用于治疗SARS-COV-2病毒的糖皮质激素受体(GR)调节剂的制作方法

用于治疗sars-cov-2病毒的糖皮质激素受体(gr)调节剂
技术领域
1.本发明提供了基于新提供的治疗机制的新颖疗法。更具体地，本发明人发现糖皮质激素可以通过先前未知的机制起作用，所述先前未知的机制涉及与细胞间粘附分子(icam)结合。这为治疗危及生命的疾病，诸如由sars-cov-2引起的严重急性呼吸道疾病covid-19，开辟了新的治疗方式。


背景技术：

2.粘附分子是在细胞表面上表达的糖蛋白，其介导两个细胞之间(同型和异型相互作用)或细胞与细胞外基质之间的接触(hua等人，2013年，其特此以引用的方式整体并入)。icam是免疫球蛋白超家族的i型跨膜糖蛋白，其是在免疫细胞表面上表达的抗原诸如白细胞整合素的配体。
3.已知icam-1是鼻病毒的主要表面受体(staunton等人,1989；bhella,2015；两者均特此以引用的方式整体并入)。虽然icam-1一直是许多研究的主要焦点(hua等人)，但icam家族还有四个其他成员，表示为icam2、3、4和5。
4.icam3(也称为cd50)是由淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞(以及由淋巴瘤细胞和一些黑色素瘤、肉瘤和其他癌细胞，以及细支气管上皮细胞)表达。有关潜在icam3基因的信息可在线获取，例如在ensemble数据库中；参见条目ensg00000076662。icam3介导的信号传导通过icam3细胞内结构域中的ylpl基序募集src来进行，导致pi3k-akt磷酸化级联反应(shen等人，2018年，其特此以引用的方式整体并入)。icam3在嗜酸性粒细胞上的表达因暴露于适度浓度的地塞米松(100pm至1μm)而降低(juan等人，1999年，其特此以引用的方式整体并入)。icam3是病毒的候选细胞进入受体。例如，icam3已被提议在hiv-1进入中发挥作用，因为一些icam3特异性抗体显著抑制病毒生命周期中的早期事件(sommerfelt和asjo，1995年；barat等人，2004年；两者均特此以引用的方式整体并入)。如下文更详细讨论的，据报道某些icam3基因变体与严重急性呼吸综合征(sars)的发病机制相关(chan等人，2007年，其特此以引用的方式整体并入)。
5.icam4最初被命名为
‘
lw糖蛋白’，并且其表达被认为主要局限于红细胞，尽管最近的研究表明它也由巨噬细胞表达(choi等人，2017年，其特此以引用的方式整体并入)。有关潜在icam4基因的信息可在线获取，例如在ensemble数据库中；参见条目ensg00000105371。icam4是一些病原体诸如结核分枝杆菌和恶性疟原虫的候选细胞进入受体(bhalla等人，2015年)。
6.冠状病毒是单链rna病毒家族。有四种冠状病毒；即α冠状病毒(α-cov)、β冠状病毒(β-cov)、γ冠状病毒(γ-cov)和δ冠状病毒(δ-cov)(chan等人，2013年，其特此以引用的方式整体并入)。已知有几种冠状病毒会引起人类疾病。在分别由β冠状病毒sars-cov(在本文中也称为sars-cov-1或
‘
cov1’)和mers-cov引起致命的sars和mers流行病之后，另一种β冠状病毒导致了称为covid-19的大流行病，其在2020年传遍全球。covid-19的病因是sars-cov-2病毒，根据基因组序列同源性，所述病毒与原始sars-cov的同源性为大约79％(wang
sign和dc-sign。本发明人然后进行了分子建模研究，并发现sars-cov-2的受体结合结构域(rbd)与icam3的结合能比sars-cov-2的rbd与ace2的结合能更有利。类似地，本发明人进行的初步微量热泳动实验表明，sars-cov-2的受体结合结构域(rbd)与icam3的结合亲和力(kd)低于sars-cov-2的rbd与ace2的结合亲和力。这些发现使本发明人得出了一个惊人的结论，即高剂量糖皮质激素疗法可具有将抑制sars-cov-2感染靶细胞的多种协同作用。这代表了一种治疗covid-19的重要新方法。
16.当以高剂量施用时，糖皮质激素可以被icam3
‘
吸收’，所述icam3在诸如淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞的细胞上大量表达，也在细支气管细胞上表达，并因此不通过糖皮质激素受体起作用。不希望受理论束缚，本发明人相信这种与icam3的结合可导致新颖自然杀伤t(nkt)细胞从脾脏、胸腺或骨髓中产生和动员到循环中。这些新颖nkt细胞可以识别并靶向sar cov2感染的细胞来进行破坏。糖皮质激素与icam3的结合也可导致细胞被标记为被淋巴细胞(诸如nkt细胞和cd8 t细胞)攻击。icam3脱落也可在糖皮质激素结合后发生，如果icam3是细胞进入的主要受体，那么这进一步刺激免疫反应并防止sars-cov-2病毒通过呼吸道进入体内。icam3是人体中asp糖基化程度最高的蛋白质之一，这可有助于其在阻断sars-cov-2细胞进入方面的作用，例如一旦溶解。另外，诸如地塞米松的糖皮质激素分子与icam3的结合可增强其与l-sign和dc-sign的结合，从而取代sars-cov-2与这些蛋白质的结合。
17.此外，如上所述，本发明人认为icam3代表了sars-cov-2病毒进入细胞的重要进入点；所述细胞特别是高度表达icam3的免疫细胞。因此，糖皮质激素对icam3的占据抑制sars-cov-2进入这些细胞，为保护患者的免疫系统免受病毒损害提供了重要方式。此外，如果细胞确实感染了sars-cov-2，那么糖皮质激素对icam3的占据会标记受感染的细胞，例如通过上述机制来进行破坏。因此，这类剂对icam3的结合代表了遏制sars-cov-2病毒在个体体内传播的潜在协同方式。因此，本文所描述的治疗代表了遏制covid-19传播的潜在重要方式。
18.因此，在第一方面，本发明提供了一种抑制sars-cov-2病毒进入宿主细胞的方法，所述方法包括使细胞与糖皮质激素受体(gr)调节剂接触。gr调节剂可通过与存在于宿主细胞表面处的细胞间粘附分子3(icam3)结合而起作用，例如作为icam3激动剂或拮抗剂。因此，gr调节剂可抑制sars-cov-2的刺突(s)糖蛋白与存在于宿主细胞表面处的icam3结合。在一些实施方案中，gr调节剂引起icam3从宿主细胞表面脱落到细胞外空间中。在呼吸道中，这种icam3脱落可阻止sars-cov-2病毒进入体内。在一些实施方案中，gr调节剂接触另一种细胞并引起icam3从所述另一种细胞表面脱落到细胞外空间中。脱落到细胞外空间中的icam3可抑制sars-cov-2与宿主细胞表面的结合。在一些实施方案中，已经脱落到细胞外空间中的icam3抑制sars-cov-2与宿主细胞表面处的l-sign和/或dc-sign结合。在一些实施方案中，已经脱落到细胞外空间中的icam3与sars-cov-2自身结合，从而减少其与宿主细胞表面处的icam3、l-sign和/或dc-sign结合。
19.在一些实施方案中，gr调节剂通过结合sars-cov-2来阻断sars-cov-2与其在宿主细胞上的病毒进入受体的结合而起作用。
