专利名称：用于抗肿瘤疗法的白眉蝮艾丁比特cDNA的克隆和表达的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域；涉及到重组旅顺白眉蝮蛇蛇毒艾丁比特cDNA序列与相应的蛋白质序列及在毕赤酵母中的表达，及其抑制实体恶性肿瘤血管生成，进而抗肿瘤作用；特别涉及到旅顺白眉蝮蛇蛇毒艾丁比特的cDNA序列及其相应的蛋白质氨基酸序列。
背景技术：
抑制恶性实体肿瘤血管生成是抑制肿瘤生长和肿瘤转移的关键。肿瘤在1mm3以下时，其营养靠周围体液的渗透，超过此体积则有血管生成，否则肿瘤将退化。如果肿瘤的血管生成受到抑制，则肿瘤将不再生长，并可以进一步发生萎缩和凋亡，不能对机体造成危害。国内外虽有一些抑制恶性实体肿瘤血管生成的研究，但均不成熟。目前尚无这方面的基因重组药物进入市场。我们从旅顺白眉蝮蛇的毒腺中提取出总RNA，并经RT-PCR方法得到一种可以编码小分子量蛋白质的cDNA，将此cDNA序列构建入质粒pPIC9K，转化入酵母菌，诱导表达出一种重组蛋白质。因为此蛋白质含有模体RGD，可以与血管内皮细胞膜上的粘附因子整合蛋白αvβ3结合，抑制其活性。我们克隆出的蛋白质仅于目前韩国Yonsei大学生物产品研究中心生物化学系研究的Saxatilin相似，但有9个核苷酸的差异和6个氨基酸的差异。与我国台湾学者从Calloselasmarhodostoma提取纯化(不是基因重组)出的rhodostomin序列相比，有28个氨基酸的差异。美国学者也曾经从蛇毒中提取出一种小分子量的蛋白质，称为albolabrin，仅研究其对血小板聚集的抑制作用，而且不是用分子克隆的方法，是直接从蛇毒中提取的。我们将其命名为艾丁比特，adinbitor，意为adhesionintegrin inhibitor。重组艾丁比特是由219bp组成，编码含73个氨基酸残基的蛋白质。
发明内容
本发明的目的是给出旅顺白眉蝮蛇蛇毒一重组小分子蛋白质艾丁比特的cDNA序列和相应蛋白质的氨基酸残基顺序，在毕赤酵母中的表达技术及其抑制实体肿瘤组织内血管生成，进而达到抑制肿瘤生长的作用。
本发明的技术构思是用于抗肿瘤疗法的白眉蝮艾丁比特cDNA的克隆和表达，DNA序列为从白眉蝮蛇毒腺中克隆，含219个碱基对，此核苷酸序列为1GAGGCCGGAG AAGAATGTGA CTGTGGCTCT CCTGGAAATC CGTGCTGTGA TGCTGCAACC61 TGTAAACTGA GACAAGGAGC ACAGTGTGCA GAAGGACTGT GTTGTGACCA GTGCAGATTT121 ATGAAAAAAG GAACAGTATG CCGGATAGCA AGGGGTGATG ACATGGATGA TTACTGCAAT181 GGCATATCTG CTGGCTGTCC CAGAAATCCC TTCCATGCC蛋白质艾丁比特由73个氨基酸组成，其氨基酸顺序如下1EAGEECDCGS PGNPCCDAAT CKLRQGAQCA EGLCCDQCRF MKKGTVCRIA RGDDMDDYCN61 SAGCPRNP FHA此基因的克隆载体为pPET23b和pPIC9K，步骤是a.对旅顺活白眉蝮蛇进行斩头处死后，尽快分离出毒腺，并放入液氮中冻存。
b.采用提取试剂盒，先将样品从液氮中取出，并迅速打碎。按宝生物工程公司提供的方法提取总RNA。其要点是取0.1～1g组织，加入1～5ml TRIzol试剂，氯仿，振摇15～30sec后置于冰上5～10min。于4℃离心10000～30000×g10～30min，取上清。将上清移入另一离心管中，加入0.5～2ml异丙醇，并在冰上放置10～20min。然后于上述条件再离心。将沉淀中加入75％乙醇洗涤，混匀，再于4℃离心得RNA沉淀。风干后，加入适量TE溶液或无RNase的水中备用。
