0059]
在一些实施方案中，cas多肽是cas9多肽、其变体或其片段。在某些情况下，cas多肽变体包含高保真或增强的特异性cas9多肽变体。在某些实施方案中，将修饰的sgrna和cas多肽同时地引入至原代细胞。在其它实施方案中，将修饰的sgrna和cas多肽顺序地引入至原代细胞。在某些情况下，首先引入修饰的sgrna，之后引入cas多肽。在其它情况下，首先引入cas多肽，之后引入修饰的sgrna。
[0060]
在一些实施方案中，修饰的sgrna和cas多肽可以在引入至原代细胞之前一起孵育以形成核糖核蛋白(rnp)复合物。例如，可以将修饰的sgrna和cas多肽在容器中混合在一起以形成rnp复合物，然后将rnp复合物引入至原代细胞。在其它实施方案中，本文所述的cas多肽可以是编码cas多肽的mrna，该cas mrna与修饰的sgrna一起作为“全rna”crispr系统被引入至原代细胞。在某些情况下，将修饰的sgrna和cas mrna同时地引入至原代细胞。在其它情况下，将修饰的sgrna和cas mrna顺序地引入至原代细胞。在某些情况下，首先引入修饰的sgrna，然后引入cas mrna。在其它情况下，首先引入cas mrna，然后引入修饰的sgrna。
[0061]
在一些实施方案中，将rnp复合物和同源供体aav-6或aav-1载体同时地引入至原代细胞。在其它实施方案中，将rnp复合物和同源供体aav-6载体顺序地引入至原代细胞。在一些情况下，将rnp复合物在同源供体aav载体之前引入至原代细胞。在其它情况下，将同源供体aav载体在rnp复合物之前引入至原代细胞。例如，可以在同源供体aav载体之前的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、90、120、150、180、210或240分钟或更长时间将rnp复合物引入至原代细胞，或反之亦然。在具体的实施方案中，在同源供体aav-6载体之前的约15分钟(例如，约10至约20分钟)将rnp复合物引入至原代细胞。
[0062]
在一些实施方案中，将“全rna”crispr系统和同源供体aav载体同时地引入至原代细胞。在其它实施方案中，将“全rna”crispr系统和同源供体aav-6载体顺序地引入至原代细胞。在一些情况下，将“全rna”crispr系统在同源供体aav-6载体之前引入至原代细胞。在
其它情况下，将同源供体aav-6载体在“全rna”crispr系统之前引入至原代细胞。例如，可以在同源供体aav载体之前的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、90、120、150、180、210或240分钟或更长时间将“全rna”crispr系统引入至原代细胞，或反之亦然。在具体的实施方案中，在同源供体aav载体之前的约15分钟(例如，约10至约20分钟)将“全rna”crispr系统引入至原代细胞。
[0063]
在一些实施方案中，本文所述的任何方法还可以包括使用标志物来纯化具有靶核酸的稳定基因修饰的原代细胞。在一些情况下，通过纯化步骤分离的组合物具有至少约80％的具有靶核酸的稳定基因修饰的原代细胞，例如约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多的具有靶核酸的稳定基因修饰的原代细胞。
[0064]
在一些实施方案中，将修饰的sgrna和cas多肽引入至原代细胞的步骤包括将修饰的sgrna和cas多肽电穿孔至原代细胞。在一些实施方案中，将同源供体aav-6或aav-1载体引入至原代细胞的步骤包括对原代细胞进行转导。
[0065]
在其它方面，本文提供了通过本文描述的任何方法产生的基因修饰的原代细胞。在一些实施方案中，基因修饰的原代细胞选自由原代角质形成细胞或成纤维细胞及其组合组成的组。
[0066]
在其它方面，本文提供了一种药物组合物，其包含本文所述的任何基因修饰的原代细胞和药学上可接受的载体。在其它实施方案中，药物组合物包含一种类型的基因修饰的原代细胞。在其它实施方案中，药物组合物包含两种或更多种不同类型的基因修饰的原代细胞，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种不同类型的基因修饰的原代细胞。