20.在一些实施方案中，宿主细胞是免疫细胞，例如淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞或树突细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是肺细胞，例如2型肺泡细胞或
细支气管细胞，诸如细支气管上皮细胞。
21.如本文所讨论的，gr调节剂可以是糖皮质激素。在一些实施方案中，糖皮质激素选自由以下组成的组：地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松、泼尼松龙、泼尼立定、可的松、布地奈德、倍他米松、氟米松和倍氯米松。优选地，糖皮质激素是地塞米松，例如地塞米松碱或地塞米松磷酸钠。
22.在另一个方面，本发明提供了一种治疗患者的covid-19的方法，所述方法包括以足够高的剂量施用糖皮质激素受体(gr)调节剂以抑制sars-cov-2颗粒感染患者细胞和/或以足够高的剂量施用以支持或触发患者对sars-cov-2的有效免疫反应。在一些实施方案中，gr调节剂可对可能感染sars-cov-2的icam3表达细胞具有直接杀伤作用。
23.在一个相关方面，本发明提供了一种用于治疗患者covid-19的方法中的糖皮质激素受体(gr)调节剂，所述方法包括以足够高的剂量施用gr调节剂以抑制sars-cov-2颗粒感染患者细胞和/或以足够高的剂量施用以支持或触发患者对sars-cov-2的有效免疫反应。
24.在一个相关方面，本发明提供了糖皮质激素受体(gr)调节剂在制造用于治疗患者covid-19的药剂中的用途，其中治疗包括以足够高的剂量施用所述药剂以抑制sars-cov-2颗粒感染患者细胞和/或以支持或触发患者对sars-cov-2的有效免疫反应。
25.在一些实施方案中，所述gr调节剂是糖皮质激素，例如地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松、泼尼松龙、泼尼立定、可的松、布地奈德、倍他米松、氟米松和倍氯米松。优选地，糖皮质激素是本文所公开的地塞米松化合物或制剂。gr调节剂的剂量为至少约12mg/kg、至少约15mg/kg、至少约18mg/kg、至少约24mg/kg、至少约30mg/kg或至少约45mg/kg人体等效剂量(hed)的地塞米松碱。患者优选是人类患者。因此，在本发明的治疗相关方面对人类患者进行的情况下，并且在地塞米松化合物用于治疗的情况下，地塞米松剂量可以是至少约12mg/kg、至少约15mg/kg、至少约18mg/kg、至少约24mg/kg、至少约30mg/kg或至少约45mg/kg。
26.在一些实施方案中，通过与存在于患者的免疫细胞表面处的细胞间粘附分子3(icam3)结合，sars-cov-2颗粒被抑制感染所述免疫细胞。gr调节剂可作为icam3激动剂或拮抗剂起作用。gr调节剂可起作用来抑制sars-cov-2的刺突(s)糖蛋白与存在于免疫细胞表面处的icam3结合。免疫细胞可以是淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞或树突细胞。
27.在一些实施方案中，sars-cov-2颗粒被抑制感染患者的肺细胞。高剂量的gr调节剂可引起icam3(从肺细胞和/或其他细胞)脱落到细胞外空间中，并且这种已经脱落到细胞外空间中的icam3可抑制sars-cov-2与肺细胞表面的结合。已经脱落到细胞外空间中的icam3可抑制sars-cov-2与肺细胞表面处的l-sign和/或dc-sign结合。在一些实施方案中，肺细胞是2型肺泡细胞和/或细支气管细胞。在一些实施方案中，肺细胞是2型肺泡细胞。在一些实施方案中，肺细胞是细支气管细胞，诸如细支气管上皮细胞。
28.在一些实施方案中，gr调节剂通过结合sars-cov-2颗粒，从而使sars-cov-2颗粒被抑制与其在患者细胞上的病毒进入受体的结合而起作用。
29.在一些实施方案中，对患者的covid-19的治疗触发或支持有效免疫反应。(术语
‘
触发或支持’旨在涵盖触发和支持这些免疫反应的治疗；因此术语
‘
触发或支持’可替代
‘
触发和/或支持’)。有效免疫反应可被触发或支持是因为高剂量的gr调节剂可诱导和/或
动员免疫细胞对抗病毒：
30.高剂量的gr调节剂可通过诱导和/或动员nkt细胞群来触发或支持有效免疫反应，所述nkt细胞的特征在于表达cd3，并且：
31.a.表达cd4、cd8、cd45、cd49b(人体内的cd56)、cd62l、nk1.1、ly6g、sca1和/或tcrγ/δ；和/或
32.b.不表达：c-kit、b220、foxp3和/或tcrα/β。
33.高剂量的gr调节剂可通过诱导和/或动员t细胞群来触发或支持有效免疫反应，所述t细胞表达cd3至极高水平(“cd3极高”)。
34.高剂量的gr调节剂可通过诱导和/或动员树突细胞(dc)群来触发或支持有效免疫反应，所述树突细胞表达cd11b至极高水平(“cd11b极高树突细胞”)。
35.本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除非这种组合是明显不允许的或明确避免的。
附图说明
36.现将参考附图来论述说明本发明的原理的实施方案和实验，在附图中：
37.图1.人dc-sign、l-sign、sars-cov和sars-cov-2刺突糖蛋白的序列比对。指出了sars-cov-2刺突与dc/l-sign之间的同源区域。sars-cov刺突糖蛋白不具有这种同源性。
38.图2.icam3的氨基酸序列。加下划线的残基是位置52、84、87、101、110、134、206、264、295、308、320、363、389、453和457处的n-连接糖基化天冬酰胺残基。
39.图3.与地塞米松碱(1nm
–
250μm)一起孵育4小时后的脾细胞活力。
40.图4.ace2与sars-cov-2的刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)对接的cluspro模型(左图)。对接模型的rosetta干扰分数图(右图)。
41.图5.icam3与sars-cov-2的刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)对接的cluspro模型(左图)。对接模型的rosetta干扰分数图(右图)。
42.图6.icam3与sars-cov-1的刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)对接的cluspro模型(左图)。对接模型的rosetta干扰分数图(右图)。
43.图7.来自cluspro建模的独立重复和预测的结合能量学的结果。图7a示出了ace2与sars-cov-2刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)对接的重复对接模型的rosetta干扰分数图。图7b示出了icam3与sars-cov-2刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)对接的重复对接模型的rosetta干扰分数图。图7c示出了icam3与sars-cov-1刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)对接的重复对接模型的rosetta干扰分数图。