c.RT-PCR采用宝生物工程有限公司提供的TaKaRa RNA PCRKit(AMV)Ver.2.1进行反转录PCR。其基本要点是反应液中加入MgCl2、RNAPCR缓冲液、脱氧单核苷酸混合物、核糖核酸酶抑制剂、随机9聚物、样品RNA。反应总量20～100μl，反应后进行PCR反应。反应混合物中含有MgCl2、PCR缓冲液、Taq酶和引物。反应总体积20～100μl。反应产物进行1％琼脂糖电泳鉴定。在220bp附近有一条带为目的基因的条带。
d.构建入质粒pPET23b。利用上述双酶切将已鉴定的基因片段构建入质粒pPET23b的多克隆位点中。并在大肠杆菌DH5α中扩增。制备感受态细菌采用氯化钙法。构建后采用PCR和双酶切片段电泳进行鉴定。
e.目的基因向酵母表达质粒pPIC9K中的构建与筛选。利用含SnaBI和Eco52I双酶切位点的引物对含有目的基因的pPET23b进行PCR，利用电泳鉴定并利用Qiagen公司提供的试剂盒将PCR产物纯化。再利用此两酶对pPIC9K酶切，插入纯化过的目的基因。从而得到含目的基因的pPIC9K。
利用电穿孔技术将含有目的基因的pPIC9K质粒转化入毕赤酵母菌Pichiapastoris GS115。
在组氨酸缺乏的条件下，利用不同浓度的G418对重组子进行筛选。得到对G418有抗性的菌株。对此菌株进行培养到一定情况下，在甲醇诱导酵母菌表达并分泌重组的艾丁比特。
用于抗肿瘤疗法的白眉蝮艾丁比特cDNA的克隆和表达，此蛋白质在毕赤酵母菌GS115中表达，用DEAE-Sephadex A25和Sephadex G-50对艾丁比特进行纯化。
用于抗肿瘤疗法的白眉蝮艾丁比特cDNA的克隆和表达，此蛋白质在毕赤酵母菌GS115中表达，用His-Bind Column 70971-3进行亲和层析。
本发明的有益效果是，从旅顺白眉蝮蛇毒腺中分离提取出总RNA，利用RT-PCR的方法反转录出总cDNA。利用我们设计的引物，提供了一条特异的cDNA序列，其长度为219bp的多核苷酸序列。我们还提供一个在毕赤酵母菌中成功表达的一分子量约为7730的小分子量蛋白质。此蛋白质可作为抗实体恶性肿瘤的药物，进一步开发。
具体实施例方式
用于抗肿瘤疗法的白眉蝮艾丁比特cDNA的克隆和表达，DNA序列为从白眉蝮蛇所克隆，含219个碱基对，此核苷酸序列为1GAGGCCGGAG AAGAATGTGA CTGTGGCTCT CCTGGAAATC CGTGCTGTGA TGCTGCAACC61 TGTAAACTGA GACAAGGAGC ACAGTGTGCA GAAGGACTGT GTTGTGACCA GTGCAGATTT121 ATGAAAAAAG GAACAGTATG CCGGATAGCA AGGGGTGATG ACATGGATGA TTACTGCAAT181 GGCATATCTG CTGGCTGTCC CAGAAATCCC TTCCATGCC蛋白质艾丁比特由73个氨基酸组成，其氨基酸顺序如下1EAGEECDCGS PGNPCCDAAT CKLRQGAQCA EGLCCDQCRF MKKGTVCRIA RGDDMDDYCN61 SAGCPRNP FHA此基因的克隆载体为pPET23b和pPIC9K，步骤是a.对旅顺活白眉蝮蛇进行斩头处死后，尽快分离出毒腺，并放入液氮中冻存。
b.采用试剂盒提取总RNA。其要点是取0.2g组织，加入1ml TRIzol试剂，0.2ml氯仿，振摇15秒后置于冰上5min。于4℃离心12000×g，15min。将上清移入另一离心管中，加入0.5ml异丙醇，并有冰上放置10min。然后于上述条件离心10min。将沉淀中加入1ml75％乙醇洗涤，混匀，再于4℃离心10000×g，5min，得RNA沉淀。风干后，加入适量TE溶液或无RNase的水中备用。
c.RT-PCR采用宝生物工程有限公司提供的TaKaRa RNA PCRKit(AMV)Ver.2.1进行反转录PCR。其基本要点是反应液中加入