[0067]
在进一步的方面，本文提供了试剂盒在用于在原代细胞、优选地在从对象获得的原代角质形成细胞或成纤维细胞通过同源重组来诱导包含col7a1基因的引起大疱性表皮松解症、优选隐性营养不良性大疱性表皮松解症(rdeb)的一种或多种突变的靶核酸的稳定基因修饰的方法中的体外用途，该试剂盒包含(a)单向导rna(sgrna)，其包含与靶核酸互补的第一核苷酸序列和与crispr相关蛋白(cas)多肽相互作用的第二核苷酸序列；(b)cas多肽、编码cas多肽的mrna和/或包含编码cas多肽的核苷酸序列的重组表达载体，其中sgrna将cas多肽引导至靶核酸；(c)同源供体腺相关病毒(aav 6)或aav-1载体，其包含重组供体模板，该重组供体模板包含含有靶核酸的两个非重叠的同源部分的两个核苷酸序列，其中该核苷酸序列位于与靶核酸对应的核苷酸序列的5
′
端和3
′
端以进行同源重组；和任选地说明书手册。
[0068]
在一些情况下，试剂盒还包含用于从对象收获或分离原代细胞的试剂。对象可以是哺乳动物对象，例如人类对象。
[0069]
在又进一步的方面，本文提供了预防或治疗有此需要的对象的大疱性表皮松解症、优选隐性营养不良性大疱性表皮松解症(rdeb)的方法，该方法包括向对象施用本文所述的任何基因修饰的原代细胞，或本文所述的任何药物组合物，以预防疾病或改善疾病的一种或多种症状。
[0070]
在一些实施方案中，施用步骤包括选自由静脉内、腹膜内、肌内、皮内、皮下、鞘内、骨内或其组合组成的组的递送途径。
[0071]
在具体的实施方案中，将本发明的基因修饰的原代细胞或药物组合物以足够用于
校正与疾病相关的靶核酸中的突变的量施用于对象。在一些情况下，通过用野生型等位基因替换靶核酸中的突变等位基因来校正突变。
[0072]
在本发明的进一步实施方案中，本发明的基因修饰的原代细胞或药物组合物在体外、优选在方法中使用，以制造皮肤等效物或人造皮肤。因此，本发明的更进一步的实施方案涉及根据前述体外使用能获得或获得的皮肤等效物。更进一步的实施方案涉及根据前述体外用途或方法能获得或获得的这类皮肤等效物用于治疗有此需要的对象的大疱性表皮松解症、特别是隐性营养不良亚型(rdeb)的方法中使用。
[0073]
本发明的其它目的和优点对于本领域技术人员来说将通过阅读随后的详细描述而变得显而易见，该详细描述参考以下的附图和所附权利要求进行。
[0074]
因此，申请人在此展示了使用crispr系统来明确地修复rdeb突变。申请人针对突变位点周围的位点。使用crispr/cas9系统对rdeb疾病突变的dna修复代表一种原创的新治疗方法。本发明提供利用工程化核酸酶在dna水平上起作用以失活或修复引起疾病的突变的可能性。
[0075]
以下实施例仅仅是说明性的并且不限制本发明的范围。
[0076]
实施例
[0077]
材料和方法
[0078]
角质形成细胞培养和克隆分离
[0079]
患者角质形成细胞从三名携带col7a1基因突变的rdeb(rdeb-sev gen)患者的皮肤活检原始获得。经合作医院伦理委员会批准并获得知情同意后，从患者获得皮肤活检。
[0080]
培养人类rdeb原代角质形成细胞和健康供体原代角质形成细胞。将来自三名患者的人类rdeb原代角质形成细胞铺板到经致死照射的3t3-j2细胞上，并且在角质形成细胞生长cfad培养基(kca)中培养，该cfad培养基是杜尔贝科改良伊格尔培养基(dulbecco’s modified eagle’s media)与ham
′
s f12培养基的3∶1混合物(gibco-brl，巴塞罗那，西班牙)，其含有胎牛血清(hyclone，ge healthcare，logan，ut)(10％)、青霉素-链霉素(1％)、谷氨酰胺(2％)、胰岛素(5μg/ml；sigma aldrich)、腺嘌呤(0.18mmol/l；sigma aldrich)、氢化可的松(0.4μg/ml；sigma aldrich)、霍乱毒素(0.1nmol/l；sigma aldrich)、三碘甲状腺原氨酸(2nmol/l；sigma aldrich)、egf(10ng/ml；sigma aldrich))和10μm的y-27632 rock抑制剂(sigma aldrich)。为了获得分离的克隆，随后将细胞经胰蛋白酶消化并且以低密度铺板在100mm板(103个细胞/板)中，每板具有2