44.图8.sars-cov-2受体结合结构域、icam3和dc-sign结合相互作用的cluspro模型。当sars cov2 spike rbd(左下分子)与icam3(上分子)结合时，dc-sign(右下分子)不能结合，反之亦然。
具体实施方式
45.现在将参考附图论述本发明的方面和实施方案。其他方面和实施方案对于本领域技术人员来说将显而易见。本文中提及的所有文件均以引用的方式并入本文。
46.sars cov2
47.sars cov2(cov2)的早期症状与导致急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ards)的流感症状不同，ards是sars cov(cov1)的标志。cov2的早期症状包括细支气管介导的无症状低氧血症，而不是肺泡驱动的ards。cov1 spike在感染/发病机制中使用ace2、l-sign(窦内皮细胞)和dc-sign(树突细胞)。signs在rbd外结合cov1 spike(jeffers，2004年；marzi，2004年)。由cov1引起的淋巴细胞感染并不常见(panesar 2008)，而由cov2引起的淋巴细胞(shih 2020；feng 2020)和单核细胞(zhang2020)感染较为常见。cov2 spike并非cov1 spike可以感染不表达或表达很少ace2的t淋巴细胞(wang 2020)。这些数据表明cov2可使用其他受体实现细胞进入。icam3是最大程度甘露糖基化的(对病毒结合至关重要)；其表达仅限于淋巴细胞、单核细胞、粒细胞以及肺泡和细支气管上皮细胞(人类蛋白质组计划；attc)，并且与ards的严重程度有关(chan 2007)，表明其是cov2 spike结合的候选者。hek293细胞，作为常见的cov2相互作用筛选，不表达icam3。
48.基于covid-19患者的症状和所发现的生物学，这是一种与sars cov1完全不同的疾病，本发明人已经在寻找除hace2之外的sars cov2进入的潜在受体。covid-19患者的早期症状表现为无症状低氧血症，这是一种细支气管介导的病理，而不是肺泡介导的ards。细支气管表达icam3，而不是ace2。此外，与通过与dc-sign和l-sign结合来感染树突细胞的sars cov1不同，sars cov2会感染大量且选择性地表达icam3的淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞。dc-sign和l-sign是icam3的天然配体，icam3是在淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、细支气管细胞和癌细胞上选择性表达的受体(人类蛋白质组计划)。
49.报道还表明，使用吸入类固醇的患者对感染有80％的保护，而使用ace抑制剂或受体阻断剂的患者不具有保护作用。预期吸入地塞米松会在体外裂解icam3，地塞米松从细胞中裂解icam3，并且据报道地塞米松会降低重症covid-19患者的死亡率(horby等人，2021年)。
50.n连接的糖基化
51.icam3是人体中asp糖基化程度最高的蛋白质之一。天冬酰胺残基(asp)被连接在酰胺侧基的氮上的聚糖修饰。这是一种生物学上重要的翻译后修饰，它在内质网中始于包含三个甘露糖亚基的核心聚糖的转移。其他修饰可发生在高尔基体(golgi apparatus)中和/或可能分泌糖蛋白的质膜上。
52.低水平的甘露糖结合凝集素在某些种族群体(诸如高加索人)中普遍存在(siljan等人，2018年，其特此以引用的方式整体并入)。这可能与某些病毒性疾病(诸如covid-19)引起的严重症状或并发症的易感性降低有关。
53.药理作用
54.受体拮抗剂是与受体结合的配体，因此占据受体结合位点，但不激活受体。相反，受体激动剂结合并激活受体，这通常引起信号在细胞内被转导。因此，拮抗剂可以通过与激动剂和其他受体结合剂竞争结合来发挥生物学相关作用。因此拮抗剂通常被称为
‘
阻断剂’。
55.本公开的糖皮质激素调节剂通常充当糖皮质激素受体的激动剂。然而，本技术公开了糖皮质激素受体调节剂(诸如地塞米松和其他糖皮质激素)结合细胞内粘附分子3(icam3)的惊人能力。不受理论束缚，本发明作者认为糖皮质激素受体调节剂可结合icam3并对icam3发挥拮抗作用，而不触发由icam3活化引起的正常信号级联。
56.其他机制
57.高剂量的糖皮质激素发挥强大的生物学作用，这将有助于治疗covid-19。
58.除了上述机制外，本发明作者认为高剂量糖皮质激素受体调节剂与icam3的结合可使糖皮质激素受体调节剂对icam3表达细胞产生浓度依赖性的直接杀伤作用，icam3表达细胞可以是感染sars-cov-2的icam3表达细胞。
59.因此，在一些实施方案中，gr调节剂可在与icam3结合后诱导icam3表达细胞的细胞死亡。在一些实施方案中，gr调节剂通过与icam3结合来诱导icam3表达细胞的细胞凋亡。在一些实施方案中，gr调节剂触发或支持针对icam3表达细胞的有效免疫反应。在一些实施方案中，gr调节剂引起icam3从细胞表面脱落到细胞外空间中。在一些实施方案中，gr调节剂引起icam3表达细胞被标记为被免疫细胞攻击。在一些实施方案中，gr调节剂直接触发(激活)细胞凋亡途径。
60.通过标记细胞进行免疫攻击的生物作用
61.单核细胞和巨噬细胞是吞噬性白细胞，它们在脊椎动物的非特异性和特异性防御机制中都起作用。它们的作用是吞噬(吞没，然后消化)死亡和垂死的细胞、细胞碎片和病原体，无论是静止细胞还是移动细胞，并刺激淋巴细胞和其他免疫细胞对病原体作出反应。吞噬性白细胞募集的分子机制被认为涉及识别垂死细胞表面上的分子
‘
标记’，这些分子标记被结合并允许垂死细胞被吃掉和破坏(gregory&pound，2010年，特此以引用的方式整体并入)。icam3已被证明功能改变后在垂死细胞上充当此类分子
‘
标记’(moffat等人1999年，特此以引用的方式整体并入)。
62.不受理论束缚，本发明作者认为急性高剂量糖皮质激素对icam3表达细胞的直接杀伤作用可通过糖皮质激素与icam3的结合介导，引起icam3表达细胞被标记为被巨噬细胞和/或白细胞(诸如nkt细胞和cd8 t细胞)攻击。这些可包括本发明作者已证明由高浓度糖皮质激素诱导/动员的免疫细胞，如下文更全面地描述。
63.糖皮质激素结合后的icam3脱落通过充当趋化信号促进巨噬细胞/吞噬细胞募集到icam3已脱落的细胞位点，可进一步刺激针对这些细胞类型的免疫反应(例如在torr等人2012中描述，该案特此以引用的方式整体并入)。募集到icam3已脱落的细胞位点的细胞可包括本发明作者已证明由高浓度糖皮质激素诱导/动员的免疫细胞，如下文更全面地描述。本发明作者假设，地塞米松结合后的icam3脱落可有助于在超高浓度糖皮质激素后动员这些新颖免疫细胞。icam3脱落还可阻止sars-cov-2病毒通过icam3进入细胞，icam3是一种细胞进入受体。