25mmol/L MgCl24μl10×RNA PCR buffer 2μlRNase Free dH2O8.5μldNTP Mixture2μlRNase Inhibitor 0.5μlReverse Transcriptase 1μlRandom 9mers1μlSample RNA 1μl(positive control RNA) (1μl)总体积20μl反应条件是30℃10min55℃30min99℃5min5℃ 5minPCR反应取上述反应液5μl，加入Eppendorf管中，加入下列反应液25mmol/L MgCl21.5μl10×RNA PCR buffer 2μl无菌蒸馏水 16μlTaKaRa Taq 0.125μlPrimerI 0.25μlPrimerII0.25μl总体积25μl反应条件94℃2min 反应产物进行1％琼脂糖电泳鉴定。在220bp附近有一条带为目的基因片段带。反应用引物为5′-ATGCATATGGAGGCCGGAGAAGAATG-3′5′-ATGAAGCTTGGCATGGAAGGGATTTC-3′
d.构建入质粒pPET23b。利用上述双酶切将已鉴定的基因片段构建入质粒pPET23b的多克隆位点中。并在大肠杆菌DH5α中扩增。制备感受态细菌采用氯化钙法。构建后采用PCR和双酶切片段电泳进行鉴定。
e.目的基因向酵母表达质粒pPIC9K中的构建与筛选。利用含SnaBI和Eco52I双酶切位点的引物对含有目的基因的pPET23b进行PCR，利用电泳鉴定并利用Qiagen公司提供的试剂盒将PCR产物纯化。再利用此两酶对pPIC9K酶切，插入纯化过的目的基因。从而得到含目的基因的pPIC9K。
引物F5’-GCTACGTAGAAGATCATCCTGT-3’R5’-TTCGGCCGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCGCAAGCTT-3’利用电穿孔技术将含有目的基因的pPIC9K质粒转化入毕赤酵母菌Pichiapastoris GS115。电穿孔的条件是2.5KV，800-1000Ω，25μF，时间为14-21毫秒。仪器为Bio-Rad E.coli Pulser，美国。
在组氨酸缺乏的条件下，利用不同浓度的G418对重组子进行筛选。得到对G418有抗性的菌株。对此菌株进行培养到一定情况下，在甲醇诱导酵母菌表达并分泌重组的艾丁比特。
用于抗肿瘤疗法的白眉蝮艾丁比特cDNA的克隆和表达，此蛋白质在毕赤酵母菌GS115中表达，用DEAE-Sephadex A25和Sephadex G-50对艾丁比特进行纯化。
用于抗肿瘤疗法的白眉蝮艾丁比特cDNA的克隆和表达，此蛋白质在毕赤酵母菌GS115中表达，用His-Bind Column 70971-3进行亲和层析。
碱性成纤维细胞生长因子的存在下乳腺癌细胞被诱导增殖，当向培养液中加入艾丁比特后，观察72小时，乳腺癌细胞的增殖被明显抑制。
用整体荷瘤小鼠实验表明，向小鼠背部注射2×105的黑色瘤细胞，4天后皮下注射艾丁比特，10mg/kg体重，静脉注射艾丁比特，1mg/kg体重，实验组肿瘤明显缩小95％。存活期明显延长。
艾丁比特对肿瘤血管生长显示出明显的抑制作用。表现为整体实验中，荷瘤小鼠的肿瘤生长受到明显地抑制作用。细胞培养发现，对血管内皮细胞的生长也具有明显的抑制作用。
权利要求
1.用于抗肿瘤疗法的白眉蝮艾丁比特cDNA的表达，其特征在于，DNA序列为从白眉蝮蛇毒腺所克隆，含219个碱基对，此核苷酸序列为1GAGGCCGGAG AAGAATGTGA CTGTGGCTCT CCTGGAAATC CGTGCTGTGA TGCTGCAACC61 TGTAAACTGA GACAAGGAGC ACAGTGTGCA GAAGGACTGT GTTGTGACCA GTGCAGATTT121 ATGAAAAAAG GAACAGTATG CCGGATAGCA AGGGGTGATG ACATGGATGA TTACTGCAAT181 GGCATATCTG CTGGCTGTCC CAGAAATCCC TTCCATGCC