×
106个经致死照射的3t3饲养细胞。随后使用聚苯乙烯克隆圆筒(sigma，st louis，mo)收集细胞克隆并且扩增以供进一步分析。
[0081]
含供体的aav6的生产
[0082]
从野生型基因组dna通过pcr扩增同源臂。对称供体是外显子79和外显子80的融合体，缺少内含子79，在该处sg2进行切割。因此，左同源臂(lha)是从外显子79末端到col7a1基因5
′
的1008bp，以及右同源臂(rha)是从外显子80开始到该基因3
′
的798bp。不对称供体遵循相同的策略，但是lha为556bp并且rha为1461bp。然后，通过gibson组装技术将两个臂与aav骨架质粒组装在一起。
[0083]
对于含供体模板的aav6的生产，将骨架载体质粒在大肠杆菌(e.coli)中生长并且通过无内毒素maxi质粒纯化试剂盒(invitrogen，cat#a33073)分离。然后，使用每板120ul的1mg/ml pei(mw 25k)(polysciences)与6mg含itr的质粒和22mg pdgm6(携带aav6cap、
aav2 rep和腺病毒辅助基因)(d.russell馈赠)混合来转染5个15cm2的293细胞板。转染后72小时，使用takara aav pro纯化试剂盒(货号6666)按照制造商的方法来纯化载体。在itr区域上使用探针通过ddpcr来评估载体滴度。
[0084]
crispr/cas9递送和aav6转导
[0085]
先前描述了sg2 grna(bonafont等人)。在这种方法中，替代crrna:tracrrna系统，sg2是单向导rna并且经过化学修饰(synthego，ca，usa)。在对1
×
105个原代角质形成细胞(integrateddnatechnologies，ia，usa)进行的每次反应中，通过电穿孔递送与6ugcas9蛋白混合的1.6ug sgrna。用于递送rnp的电穿孔平台是4d-nucleofector
tm
系统(lonza bioscience，瑞士)，电穿孔代码cm137。
[0086]
在电穿孔后，利用opti-mem(thermofisher scientific)将细胞在50ul终体积的含供体的aav6(moi 30k)的悬液中转导1小时。随后，将细胞铺板到含饲养层的板上。
[0087]
对于msc和cd34

细胞，使用3.2ug sgrna和6ugcas9。用于msc电穿孔的电穿孔代码是cm119，dz100是用于cd34

细胞转染的代码。对于转导，将msc与aav6在悬液中孵育15分钟，随后将它们铺板在培养基上。对于cd34 细胞，将aav6直接地添加到孔中。
[0088]
基因靶向的角质形成细胞的基因分型
[0089]
处理后6天，通过角质形成细胞裂解物的异丙醇沉淀分离出基因组dna(裂解缓冲液为tris ph8 100mm、edta 5mm、sds 0.2％、nacl 200mm、1mg/ml蛋白酶k(roche diagnostics，曼海姆，德国)并且重新悬浮于te缓冲液中。将大约50ng的基因组dna用于pcr扩增。在同源臂外利用引物s1 f/r来生成跨越靶区域的pcr片段。f：5
’‑
caccagcattctctcttcc-3’；r：5
’‑
gttctt ggg tac tcacca c-3’。pcr程序为：98℃ 1分钟；98℃ 30秒、68℃30秒、72℃ 45秒，5个循环，每个循环降低退火温度1℃；然后94℃ 30秒、63℃ 30秒、72℃ 45秒，30个循环；然后72℃ 10分钟。在1.5％琼脂糖凝胶中分析pcr产物。分子量标志物为ix(sigma-aldrich)。对于测序，pcr产物用illustra
tm exoprostar
tm