64.因此，在本公开的方法的一些实施方案中，gr调节剂引起icam3从细胞表面脱落到细胞外空间中。在一些实施方案中，由细胞表达的总icam3的至少约10、20、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或99％脱落到细胞外空间中。在一些实施方案中，icam3引发细胞上icam3的表面表达减少至少约10、20、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或99％。在一些优选实施方案中，由细胞表达的总icam3的至少约30或40％脱落到细胞外空间中。在一些优选实施方案中，icam3引发细胞上icam3的表面表达减少至少约35或40％。用于确定icam3表达和脱落的程度和变化的合适方法是本领域技术人员熟知的，例如juan等人(特此以引用的方式整体并入)中描述的方法。
65.通过诱导免疫细胞的生物作用
66.高剂量的糖皮质激素发挥强大的生物学作用，这将有助于治疗covid-19。人体等效剂量(hed剂量)为18mg/kg及以上的avm0703可动员非常活跃的自然杀伤t细胞，所述t细胞以极高的水平表达cd3(avm_nkt细胞)，如果没有这种高剂量治疗，循环中原本不会发现这种细胞。这种细胞类型将在下文更详细地讨论。因此，糖皮质激素与icam3的结合可导致新颖自然杀伤t(nkt)细胞从脾脏、胸腺或骨髓中产生和动员到循环中。这些新颖nkt细胞可以识别并靶向sar cov2感染的细胞来进行破坏。
67.在18mg/kg地塞米松和更高的hed下，除了动员上述avm_nkt细胞外，还诱导了新颖的cd3极高的t细胞和cd11b极高的树突细胞。令人惊讶的是，这些剂量的糖皮质激素似乎不会激活gr，因为它们在等效浓度下在体外对全血或脾细胞没有活性(参见下文实施例2)，并且在体内对结肠、胰腺或骨骼没有影响，如果gr被激活，这些作用都是可以预期的。在体内，只有淋巴细胞、单核细胞、一些嗜中性粒细胞和癌细胞已被消融。在地塞米松给药后仅6小时就可以看到几乎完全消融，这表明起效迅速，其可优于作用较慢的covid-19替代物，后者可能需要数天才能生效。最重要的是，本文所描述的新颖nkt群的t淋巴细胞组分可为患者提供长期免疫，如果他们再次暴露于病毒，这将是保护性的。
68.据报道，重度covid-19患者已出现淋巴细胞减少症(研究由广州自然科学基金支持；s2018010009732，作者未公开；以及xu等人2020)，因此本发明人并没有预见到由根据本发明的高剂量糖皮质激素对淋巴细胞计数引起的任何恶化作用。此外，通过动员cd3极高的nk、cd3极高的t细胞和cd11b极高的树突细胞，这种治疗触发了直接杀伤和吞噬病毒的机制。报道了淋巴细胞减少症的同一项研究并未发现重度covid-19患者中典型nkt细胞的减少。任何covid-19患者的血液中均不存在avm-nkt细胞，因为未观察到细胞以比典型nkt高1-1.5log的平均荧光强度(mfi)表达cd3，这表明内源性皮质醇在covid-19患者中不足以动员这个avm_nkt细胞群。
69.avm_nkt细胞是nkp46 和ly6g阳性的，表明有可能直接杀死靶标并吞噬它们。上文总结的典型avm_nkt受cd1d限制，不表达ly6g。cd11b极高的树突细胞也被这些剂量的avm0703激活。在体内，糖皮质激素在初始小鼠口服给药后6小时内消融除nk和nkt细胞以及单核细胞以外的淋巴细胞。在肿瘤模型中，未在血液中观察到新颖nkt和t细胞。然而，在给药的48小时内，可以在肿瘤内的形成物中围绕剩余活性肿瘤的区域发现nkp46 细胞和ly6g 细胞，这些细胞不是巨噬细胞，因为它们对f4/80是阴性的。这表明了这些细胞的功能效力。
70.除了已知的nkt细胞特性和nkt细胞靶向免疫疗法的优势之外，新颖avm_nkt细胞还提供了一个额外的优势，因为它们可将直接靶细胞吞噬添加到其他诱导nkt(inkt)细胞的已知杀伤特性中。这种功能归因于avm_nkt独特的ly6g和tcrγδ表达。此外，avm_nkt是由高剂量糖皮质激素诱导的，因此原则上大量可用，而数量有限的天然nkt(和inkt细胞)不足以用于老年人的自体疗法，老年人对于covid-19是最脆弱的。
71.糖皮质激素受体调节剂
72.如本文所用，术语糖皮质激素受体(gr)调节剂包括糖皮质激素、糖皮质激素受体激动剂和与糖皮质激素受体结合的任何化合物。诸如糖皮质激素的糖皮质激素受体(gr)调节剂通过激活或阻抑基因表达的膜gr和细胞质gr两者发挥它们的作用。糖皮质激素和gr调节剂的一些合乎需要的淋巴细胞清除作用被认为是通过膜gr或除其基因组效应之外的其
他非基因组效应介导的。据报道，糖皮质激素对淋巴细胞水平具有不同的影响，这取决于所施用的糖皮质激素的浓度和治疗的持续时间。一般而言，在通常用于慢性疗法的低剂量下，据报道糖皮质激素使淋巴细胞从外周血重新分布到骨髓中，在中等剂量下，据报道糖皮质激素引起白细胞增多症，这被认为是白细胞从骨髓、脾脏和胸腺重新分布到外周血中，并且在高剂量下，糖皮质激素通过触发细胞凋亡和坏死性凋亡而对淋巴细胞具有淋巴毒性作用。作用的持续时间也取决于剂量水平；例如fauci等人(1976)报道单次口服0.24mg/kg地塞米松剂量抑制80％的外周血t和b淋巴细胞，从12小时开始恢复并且到24小时恢复正常水平。本发明作者先前已经证明(在国际专利申请pct/us2019/054395中)，需要3mg/kg或更多的地塞米松急性口服剂量以在施用后24-48小时减少外周血t和b细胞，在给药后约5至14天恢复至基线水平。
73.在本公开方法的一些实施方案中，糖皮质激素受体(gr)调节剂是糖皮质激素。在一些此类实施方案中，糖皮质激素可选自由以下组成的组：地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松、泼尼松龙、泼尼立定、可的松、布地奈德、倍他米松、氟米松和倍氯米松。在一些优选的实施方案中，糖皮质激素可选自由以下组成的组：地塞米松、倍他米松和甲泼尼龙。在一些特别优选的实施方案中，糖皮质激素可以是地塞米松或倍他米松。