2.根据权利要求1所述的用于抗肿瘤疗法的白眉蝮艾丁比特cDNA的表达，其特征在于，蛋白质艾丁比特由73个氨基酸组成，其氨基酸顺序如下1EAGEECDCGS PGNPCCDAAT CKLRQGAQCA EGLCCDQCRF MKKGTVCRIA RGDDMDDYCN61 ISAGCPRNPFHA
3.用于抗肿瘤疗法的白眉蝮艾丁比特cDNA的克隆，其特征在于，此基因的克隆载体为pPET23b和pPIC9K，步骤是a.对旅顺活白眉蝮蛇进行斩头处死后，尽快分离出毒腺，并放入液氮中冻存。b.用提取试剂盒，先将样品从液氮中取出，并迅速打碎，提取总RNA，步骤是取0.1～1g组织，加入1～5ml TRIzol试剂，氯仿，振摇15～30sec后置于冰上5～10min。于4℃离心10000～30000×g 10～30min，取上清。将上清移入另一离心管中，加入0.5～2ml异丙醇，并在冰上放置10～20min。然后于上述条件再离心。将沉淀中加入75％乙醇洗涤，混匀，再于4℃离心得RNA沉淀。风干后，加入适量TE溶液或无RNase的水中备用。c.RT-PCR采用宝生物工程有限公司提供的TaKaRa RNA PCRKit(AMV)Ver.2.1进行反转录PCR。其基本要点是反应液中加入MgCl2、RNAPCR缓冲液、脱氧单核苷酸混合物、核糖核酸酶抑制剂、随机9聚物、样品RNA。反应总量20～100μl，反应后进行PCR反应。反应混合物中含有MgCl2、PCR缓冲液、Taq酶和引物。反应总体积20～100μl。反应产物进行1％琼脂糖电泳鉴定。在220bp附近有一条带为目的基因的条带。d.构建入质粒pPET23b，用上述双酶切将已鉴定的基因片段构建入质粒pPET23b的多克隆位点中，并在大肠杆菌DH5α中扩增，制备感受态细菌采用氯化钙法，构建后采用PCR和双酶切片段电泳进行鉴定。e.目的基因向酵母表达质粒pPIC9K中的构建与筛选，用含SnaBI和Eco52I双酶切位点的引物对含有目的基因的pPET23b进行PCR，利用电泳鉴定并利用Qiagen公司提供的试剂盒将PCR产物纯化，再用此两酶对pPIC9K酶切，插入纯化过的目的基因，从而得到含目的基因的pPIC9K。用电穿孔技术将含有目的基因的pPIC9K质粒转化入毕赤酵母菌Pichiapastoris GS115。在组氨酸缺乏的条件下，利用不同浓度的G418对重组子进行筛选，得到对G418有抗性的菌株，对此菌株进行培养，在甲醇诱导酵母菌表达并分泌重组的艾丁比特。
4.根据权利要求3所述的用于抗肿瘤疗法的白眉蝮艾丁比特cDNA的克隆，其特征在于，此蛋白质在毕赤酵母菌GS115中表达，用DEAE-Sephadex A25和Sephadex G-50对艾丁比特进行纯化。
5.根据权利要求3所述的用于抗肿瘤疗法的白眉蝮艾丁比特cDNA的克隆，其特征在于，此蛋白质在毕赤酵母菌GS115中表达，用His-Bind Column 70971-3进行亲和层析。
全文摘要
用于抗肿瘤疗法的白眉蝮艾丁比特cDNA的克隆和表达属于生物技术领域，涉及到重组旅顺白眉蝮蛇蛇毒艾丁比特cDNA序列与相应的蛋白质序列及在毕赤酵母中的表达，及其抑制实体恶性肿瘤血管生成，进而抗肿瘤作用；特别涉及到旅顺白眉蝮蛇蛇毒艾丁比特的cDNA序列及其相应的蛋白质氨基酸序列；从旅顺白眉蝮蛇毒腺中分离提取出总RNA，利用RT－PCR的方法反转录出总cDNA，利用我们设计的引物，提供了一条特异的cDNA序列，其长度为219bp的多核苷酸序列，本发明还提供一个在毕赤酵母菌中成功表达的一分子量约为7730的小分子量蛋白质，此蛋白质可作为抗实体恶性肿瘤的药物，进一步开发。
文档编号C07K14/435GK1487081SQ0311158
公开日2004年4月7日 申请日期2003年4月28日 优先权日2003年4月28日
发明者赵宝昌 申请人:大连医科大学