(ge healthcare，uk)处理，使用big dye terminator v.1.1循环测序套件(thermo fisher，沃尔瑟姆，ma)测序，并且在3730dna分析仪(life technologies，卡尔斯巴德，ca)上检查。使用sequencher(gene codes，ann harbor，mi)来分析色谱图。使用bio-rad image lab software 6.0进行pcr带密度测定。
[0090]
蛋白质印迹分析
[0091]
在含有蛋白酶抑制剂混合物(complete mini，无edta；roche diagnostics，曼海姆，德国)的蛋白质提取缓冲液(50mm tris-hcl，ph 7.5，100mm nacl，1％nonidet p-40，4mm edta)中裂解角质形成细胞。将裂解物在冰上孵育30分钟并且在4℃下以15,000
×
g离心30分钟。收集上清液并且使用bradford测定法(biorad，hercules，ca)来测量蛋白质浓度。对于每个样品，将40μg总蛋白在novex 3-8％tris-乙酸凝胶电泳(invitrogen，卡尔斯巴德，ca)上分离，并且电转移到硝酸纤维素膜(invitrogen，卡尔斯巴德，ca)上。对于vii型胶原蛋白分析，用单特异性多克隆抗c7抗体(a.nystrom博士慷慨馈赠；弗莱堡大学)来探测印迹。将针对抗粘着斑蛋白的gapdha抗体的抗体用作上样对照。通过与hrp缀合的抗兔抗体(amersham，柏林顿，ma)和west pico化学发光底物(pierce，罗克福德，il)一起孵育来进行可视化。
[0092]
免疫荧光和免疫组织化学染色
[0093]
对于角质形成细胞中c7的免疫荧光检测，将在玻璃盖玻片上生长的细胞在-20℃下在甲醇/丙酮(1∶1)中固定10分钟。在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中洗涤3次并且在含3％牛血清白蛋白(bsa)(sigma aldrich，st louis，mo)的pbs中洗涤一次后30分钟，将细胞与单特异性多克隆抗c7抗体以1∶5000稀释度进行孵育。以1/1000稀释度使用第二抗体(alexafluor488，invitrogen，卡尔斯巴德，ca)。在pbs中最后一次洗涤步骤后，使用mowiol(hoechst，somerville，nj)封固剂来封固制剂并且使用dapi 20μg/ml(sigma aldrich，st louis，mo)进行细胞核可视化。如33.
33
所述，用蛋白酶k抗原修复对石蜡包埋的福尔马林固定切片中c7进行免疫过氧化物酶检测。分别使用兔sy5单克隆抗体(sigma)和4a4单克隆抗体对没有抗原修复的石蜡切片进行人类外皮蛋白和p63的免疫过氧化物酶染色。使用以二氨基联苯胺为底物的abc过氧化物酶试剂盒(vector)用于使试剂显色。
[0094]
电子显微镜
[0095]
约0.4
×
0.3cm的样本在室温下在3％戊二醛溶液的0.1m二甲胂酸盐缓冲液ph 7.4中固定至少2小时，切成约1mm3的小片，在缓冲液中洗涤，4℃下在1％四氧化锇中后固定1小时，以水漂洗，通过分级的乙醇溶液脱水，转移到环氧丙烷中，并且包埋于环氧树脂(缩水甘油醚100)中。用超微切片机(reichert ultracut e)切割为半薄切片和超薄切片。用乙酸双氧铀和柠檬酸铅处理超薄切片，并且用配备有2k ccd相机(tvips)的电子显微镜(jem 1400)检查。
[0096]
皮肤等效物的生成、移植到免疫缺陷小鼠和移植物分析
[0097]
根据国家和欧洲法律法规由我们的动物管理和使用机构委员会批准了动物研究。
[0098]
将基因编辑的角质形成细胞接种在含c7表达无效的rdeb成纤维细胞的纤维蛋白真皮等价物上，如前所述
34
制备的。将生物工程化的皮肤等效物移植到从elevage-janvier(c)购买的7周龄雌性免疫缺陷小鼠(nu/nu，nmri背景)的背部，如前所述
30