74.在本公开方法的一些实施方案中，糖皮质激素可以是地塞米松，例如地塞米松碱、地塞米松磷酸钠、半琥珀酸地塞米松、地塞米松琥珀酸钠、琥珀酸地塞米松、异烟酸地塞米松、21-乙酸地塞米松、磷酸地塞米松、21-磷酸地塞米松、丁乙酸地塞米松(dexamethasone tebutate)、17-戊酸地塞米松、一水合乙酸地塞米松、特戊酸地塞米松、棕榈酸地塞米松、21-棕榈酸地塞米松、二丙酸地塞米松、丙酸地塞米松、无水乙酸地塞米松、21-苯丙酸地塞米松、21-磺基苯甲酸地塞米松、半硫酸地塞米松、硫酸地塞米松、地塞米松beloxil、地塞米松酸、乙呋地塞米松、地塞米松甲酰亚胺(dexamethasone carboximide)、地塞米松培酯(dexamethasone cipecilate)、地塞米松21-磷酸二钠盐、甲磺酸地塞米松、亚油酸地塞米松、地塞米松葡糖苷、地塞米松葡糖苷酸、碘乙酸地塞米松、地塞米松氧杂环丁酮、羧甲基硫代-地塞米松、地塞米松双乙肟(dexamethasonebisethoxime)、地塞米松环氧化物、反亚油酸地塞米松(dexamethasone linolelaidate)、甲基原戊酸地塞米松、地塞米松精胺、6-羟基地塞米松、三丁基乙酸地塞米松、地塞米松天冬氨酸、地塞米松吡喃半乳糖、盐酸地塞米松、羟基地塞米松、羧基地塞米松、脱氧地塞米松、地塞米松丁氮酮(dexamethasone butazone)、地塞米松环糊精、二氢地塞米松、氧代地塞米松、丙酰氧基地塞米松、地塞米松半乳糖苷(dexamethasone galactodie)、异烟酸地塞米松、地塞米松磷酸氢二钠、地塞米松醛、特戊酸地塞米松、三癸酸地塞米松(dexamethasone tridecylate)、巴豆酸地塞米松、甲磺酸地塞米松、丁基乙酸地塞米松、脱氢地塞米松、地塞米松异硫氰酸基乙基)硫醚、溴乙酸地塞米松、半戊二酸地塞米松、脱氧地塞米松、地塞米松苯丁酸氮芥(dexamethasone chlorambucilate)、地塞米松美法仑(dexamethasone melphalanate)、甲酰氧基地塞米松、丁酸地塞米松、月桂酸地塞米松、乙酸地塞米松以及任何含有一种形式的地塞米松的组合治疗。在一些优选实施方案中，糖皮质激素可以是地塞米松碱或地塞米松磷酸钠。
75.可用于所公开的方法中的糖皮质激素受体(gr)调节剂包括例如选择性糖皮质激素受体调节剂(segrm)和选择性糖皮质激素受体激动剂(segra)。可用于所公开的方法中的糖皮质激素、选择性糖皮质激素受体调节剂和选择性糖皮质激素受体激动剂(segra)是本
领域技术人员熟知的。
76.一些此类糖皮质激素包括但不限于地塞米松、含地塞米松的剂、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松、可的松、布地奈德、倍他米松和倍氯米松。其他糖皮质激素包括泼尼松龙、糠酸莫米松、曲安奈德(triamcinolone acetonide)和甲泼尼龙。
77.在一些实施方案中，糖皮质激素受体调节剂可以不是上述剂中的一种或多种。
78.高剂量糖皮质激素制剂
79.本发明人先前已经表明，即使当制剂包含减少量或不包含防腐剂(例如抗氧化剂)时，也可以制备稳定的高浓度糖皮质激素制剂。确保良好稳定性的高浓度糖皮质激素制剂的一个方面是顶空体积(ml)与糖皮质激素(mg)的比率。例如，本发明人在国际专利申请pct/us2019/061363中表明，一种称为avm0703的地塞米松磷酸钠溶液尤其受到青睐。avm0703含有26.23mg/ml地塞米松磷酸钠(相当于24mg/ml磷酸地塞米松，dp)、10mg/ml柠檬酸钠、0.5mg/ml依地酸二钠和0.035mg/ml亚硫酸钠(无水)。这些高浓度糖皮质激素制剂可用于本发明的方法和治疗的一些实施方案中。
80.糖皮质激素剂量计算
81.在本公开的方法中，糖皮质激素受体(gr)调节剂以高剂量施用，优选以相当于约至少18mg/kg地塞米松碱的人体等效剂量(hed)的剂量施用。另一种糖皮质激素或糖皮质激素受体调节剂的等效剂量可使用公开可用的类皮质激素转换算法，优选http://www.medcalc.com快速且容易地计算。举例而言，18mg/kg地塞米松转换为112.5mg/kg泼尼松。由于泼尼松的生物半衰期是约20小时，而地塞米松的生物半衰期是约36至54小时，所以为实现等效的生物给药，泼尼松将每24小时以约112.5mg/kg进行给药。更具体地，18mg/kg地塞米松剂量对应于将需要每24小时重复给药约两次至约三次剂量的112.5mg/kg泼尼松龙剂量。10mg/kg倍他米松剂量为约12mg/kg地塞米松并且具有与地塞米松相似的药效学(生物)半衰期。
82.本技术中的地塞米松剂量以人体等效剂量(hed)给出。用于计算人体等效剂量(hed)的方法是本领域已知的。例如，fda的药物评估和研究中心(cder)在2005年发布了一个高被引指导文件(美国卫生部cder，2005)，在所述文件的第7页的表1列出了所确定的用于基于体表面积将动物剂量转换为hed的算法(用于推断物种间剂量的普遍接受的方法)。作为参考，将表1复制如下。本领域技术人员将理解，如下所述，从以mg/kg为单位的动物剂量，使用表1右侧栏中的标准转换因子容易地计算hed：
[0083][0084]
表1：基于体表面积将动物剂量转换为人体等效剂量
[0085]a假设人类体重为60kg。对于未列出的物种或重量超出标准范围的物种，hed可通过以下公式计算：
[0086]
hed＝以mg/kg为单位的动物剂量x(动物体重kg/人体重kg)
0.33
。
[0087]b此km值仅供参考，因为健康儿童很少会成为1期试验的志愿者。
[0088]c例如，食蟹猴、恒河猴和短尾猴。
[0089]
在本公开方法的一些实施方案中，糖皮质激素受体(gr)调节剂可以相当于约至少6mg/kg、12mg/kg、15mg/kg、18mg/kg、24mg/kg、30mg/kg或约至少45mg/kg地塞米松碱的人体等效剂量(hed)的剂量施用。在一些优选实施方案中，糖皮质激素受体(gr)调节剂可以相当于约6mg/kg、12mg/kg、15mg/kg、18mg/kg、24mg/kg、30mg/kg或约45mg/kg地塞米松碱的人体等效剂量(hed)的剂量，或至少相当于约6mg/kg、约12mg/kg、约15mg/kg、约18mg/kg、约24mg/kg、约30mg/kg或约45mg/kg地塞米松碱的hed的剂量值的剂量施用。在一些优选实施方案中，糖皮质激素受体(gr)调节剂可以相当于约至少6mg/kg地塞米松碱的人体等效剂量(hed)的剂量施用。在一些其他优选实施方案中，糖皮质激素受体(gr)调节剂可以相当于约至少18mg/kg地塞米松碱的人体等效剂量(hed)的剂量施用。
[0090]
在本公开方法的一些实施方案中，糖皮质激素受体(gr)调节剂可以相当于约至少6-45mg/kg地塞米松碱的人体等效剂量(hed)；约至少15-24mg/kg地塞米松碱的人体等效剂量(hed)；约至少6-12mg/kg地塞米松碱的人体等效剂量(hed)；或约至少12-15mg/kg地塞米松碱的人体等效剂量(hed)；或约至少18-30mg/kg地塞米松碱的人体等效剂量(hed)的剂量
施用。
[0091]
在本公开的方法中，糖皮质激素受体(gr)调节剂可作为单一急性剂量施用，或作为在约24、48或72小时时间段内给予的总剂量施用。在一些优选实施方案中，糖皮质激素受体(gr)调节剂作为单一急性剂量施用。在其他优选实施方案中，糖皮质激素受体(gr)调节剂作为在约72小时时间段内给予的总剂量施用。
[0092]
施用途径
[0093]
如本文所用，术语“施用”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将剂物理引入受试者中。本文公开的剂的示例性施用途径包括静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用的短语“胃肠外施用”意指除经肠和局部施用外的施用方式，通常通过注射进行，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注以及体内电穿孔。在一些实施方案中，本文公开的剂可通过非肠胃外途径(例如口服)施用。其他非肠胃外途径包括经局部、经表皮或经粘膜施用途径，例如鼻内、经阴道、经直肠、舌下或经局部施用。