技术领域：
本发明属于生物技术领域；涉及到重组旅顺白眉蝮蛇蛇毒艾丁比特cDNA序列与相应的蛋白质序列及在毕赤酵母中的表达，及其抑制实体恶性肿瘤血管生成，进而抗肿瘤作用；特别涉及到旅顺白眉蝮蛇蛇毒艾丁比特的cDNA序列及其相应的蛋白质氨基酸序列。
背景技术：
抑制恶性实体肿瘤血管生成是抑制肿瘤生长和肿瘤转移的关键。肿瘤在1mm3以下时，其营养靠周围体液的渗透，超过此体积则有血管生成，否则肿瘤将退化。如果肿瘤的血管生成受到抑制，则肿瘤将不再生长，并可以进一步发生萎缩和凋亡，不能对机体造成危害。国内外虽有一些抑制恶性实体肿瘤血管生成的研究，但均不成熟。目前尚无这方面的基因重组药物进入市场。我们从旅顺白眉蝮蛇的毒腺中提取出总RNA，并经RT-PCR方法得到一种可以编码小分子量蛋白质的cDNA，将此cDNA序列构建入质粒pPIC9K，转化入酵母菌，诱导表达出一种重组蛋白质。因为此蛋白质含有模体RGD，可以与血管内皮细胞膜上的粘附因子整合蛋白αvβ3结合，抑制其活性。我们克隆出的蛋白质仅于目前韩国Yonsei大学生物产品研究中心生物化学系研究的Saxatilin相似，但有9个核苷酸的差异和6个氨基酸的差异。与我国台湾学者从Calloselasmarhodostoma提取纯化(不是基因重组)出的rhodostomin序列相比，有28个氨基酸的差异。美国学者也曾经从蛇毒中提取出一种小分子量的蛋白质，称为albolabrin，仅研究其对血小板聚集的抑制作用，而且不是用分子克隆的方法，是直接从蛇毒中提取的。我们将其命名为艾丁比特，adinbitor，意为adhesionintegrin inhibitor。重组艾丁比特是由219bp组成，编码含73个氨基酸残基的蛋白质。
发明内容
本发明的目的是给出旅顺白眉蝮蛇蛇毒一重组小分子蛋白质艾丁比特的cDNA序列和相应蛋白质的氨基酸残基顺序，在毕赤酵母中的表达技术及其抑制实体肿瘤组织内血管生成，进而达到抑制肿瘤生长的作用。
本发明的技术构思是用于抗肿瘤疗法的白眉蝮艾丁比特cDNA的克隆和表达，DNA序列为从白眉蝮蛇毒腺中克隆，含219个碱基对，此核苷酸序列为1GAGGCCGGAG AAGAATGTGA CTGTGGCTCT CCTGGAAATC CGTGCTGTGA TGCTGCAACC61 TGTAAACTGA GACAAGGAGC ACAGTGTGCA GAAGGACTGT GTTGTGACCA GTGCAGATTT121 ATGAAAAAAG GAACAGTATG CCGGATAGCA AGGGGTGATG ACATGGATGA TTACTGCAAT181 GGCATATCTG CTGGCTGTCC CAGAAATCCC TTCCATGCC蛋白质艾丁比特由73个氨基酸组成，其氨基酸顺序如下1EAGEECDCGS PGNPCCDAAT CKLRQGAQCA EGLCCDQCRF MKKGTVCRIA RGDDMDDYCN61 SAGCPRNP FHA此基因的克隆载体为pPET23b和pPIC9K，步骤是a.对旅顺活白眉蝮蛇进行斩头处死后，尽快分离出毒腺，并放入液氮中冻存。
b.采用提取试剂盒，先将样品从液氮中取出，并迅速打碎。按宝生物工程公司提供的方法提取总RNA。其要点是取0.1～1g组织，加入1～5ml TRIzol试剂，氯仿，振摇15～30sec后置于冰上5～10min。于4℃离心10000～30000×g10～30min，取上清。将上清移入另一离心管中，加入0.5～2ml异丙醇，并在冰上放置10～20min。然后于上述条件再离心。将沉淀中加入75％乙醇洗涤，混匀，再于4℃离心得RNA沉淀。风干后，加入适量TE溶液或无RNase的水中备用。