。在无菌条件下进行移植，并且在实验期间将小鼠安置在ciemat实验动物设施(西班牙注册号28079-21a)无病原体条件下。将动物安置在单独通风的ii型笼子中，每小时换气25次，并且将用10kgy伽马射线照射的软木颗粒作为垫料。所有处理均在无菌条件下进行，并且所有实验程序均遵守欧洲和西班牙法律法规。在移植后10周处死小鼠，并且收获移植物用于皮肤组织学、免疫组织化学分析和电子显微镜研究。
[0099]
将基于hdr校正的多克隆角质形成细胞接种在含c7表达无效的rdeb成纤维细胞的纤维蛋白真皮等效物上，如前所述
34
制备的。将生物工程化的皮肤等效物移植到从elevage-janvier(法国)购买的7周龄雌性免疫缺陷小鼠(nu/nu，nmri背景)的背部，如前所述30。移植是在无菌条件下进行的，并且在实验期间将小鼠安置在ciemat实验动物厂(西班牙注册号28079-21a)无病原体条件下。将动物安置在单独通风的ii型笼子中，每小时换气25次，并且将用10kgy伽马射线照射的软木颗粒作为垫料。所有处理均在无菌条件下进行，并且所有实验程序均符合欧洲和西班牙法律法规。在移植后的不同时间点处死小鼠，并且收获移植物用于皮肤组织学、免疫组织化学分析和电子显微镜研究。
[0100]
体内皮肤脆性试验
[0101]
将本实验室研制的抽吸装置设置为对3mm直径区域施加10
±
2kpa的负压，持续5分钟，以在移植后12周的免疫缺陷小鼠中再生的人皮肤移植物上诱导水疱形成。使用了两只携带未经编辑角质形成细胞的移植物的小鼠和两只携带sg2 sg3rnp处理的角质形成细胞
的移植物的小鼠。对于每种移植物，在两个不同的部位进行抽吸。在进行抽吸之前，为了促进水疱形成，将白炽灯泡放置在与移植区域约2cm远的顶部，持续2分钟35。之后，在整个实验期间保持灯泡是打开状态。抽吸后10分钟对抽吸区域拍照并且切下用于组织学分析。
[0102]
将本实验室研制的抽吸装置设置为对3mm直径区域施加10
±
2kpa的负压以在移植10周后的免疫缺陷小鼠中再生的人皮肤移植物上诱导水疱形成。在进行抽吸之前，为了促进水疱形成，将白炽灯泡放置在与移植区域约2cm远的顶部，持续2分钟
35
。之后，在整个实验期间保持灯泡是打开状态。抽吸后10分钟对抽吸区域拍照并且切下用于组织学分析。
[0103]
结果
[0104]
crispr/cas9rnp复合物递送到原代rdeb细胞实现高效的插入缺失(indel)生成
[0105]
为了证明sgrna修饰向导对插入缺失生成的能力，我们评估了在我们之前工作(bonafont等人，2019)中由于表现出良好的效率和生物安全性而用于基于nhej双向导策略的“sg2”向导的切割效率。在这种情况下，替代用于rnp复合物的crrna:tracrrna分子，我们测试了化学修饰的sgrna(synthego，ca)。
[0106]
本向导针对内含子79，其非常接近致病性外显子80(图1的a)。在我们的供体模板构建体中，我们消除内含子79的序列，从而没有pam序列，以便避免在hdr修复事件后的nhej事件。
[0107]
在amaxa 4d nucleofector平台的代码cm137条件下，在rdeb原代角质形成细胞中将sg2与crispr/cas9系统作为rnp复合物进行电穿孔。通过对靶区域nhej事件的tide分析来评估插入缺失生成的能力，在原代角质形成细胞的每个技术重复中实现82.6％和90.8％(图1的b)。
[0108]
用于原代角质形成细胞转导的aav血清型测试和原代细胞中基于hdr的rdeb校正
[0109]
对于在不同细胞类型(如cd34 细胞或ipsc)上进行基于hdr的基因编辑中的供体模板递送，aav已被证明是非常有效且安全的载体，对无法治愈的疾病具有有前途的治疗性益处。
[0110]
因此，为了评估原代角质形成细胞中的aav转导效率，我们评估了包装基于gfp的构建体的广泛aav血清型(aav 1、2、5、6、7、8、9和dj；图2的a)以选择表现最好的亚型。通过流式细胞术来评估不同aav的gfp表达，揭示aav6是实现角质形成细胞转导的最强血清型。因此，我们将我们的构建体包装在血清型6的aav载体中。
[0111]