[0094]
如本文所用的短语“全身注射”非排他地涉及静脉内、腹膜内、皮下、经鼻粘膜下层、舌下、经支气管镜检查、静脉内、动脉内、肌肉内、眼内、纹状体内、皮下、皮内、通过真皮贴剂、通过皮肤贴剂、通过贴剂、进入脑脊液、进入门静脉、进入脑、进入淋巴系统、胸膜内、眶后、真皮内、进入脾脏、淋巴管内等等。
[0095]
如本文所用的术语“注射部位”非排他性地涉及肿瘤内或器官内(诸如肾、或肝脏、或胰腺、或心脏、或肺、或脑、或脾、或眼)、肌肉内、眼内、纹状体内、真皮内、通过真皮贴剂、通过皮肤贴剂、通过贴剂、进入脑脊液、进入脑等等。在本公开的一些优选实施方案中，糖皮质激素受体调节剂可口服施用。
[0096]
在本公开的一些实施方案中，本文公开的糖皮质激素受体调节剂的施用途径可以不是上述途径中的一种或多种。
[0097]
药物组合物
[0098]
可使用由被认为安全且有效的材料构成的药学上可接受的“载剂”来制备药物组合物。“药学上可接受的”是指“一般被认为是安全的”的分子实体和组合物，例如，当施用于人时，所述分子实体和组合物在生理上是可耐受的，并且通常不会产生过敏或类似的不良反应，诸如胃部不适等。在一些实施方案中，此术语是指被美国联邦或州政府的监管机构(作为在联邦食品、药品和化妆品法第204(s)和409条下的经过fda的上市前审查和批准的gras清单或类似清单)、美国药典或另外普遍认可的药典批准用于动物、尤其是用于人的分子实体和组合物。
[0099]
术语“载剂”是指稀释剂、粘合剂、润滑剂和崩解剂。本领域技术人员熟悉此类药物载剂以及使用此类载剂复配药物组合物的方法。
[0100]
本文所提供的药物组合物可包含一种或多种赋形剂，例如溶剂、溶解度增强剂、助悬剂、缓冲剂、等渗剂、抗氧化剂或抗微生物防腐剂。当使用时，组合物的赋形剂不会对组合物中使用的活性成分(即糖皮质激素)的稳定性、生物利用度、安全性和/或功效产生不利影响。因此，技术人员将了解，提供了其中剂型的任何组分之间不存在不相容性的组合物。赋形剂可选自由以下组成的组：缓冲剂、增溶剂、张度剂、螯合剂、抗氧化剂、抗微生物剂和防
腐剂。
[0101]
细胞类型
[0102]
树突细胞是骨髓来源的白细胞，并且是哺乳动物免疫系统的最有效的抗原呈递细胞。dc对外源性和内源性抗原发挥免疫监视作用，并且随后初始t淋巴细胞的激活引起各种免疫反应。dc是负责识别病原体和组织损伤信号的岗哨细胞，所述识别诱导它们迁移至淋巴器官以激活t、自然杀伤(nk)、nkt和b淋巴细胞的不同亚群。成熟表型cdc的特征在于mhcii、cd80、cd86和cd40增加。树突细胞通常被分类为常规树突细胞(cdc)和浆细胞样树突细胞(pdc)亚群。树突细胞主要以两种基本功能状态存在：“未成熟”和“成熟”。树突细胞的激活(成熟)开启代谢、细胞和基因转录程序，从而允许dc从外周组织迁移至次级淋巴器官中的t依赖性区域，在这里可能发生t淋巴细胞激活性抗原呈递(patente等人，2018；特此以引用的方式整体并入)。树突细胞的主要功能是加工抗原物质并将其在细胞表面上呈递给t细胞，从而起始适应性免疫反应。树突细胞还产生促进病原体特异性效应t细胞分化和激活的极化细胞因子，并且可通过分泌诱导调节性t细胞分化的致耐受性细胞因子来促进自身耐受性。由本发明的方法诱导的dc可将cd11b表达至极高水平(“cd11b极高的树突细胞”)。
[0103]
t细胞是在免疫反应中起关键作用的淋巴细胞类型。t细胞与其他类型的淋巴细胞的区别在于其细胞表面上存在t细胞受体。t细胞受体(tcr)负责识别与主要组织相容性复合物(mhc)分子结合的抗原的片段，并且是两条不同蛋白质链的异二聚体。在人类中，在95％的t细胞中，tcr由alpha(α)链和beta(β)链(分别由tra和trb编码)组成，而在5％的t细胞中，tcr由gamma和delta(γ/δ)链(分别由trg和trd编码)组成。此比率在疾病状态(诸如白血病)中发生变化。与mhc限制性αβt细胞相比，γδt细胞不需要抗原加工以及主要组织相容性复合物(mhc)呈递肽表位来激活，尽管一些识别mhc ib类分子。一些γδt细胞识别由感染或肿瘤发生引起的细胞应激标志物。γδt细胞也被认为在脂质抗原的识别中起作用。由本发明的方法诱导的t细胞可将cd3表达至极高水平(“cd3极高”)。
[0104]
自然杀伤t细胞(nkt)是具有t细胞和自然杀伤(nk)细胞两者的性质的一组异质t细胞。与常规t细胞相比，nkt在它们离开胸腺时在功能上成熟，准备好用于快速细胞因子产生。nkt可直接杀死表达cd1d的癌细胞和肿瘤微环境巨噬细胞，快速产生和释放诸如ifnγ和il-4的免疫激活细胞因子，并激活诸如树突细胞(dc)、nk细胞以及b和t淋巴细胞的其他免疫细胞。
[0105]
本发明人发现了一种新型的nkt细胞，称为avm_nkt，其在用于展示检查点抑制剂功效的肿瘤杀伤模型中，非常适合患病组织，诸如肿瘤。avm_nkt仅在avm0703治疗后才被动员，与其他nk和nkt连续循环不同，因此avm_nkt数量在实践中是无限的。这些细胞已被证明降低甲型流感介导的炎症和疾病严重程度，并且cd11b dc牵涉于针对呼吸道合胞病毒和甲型流感(h1n1)的保护中。因此，已知具有较低cd3和cd11b水平的细胞是有效的，avm0703应该更有效，因为它动员的cd3极高的nkt和γ/δt细胞，而且因为它不仅增加了传统cd11b dc的数量，还动员了通常观察不到的cd11b极高表达的dc。
[0106]
ii型肺泡(at2)细胞被认为是人肺中sars-cov-2的靶标。a2t细胞是唯一合成、储存和分泌肺表面活性物质的对于表面张力调节、肺不张预防和维持肺泡内的肺泡液平衡很重要的所有组分的肺细胞(henry等人，2017年)。
[0107]
确定细胞标志物表达水平
[0108]
由本发明的方法诱导的nkt细胞、t细胞或dc表达的标志物可以通过(分别)参考例如从治疗前患者取得的典型nkt细胞、t细胞或dc群体的标志物表达水平来确定。在表达水平被称为“极高”的情况下，这可以表示与相应的典型细胞群相比，标志物的表达水平高出50％、60％、70％、80％、90％或100％。表达水平可通过流式细胞术确定。
[0109]
***
[0110]
在前文描述中或所附权利要求中或附图中公开的以其特定形式或者在用于执行所公开的功能的装置、或者用于获得所公开的结果的方法或工艺方面表述的特征在适当时可单独地或以此类特征的任何组合用于以多样化形式实现本发明。
[0111]
虽然已经结合上文描述的示例性实施方案描述了本发明，但当给出本公开时，许多等同修改和变型对于本领域技术人员而言将是显而易见的。因此，上文阐述的本发明的示例性实施方案被认为是说明性的而不是限制性的。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对所描述的实施方案进行各种变化。
[0112]
为避免任何疑问，本文提供的任何理论解释都是为了提高读者的理解。本发明人不希望受到任何这些理论解释的束缚。
[0113]