c.RT-PCR采用宝生物工程有限公司提供的TaKaRa RNA PCRKit(AMV)Ver.2.1进行反转录PCR。其基本要点是反应液中加入MgCl2、RNAPCR缓冲液、脱氧单核苷酸混合物、核糖核酸酶抑制剂、随机9聚物、样品RNA。反应总量20～100μl，反应后进行PCR反应。反应混合物中含有MgCl2、PCR缓冲液、Taq酶和引物。反应总体积20～100μl。反应产物进行1％琼脂糖电泳鉴定。在220bp附近有一条带为目的基因的条带。
d.构建入质粒pPET23b。利用上述双酶切将已鉴定的基因片段构建入质粒pPET23b的多克隆位点中。并在大肠杆菌DH5α中扩增。制备感受态细菌采用氯化钙法。构建后采用PCR和双酶切片段电泳进行鉴定。
e.目的基因向酵母表达质粒pPIC9K中的构建与筛选。利用含SnaBI和Eco52I双酶切位点的引物对含有目的基因的pPET23b进行PCR，利用电泳鉴定并利用Qiagen公司提供的试剂盒将PCR产物纯化。再利用此两酶对pPIC9K酶切，插入纯化过的目的基因。从而得到含目的基因的pPIC9K。
利用电穿孔技术将含有目的基因的pPIC9K质粒转化入毕赤酵母菌Pichiapastoris GS115。
在组氨酸缺乏的条件下，利用不同浓度的G418对重组子进行筛选。得到对G418有抗性的菌株。对此菌株进行培养到一定情况下，在甲醇诱导酵母菌表达并分泌重组的艾丁比特。
用于抗肿瘤疗法的白眉蝮艾丁比特cDNA的克隆和表达，此蛋白质在毕赤酵母菌GS115中表达，用DEAE-Sephadex A25和Sephadex G-50对艾丁比特进行纯化。
用于抗肿瘤疗法的白眉蝮艾丁比特cDNA的克隆和表达，此蛋白质在毕赤酵母菌GS115中表达，用His-Bind Column 70971-3进行亲和层析。
本发明的有益效果是，从旅顺白眉蝮蛇毒腺中分离提取出总RNA，利用RT-PCR的方法反转录出总cDNA。利用我们设计的引物，提供了一条特异的cDNA序列，其长度为219bp的多核苷酸序列。我们还提供一个在毕赤酵母菌中成功表达的一分子量约为7730的小分子量蛋白质。此蛋白质可作为抗实体恶性肿瘤的药物，进一步开发。
具体实施例方式
用于抗肿瘤疗法的白眉蝮艾丁比特cDNA的克隆和表达，DNA序列为从白眉蝮蛇所克隆，含219个碱基对，此核苷酸序列为1GAGGCCGGAG AAGAATGTGA CTGTGGCTCT CCTGGAAATC CGTGCTGTGA TGCTGCAACC61 TGTAAACTGA GACAAGGAGC ACAGTGTGCA GAAGGACTGT GTTGTGACCA GTGCAGATTT121 ATGAAAAAAG GAACAGTATG CCGGATAGCA AGGGGTGATG ACATGGATGA TTACTGCAAT181 GGCATATCTG CTGGCTGTCC CAGAAATCCC TTCCATGCC蛋白质艾丁比特由73个氨基酸组成，其氨基酸顺序如下1EAGEECDCGS PGNPCCDAAT CKLRQGAQCA EGLCCDQCRF MKKGTVCRIA RGDDMDDYCN61 SAGCPRNP FHA此基因的克隆载体为pPET23b和pPIC9K，步骤是a.对旅顺活白眉蝮蛇进行斩头处死后，尽快分离出毒腺，并放入液氮中冻存。
b.采用试剂盒提取总RNA。其要点是取0.2g组织，加入1ml TRIzol试剂，0.2ml氯仿，振摇15秒后置于冰上5min。于4℃离心12000×g，15min。将上清移入另一离心管中，加入0.5ml异丙醇，并有冰上放置10min。然后于上述条件离心10min。将沉淀中加入1ml75％乙醇洗涤，混匀，再于4℃离心10000×g，5min，得RNA沉淀。风干后，加入适量TE溶液或无RNase的水中备用。
c.RT-PCR采用宝生物工程有限公司提供的TaKaRa RNA PCRKit(AMV)Ver.2.1进行反转录PCR。其基本要点是反应液中加入