在优化转导方案后，我们用sg2 sgrna作为rnp对rdeb原代角质形成细胞进行电穿孔，然后用携带供体模板的aav6对它们进行转导。我们测试了两种不同的供体设计，一种供体具有对称的同源臂并且另一种供体具有不对称的同源臂。对称供体覆盖col7a1基因的e74至e84，以及不对称供体覆盖col7a1基因的e77至e88。我们通过pcr、topo克隆和sanger测序分析了发生的修复事件，并且我们发现接近40％的hdr频率、缺失i79和校正e80中的c6527insc突变(图2的b)，并且在两种供体之间没有观察到hdr效率的差异。
[0112]
rdeb原代角质形成细胞中基于hdr的校正后c7从头表达
[0113]
col7a1中的高效基因校正应该在经编辑的角质形成细胞大量群体的高百分比的细胞中恢复c7表达。因此，我们通过免疫荧光和蛋白质印迹分析了用sg2rnp电穿孔并用携带两种不同供体模板的aav6转导的rdeb角质形成细胞中的c7表达。通过免疫荧光分析(图3)检测到的表达c7细胞的数量与由pcr和sanger测序(图2)示出的观察到的hdr频率相匹
配。因此，由细胞提取物的蛋白质印迹分析进一步证明利用两种类型的aav6(对称的和不对称的)的恢复的c7高表达，类似于健康供体样品。这表明我们可以使用这两种供体来治疗rdeb患者细胞，增加可以经受这种基因治疗的rdeb患者群体。
[0114]
基因校正的rdeb角质形成细胞的长期植入测试
[0115]
在aav6和rnp处理后高百分比的表达c7的细胞应该足够用于实现皮肤粘附恢复。为了评估健康皮肤再生潜力的等级，将健康的、未经处理的和基因编辑的大量角质形成细胞群体与c7无效成纤维细胞相结合，用于生成移植到裸鼠上的皮肤等效物。h&e组织学分析示出，来自健康角质形成细胞和基因编辑的角质形成细胞的移植物中皮肤结构正常，而在未经处理的患者1的移植物中观察到一些水疱。免疫组织化学c7检测示出，来自rdeb患者1的未经处理的角质形成细胞的再生组织中没有c7表达(图4，a)。另一方面，在aav6与rnp处理后，来自rdeb角质形成细胞的移植物(p1经编辑的角质形成细胞)示出在再生皮肤的基底膜中的c7表达(图4，b)，以与从健康供体角质形成细胞再生的移植物相似的方式(图4，c)。所有的组织样本都示出正确的上基部的人外皮蛋白表达，证实正常的人表皮分化(图4，d、e和f)。
[0116]
含e79突变的rdeb患者中的基于hdr的校正
[0117]
供体模板覆盖更多col7a1内的外显子，使得在基因的不同点进行基因校正是可行的。因此，在示出携带外显子80突变的患者细胞(患者1)的相关校正效率后，我们测试了外显子79-80融合策略以校正携带纯合e79突变的rdeb患者(患者2；p2)。我们仅仅测试了包含对称臂的aav6来进行这种转导。与之前处理的p1相比，通过pcr基因分型示出相似的基于hdr的校正比率(图5)。此外，通过对rdeb p2处理的细胞进行免疫荧光，我们评估c7表达恢复，示出在大量经编辑群体中的显著百分比的阳性c7细胞。
[0118]
cd34

和msc基因编辑细胞作为eb骨髓移植的细胞来源
[0119]
最近，hsct已被认为是用于eb治疗的一种治疗选择方案。尽管hsct提供改善症状的益处，但是它具有一些并发症。含有基因校正细胞的同种异体hsct可以克服这一障碍并且提供更安全的治疗方案。cd34

和msc是骨髓中的主要干细胞类型，由此，我们利用rnp加aav6策略以针对来自三名健康供体的脐血分离的cd34

和msc细胞，以测试针对另一种相关细胞类型的本方法用于rdeb治疗的潜力。
[0120]
5天后，通过pcr我们分析了cd34 基因校正，并且我们发现与以含相同供体模板的aav6处理的hk p1细胞相似的基因校正比率(图6)。对于cd34 细胞，我们测试了两种不同的moi(5k和10k)，并且没有观察到基于hdr的校正效率的差异。此外，比较不同的细胞供体，没有示出hdr事件的差异。以类似的方式，在所有测试的细胞供体中，来自三个健康供体的msc示出接近50％的精确校正百分比。在每种细胞供体之间没有观察到编辑效率的明显差异，支持这种基因组编辑方法的稳固性。这项研究提供了一个概念验证，即骨髓干细胞适用于以所提出的策略进行基因校正治疗并且它们可以为eb治疗提供不同的潜在益处。