本文中所使用的任何章节标题仅出于组织目的，并且不应被视为限制所述的主题。
[0114]
在包括所附权利要求的整个说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包含(comprise)”和“包括(include)”及变型(诸如“包含(comprises/comprising)”和“包括(including)”)将理解为隐含包括规定的整数或步骤或整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或整数或步骤的组。
[0115]
必须注意，除非上下文另有明确指明，否则如在本说明书和所附权利要求中所使用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述”包括多个提及物。范围可在本文中表达为自“约”一个特定值起和/或至“约”另一个特定值止。当表示这类范围时，另一个实施方案包括从所述一个特定值和/或至所述另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表述为近似值时，应理解，特定值形成另一个实施方案。与数值相关的术语“约”是任选的并且意指例如 /-10％。
[0116]
实施例
[0117]
实施例1——人dc-sign、l-sign、sars-cov和sars-cov-2刺突糖蛋白的序列比对
[0118]
使用clustal 0(1.2.4)多序列比对工具(uniprot.org)将人cd209(dc-sign)、clec4m(l-sign)基因产物与sars-cov和sars-cov-2的刺突糖蛋白进行比对。结果如图1中所示。刺突糖蛋白显示出与dc-sign和l-sign的icam3结合区明显的同源性。
[0119]
实施例2——高浓度地塞米松缺乏对全血或脾细胞的离体作用
[0120]
离体全血或分离的脾细胞对浓度在100um至500um之间的avm0703或地塞米松碱没有反应，所述浓度是在人体等效剂量(hed)6mg/kg或更高下体内给药达峰时得到的等效浓度。这些数据表明，在癌症和感染性疾病治疗的优选剂量(hed 6mg/kg至30mg/kg)下，avm0703不会激活糖皮质激素受体，也不会激活直接在淋巴细胞、单核细胞或嗜中性粒细胞上表达的受体。我们在初始小鼠中和癌症模型中观察到的深刻体内活性应当是通过在avm0703 hed 6mg/kg或更高剂量之后所动员的超动力自然杀伤t细胞、t细胞和树突细胞介导的。
[0121]
研究了表2中所示的孵育条件。
[0122][0123]
表2.孵育条件
[0124]
结果；全血(研究6)
[0125]
用500μm地塞米松碱、50μm ru486(类固醇受体拮抗剂)或1％dmso作为对照，一式三份处理样品。由ru486处理诱导的嗜中性粒细胞没有显著增加。其他免疫细胞类型；淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞；用地塞米松碱或ru486处理时未显示出数量变化。数据表明，在全血中单独使用地塞米松碱不会诱导体内实验中所见的淋巴细胞杀伤活性。单独使用ru486对淋巴细胞也没有杀伤活性，并且可以在不影响淋巴细胞水平的情况下组合使用。
[0126]
结果；脾细胞(研究24)
[0127]
在进行测定之前将脾细胞培养16小时。在添加地塞米松碱后四小时进行流式细胞术，并且结果如图3中所示。4小时后，地塞米松碱在低于100μm的浓度下似乎具有直接杀伤活性，但在高于100μm时不会引发细胞死亡。
[0128]
研究6和24的结果表明，低浓度和高浓度地塞米松碱的作用机制不同，其中高剂量对脾细胞没有活性。这与之前的体内数据形成对比，在体内数据中脾脏的重量通过avm0703给药而急剧减少。(参见wo2018/183927和wo2020/072713；均以引用的方式整体并入，用于讨论这些体内效应)。离体和体内之间的矛盾表明与离体相比，体内发生了不同的作用机制。
[0129]
结果；维奈托克1
[0130]
当全血与安慰剂、dmso、500μm的avm0703单独孵育或与3μm维奈托克组合孵育时，cbc的任何测量参数均未发现显著差异。具体地，对白细胞没有显著影响。淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞未表现出体内观察到的淋巴细胞清除或消融。因此，这些结果表明全血中的细胞不受avm0703通过gcr激活的影响(维奈托克增加糖皮质激素敏感性)。
[0131]
结果；离体糖皮质激素比较
[0132]
为了确定对单核细胞、淋巴细胞和嗜中性粒细胞的离体效应缺乏是否是由于地塞米松碱的浓度为100μm至500μm，或avm0703中的不同赋形剂是否有作用，我们与其他市售磷
酸地塞米森相比，比较了使用avm0703之间的离体治疗和cbc分析。不同制剂之间没有明显差异，表明地塞米松碱的浓度具有出乎意料的离体作用；即令人惊讶地缺乏离体细胞死亡。
[0133]
实施例3——对sars-cov-2和sars-cov受体结合结构域与icam3和ace2的结合模式和结合能的建模
[0134]
本发明人使用cluspro在sars-cov-2的受体结合结构域(rbd)与icam3和ace2之间寻找有利的结合模式(模型)。然后，本发明人使用rosetta软件来预测每种结合模式(模型)的能量学。
[0135]
图4的左侧示出了sars-cov-2的rbd与ace2的示例性结合模式。图4右侧的图表绘制了分子界面处的均方根偏差(rmsd)与界面分数的关系，所述界面分数预测了结合能(负值越大表示放热越多，并因此结合相互作用越强)。界面分数朝向界面rmsd轴下端的“漏斗状下降”表明sars-cov-2的rbd与ace2之间的有利结合特征。
[0136]
图5的左侧示出了sars-cov-2的rbd与icam3的示例性结合模式。icam3与ace2一样对接在cov-2spike蛋白的rbd口袋中(与对接在cov1 spike rbd外部的dc-sign或l-sign的结合模式不同)。cov-2rbd-icam3结合模式预测了sars-cov-2rbd的arg408与icam3的glu 43之间的第一盐桥；和arg6与glu484之间的第二个盐桥，以及结合界面中心部分内的疏水相互作用。图5右侧的图表绘制了cov-2和icam3界面处的(rmsd)与界面分数的关系。如图4那样，图5中界面分数朝向界面rmsd轴下端的“漏斗状下降”表明sars-cov-2的rbd与icam3之间的有利结合特征。
[0137]
图6的左侧示出了sars-cov-1的rbd与icam3的示例性结合模式。结合模式预测了rbd的arg395与icam3的glu 43之间的单个盐桥。与图4和图5相反，图6右侧的图表并未示出界面分数朝向界面rmsd轴的下端的强烈“漏斗状下降”。因此，图6表明sars-cov-1的rbd与icam3之间的结合特征远不如如图5所示的sars-cov-2的rbd与icam3之间的结合特征有利。
[0138]