25mmol/L MgCl24μl10×RNA PCR buffer 2μlRNase Free dH2O8.5μldNTP Mixture2μlRNase Inhibitor 0.5μlReverse Transcriptase 1μlRandom 9mers1μlSample RNA 1μl(positive control RNA) (1μl)总体积20μl反应条件是30℃10min55℃30min99℃5min5℃ 5minPCR反应取上述反应液5μl，加入Eppendorf管中，加入下列反应液25mmol/L MgCl21.5μl10×RNA PCR buffer 2μl无菌蒸馏水 16μlTaKaRa Taq 0.125μlPrimerI 0.25μlPrimerII0.25μl总体积25μl反应条件94℃2min 反应产物进行1％琼脂糖电泳鉴定。在220bp附近有一条带为目的基因片段带。反应用引物为5′-ATGCATATGGAGGCCGGAGAAGAATG-3′5′-ATGAAGCTTGGCATGGAAGGGATTTC-3′
d.构建入质粒pPET23b。利用上述双酶切将已鉴定的基因片段构建入质粒pPET23b的多克隆位点中。并在大肠杆菌DH5α中扩增。制备感受态细菌采用氯化钙法。构建后采用PCR和双酶切片段电泳进行鉴定。
e.目的基因向酵母表达质粒pPIC9K中的构建与筛选。利用含SnaBI和Eco52I双酶切位点的引物对含有目的基因的pPET23b进行PCR，利用电泳鉴定并利用Qiagen公司提供的试剂盒将PCR产物纯化。再利用此两酶对pPIC9K酶切，插入纯化过的目的基因。从而得到含目的基因的pPIC9K。
引物F5’-GCTACGTAGAAGATCATCCTGT-3’R5’-TTCGGCCGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCGCAAGCTT-3’利用电穿孔技术将含有目的基因的pPIC9K质粒转化入毕赤酵母菌Pichiapastoris GS115。电穿孔的条件是2.5KV，800-1000Ω，25μF，时间为14-21毫秒。仪器为Bio-Rad E.coli Pulser，美国。
在组氨酸缺乏的条件下，利用不同浓度的G418对重组子进行筛选。得到对G418有抗性的菌株。对此菌株进行培养到一定情况下，在甲醇诱导酵母菌表达并分泌重组的艾丁比特。
用于抗肿瘤疗法的白眉蝮艾丁比特cDNA的克隆和表达，此蛋白质在毕赤酵母菌GS115中表达，用DEAE-Sephadex A25和Sephadex G-50对艾丁比特进行纯化。
用于抗肿瘤疗法的白眉蝮艾丁比特cDNA的克隆和表达，此蛋白质在毕赤酵母菌GS115中表达，用His-Bind Column 70971-3进行亲和层析。
碱性成纤维细胞生长因子的存在下乳腺癌细胞被诱导增殖，当向培养液中加入艾丁比特后，观察72小时，乳腺癌细胞的增殖被明显抑制。
用整体荷瘤小鼠实验表明，向小鼠背部注射2×105的黑色瘤细胞，4天后皮下注射艾丁比特，10mg/kg体重，静脉注射艾丁比特，1mg/kg体重，实验组肿瘤明显缩小95％。存活期明显延长。
艾丁比特对肿瘤血管生长显示出明显的抑制作用。表现为整体实验中，荷瘤小鼠的肿瘤生长受到明显地抑制作用。细胞培养发现，对血管内皮细胞的生长也具有明显的抑制作用。
权利要求
1.用于抗肿瘤疗法的白眉蝮艾丁比特cDNA的表达，其特征在于，DNA序列为从白眉蝮蛇毒腺所克隆，含219个碱基对，此核苷酸序列为1GAGGCCGGAG AAGAATGTGA CTGTGGCTCT CCTGGAAATC CGTGCTGTGA TGCTGCAACC61 TGTAAACTGA GACAAGGAGC ACAGTGTGCA GAAGGACTGT GTTGTGACCA GTGCAGATTT121 ATGAAAAAAG GAACAGTATG CCGGATAGCA AGGGGTGATG ACATGGATGA TTACTGCAAT181 GGCATATCTG CTGGCTGTCC CAGAAATCCC TTCCATGCC