图4至图6中的结果在使用rosetta软件预测每种结合模式的能量学的建模实验独立重复中得到证实。图7示出了这一系列重复实验的结果——绘制了分子界面处的均方根偏差(rmsd)与界面分数的关系，所述界面分数预测了结合能(负值越大表示放热越多，并因此结合相互作用越强)。如图4和图5那样，界面分数朝向界面rmsd轴下端的“漏斗状下降”表明sars-cov-2的rbd与ace2(图7a，对应于图4右侧)之间以及sars-cov-2的rbd与icam3(图7b，对应于图5右侧)之间的有利结合特征。类似地，如图6那样，未观察到界面分数朝向界面rmsd轴下端的强烈“漏斗状下降”，这表明sars-cov-1的rbd与icam3之间的结合特征远不如sars-cov-2的rbd与icam3之间的结合特征有利(图7c，对应于图6右侧)。与cov1-rbd-icam3的不利能量(-8.6)相比，cov2 rbd-icam3(界面rmsd-12.7)的rosetta能量与ace2(-12.2)一样有利。icam3与ace2一样对接在cov2 spike rbd口袋中(有利的静电和疏水相互作用)，这与对接在cov1 spike rbd外部的dc-或l-sign不同。
[0139]
初步微量热泳动实验确定了cov2 spike-icam3结合亲和力(kd)在5-10nm之间，而cov2 spike-ace2的结合亲和力为约10nm。
[0140]
实施例4——对sars-cov-2受体结合结构域、icam3和dc-sign结合相互作用的建模
[0141]
本发明人使用cluspro和rosetta软件对sars-cov-2受体结合结构域、icam3和dc-sign的结合相互作用进行建模，发现了当sars cov2 spike rbd与icam3结合时，则dc-sign
不能结合，反之亦然(图8)。这表明针对sars cov2 spike rbd产生的抗体具有交叉反应和结合dc-sign的潜力，从而对免疫系统产生非预期和不希望的影响。
[0142]
参考文献
[0143]
上面引用了许多出版物，以便更全面地描述和公开本发明以及本发明所属的现有技术水平。下面提供这些参考文献的完整引用。这些参考文献中的每个参考文献的全部内容以引用的方式并入本文。
[0144]
bhalla et al；nat commun 6，6049(2015)
[0145]
bhella；philos trans r soc lond b biol sci.(2015)feb 5；370；1661
[0146]
barat et al，joumalof virology may 2004，78(12)6692-6697
[0147]
chan et al，the journal of infectious diseases 2007；196：271-80
[0148]
chan et al，trends microbiol，21(2013)，pp.544-555
[0149]
choi et al，cytotherapy.(2017)oct；19(10)：1248-1250
[0150]
fauci a.s.，pratt k.r.&whalen g.(1976)j.immunol.118，598.
[0151]
feng et al，mol cancer.2020jun 2；19(1)：100
[0152]
gregory&pound，apoptosis.2010 sep；15(9)：1029-49；
[0153]
juan et al，1999，allergy 54，1293-1298
[0154]
han et al，2007，journal of virology，vol.81，no.21；nov.2007 pp 12029-12039
[0155]
henry j.et al，fetal and neonatal physiology(fifth edition)，2017
[0156]
horby et al，n engl j med.2021feb 25；384(8)：693-704
[0157]
hua etal，front.pharmacol.，04october 2013
[0158]
jefffers et al，proc natlacad sci u s a.2004nov 2；101(44)：15748-53
[0159]
marzi et al，j virol.2004nov；78(21)：12090-5
[0160]
mofffatt et al，j immunol.1999jun 1；162(11)：6800-10；
[0161]
panesar，med hypotheses.2008aug；71(2)：298-301
[0162]
patente et al；front lmmunol.2018；9：3176
[0163]
qi，f.et al，biochem.and biophys.res.comm.，https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2020.03044
[0164]
shen et al，cancer letters vol.422(2018)：29-43.doi：10.1016/jcanlet.2018.02034
[0165]
shiet al，2020doi：10.1101/2020.03.12.20034736
[0166]
siljan et al，2018.doi：101093/ofid/ofy002
[0167]
sommerfelt，m.a.，and b.asjo(1995)j.gen.virol.76：1345-1352
[0168]
song et al，2005，pnas：102，9，3366-3371
[0169]
staunton et al(1989)cell 56，849-853
[0170]
torr et al，celldeath differ.2012apr；19(4)：671-679；
[0171]
wang et al，lnt.j.of antimicrobial agents(2020)，antage 105948
[0172]
wang et al，cell mol immunol.2020apr 7：1-3
[0173]
wrapp et al，science，13mar 2020：367，lssue 6483，pp.1260-1263
[0174]
wu et al，cell host&microbe(2020)27，lssue 3，11march 2020，pages 325-328
[0175]
xu etal，2020feb 18doi：10.1016/s2213-2600(20)30076-x pmcld：pmc7164771pmid：
[0176]
32085846
[0177]
zhang et al，front immunol.2020；11：2033
[0178]
对于标准分子生物学技术，参见sambrook，j.，russel，d.w.molecular cloning，a laboratory manual.3 ed.2001，cold spring harbor，new york：cold spring harbor laboratory press。