2.根据权利要求1所述的用于抗肿瘤疗法的白眉蝮艾丁比特cDNA的表达，其特征在于，蛋白质艾丁比特由73个氨基酸组成，其氨基酸顺序如下1EAGEECDCGS PGNPCCDAAT CKLRQGAQCA EGLCCDQCRF MKKGTVCRIA RGDDMDDYCN61 ISAGCPRNPFHA
3.用于抗肿瘤疗法的白眉蝮艾丁比特cDNA的克隆，其特征在于，此基因的克隆载体为pPET23b和pPIC9K，步骤是a.对旅顺活白眉蝮蛇进行斩头处死后，尽快分离出毒腺，并放入液氮中冻存。b.用提取试剂盒，先将样品从液氮中取出，并迅速打碎，提取总RNA，步骤是取0.1～1g组织，加入1～5ml TRIzol试剂，氯仿，振摇15～30sec后置于冰上5～10min。于4℃离心10000～30000×g 10～30min，取上清。将上清移入另一离心管中，加入0.5～2ml异丙醇，并在冰上放置10～20min。然后于上述条件再离心。将沉淀中加入75％乙醇洗涤，混匀，再于4℃离心得RNA沉淀。风干后，加入适量TE溶液或无RNase的水中备用。c.RT-PCR采用宝生物工程有限公司提供的TaKaRa RNA PCRKit(AMV)Ver.2.1进行反转录PCR。其基本要点是反应液中加入MgCl2、RNAPCR缓冲液、脱氧单核苷酸混合物、核糖核酸酶抑制剂、随机9聚物、样品RNA。反应总量20～100μl，反应后进行PCR反应。反应混合物中含有MgCl2、PCR缓冲液、Taq酶和引物。反应总体积20～100μl。反应产物进行1％琼脂糖电泳鉴定。在220bp附近有一条带为目的基因的条带。d.构建入质粒pPET23b，用上述双酶切将已鉴定的基因片段构建入质粒pPET23b的多克隆位点中，并在大肠杆菌DH5α中扩增，制备感受态细菌采用氯化钙法，构建后采用PCR和双酶切片段电泳进行鉴定。e.目的基因向酵母表达质粒pPIC9K中的构建与筛选，用含SnaBI和Eco52I双酶切位点的引物对含有目的基因的pPET23b进行PCR，利用电泳鉴定并利用Qiagen公司提供的试剂盒将PCR产物纯化，再用此两酶对pPIC9K酶切，插入纯化过的目的基因，从而得到含目的基因的pPIC9K。用电穿孔技术将含有目的基因的pPIC9K质粒转化入毕赤酵母菌Pichiapastoris GS115。在组氨酸缺乏的条件下，利用不同浓度的G418对重组子进行筛选，得到对G418有抗性的菌株，对此菌株进行培养，在甲醇诱导酵母菌表达并分泌重组的艾丁比特。
4.根据权利要求3所述的用于抗肿瘤疗法的白眉蝮艾丁比特cDNA的克隆，其特征在于，此蛋白质在毕赤酵母菌GS115中表达，用DEAE-Sephadex A25和Sephadex G-50对艾丁比特进行纯化。
5.根据权利要求3所述的用于抗肿瘤疗法的白眉蝮艾丁比特cDNA的克隆，其特征在于，此蛋白质在毕赤酵母菌GS115中表达，用His-Bind Column 70971-3进行亲和层析。
全文摘要
用于抗肿瘤疗法的白眉蝮艾丁比特cDNA的克隆和表达属于生物技术领域，涉及到重组旅顺白眉蝮蛇蛇毒艾丁比特cDNA序列与相应的蛋白质序列及在毕赤酵母中的表达，及其抑制实体恶性肿瘤血管生成，进而抗肿瘤作用；特别涉及到旅顺白眉蝮蛇蛇毒艾丁比特的cDNA序列及其相应的蛋白质氨基酸序列；从旅顺白眉蝮蛇毒腺中分离提取出总RNA，利用RT－PCR的方法反转录出总cDNA，利用我们设计的引物，提供了一条特异的cDNA序列，其长度为219bp的多核苷酸序列，本发明还提供一个在毕赤酵母菌中成功表达的一分子量约为7730的小分子量蛋白质，此蛋白质可作为抗实体恶性肿瘤的药物，进一步开发。
文档编号C07K14/435GK1487081SQ0311158
公开日2004年4月7日 申请日期2003年4月28日 优先权日2003年4月28日
发明者赵宝昌 申请人:大连医科大学
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