一种促进皮肤修复的多肽水凝胶及其制备方法和用途与流程

no.2所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或
15.(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)或(ⅱ)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
16.(ⅳ)、与(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或两个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
17.(v)、与(ⅰ)、(ⅱ)、(ⅲ)或(ⅳ)所述核苷酸序列具有至少90％序列一致性的核苷酸序列。
18.本发明还提供了表达载体，包括所述的核酸分子。
19.本发明还提供了宿主，转染或转化有所述的表达载体。
20.本发明还提供了表达所述多肽的方法，将所述的表达载体转染宿主细胞，培养，收集培养基上清，纯化。
21.本发明还提供了所述多肽，所述的核酸分子，所述的表达载体或所述的宿主，直接或间接在制备促进皮肤修复的药物或制剂中的应用。
22.在本发明的一些具体实施方案中，所述促进皮肤修复包括促进糖尿病小鼠损伤皮肤的愈合，促进皮肤附属物生成，提高pcna细胞阳性率，促进cd31阳性血管和胶原累积中的一种或多种。
23.本发明还提供了所述多肽，所述的核酸分子，所述的表达载体或所述的宿主，直接或间接在细胞3d培养中的应用。在本发明的一些具体实施方案中，人角质形成细胞系hacat细胞在所述的多肽水凝胶中成球状生长，细胞pdgf和vegf表达水平较二维培养细胞高。
24.本发明还提供了药物或细胞培养物，包括所述多肽，所述的核酸分子，所述的表达载体或所述的抗原以及可接受的辅料、助剂或载体。
25.在本发明的一些具体实施方案中，素数药物或细胞培养物的剂型包括水凝胶。
26.本发明还提供了一种制备前述的多肽水凝胶的方法，它包含如下步骤：
27.(1)将100
‑
300份自组装肽干粉溶于水中，配制成自组装肽水溶液；
28.(2)将100份步骤(1)得到的水溶液，加入10
‑
100份0.9％生理盐水，即得多肽水凝胶。
29.本发明提供了一种自组装肽，它的氨基酸序列为ac
‑
kldlkldlkldlggh
‑
conh2(如seq id no.1所示)。本发明提供了一种多肽水凝胶，它是由所述的自组装肽的水溶液所形成。本发明还提供了一种制备前述的多肽水凝胶的方法。本发明还提供了前述多肽水凝胶在治疗糖尿病小鼠皮肤损伤中的用途。其中，所述的多肽水凝胶能促进糖尿病小鼠损伤皮肤的愈合，皮肤附属物生成，提高pcna细胞阳性率，促进cd31阳性血管和胶原累积。本发明还提供了前述多肽水凝胶在体外进行细胞3d培养的用途；其中，人角质形成细胞系hacat细胞在所述的多肽水凝胶中成球状生长，细胞pdgf和vegf表达水平较二维培养细胞高。
附图说明
30.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
31.图1示kgh水凝胶理化性质及其成胶；其中，图1(a)示透射电镜下kgh溶液的纳米纤
维结构；图1(b)示扫描电镜下kgh水凝胶纳米结构；图1(c)示kgh水溶液在盐溶液中形成水凝胶；图1(d)示kgh溶液在小鼠皮肤创面形成水凝胶；图1(e)示kgh水溶液及成胶后的储能模量和损耗模量；
32.图2示kgh水凝胶皮肤创面涂抹后存留情况；其中图2(a)示荧光标记kgh水凝胶涂抹在皮肤创面后小鼠活体成像图；图2(b)示小鼠皮肤创面相对荧光强度统计结果；与游离染料cy7组相比*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001.
33.图3示kgh水凝胶促进糖尿病小鼠皮肤创面愈合；其中，图3(a)示kgh水凝胶治疗糖尿病小鼠皮肤损伤的实验设计；图3(b)示小鼠皮肤创面不同时间点照片；图3(c)示小鼠皮肤创面愈合率；图3(d)示小鼠皮肤创面he染色；与dm组相比，*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001.
34.图4示kgh水凝胶促进糖尿病小鼠皮肤创面细胞增殖和血管新生；其中图4(a)示小鼠皮肤创面vegf、pcna和cd31组化染色；图4(b)示免疫组化染色定量统计结果；与dm组相比，*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001.
35.图5示kgh水凝胶促进糖尿病小鼠皮肤创面胶原生成；其中图5(a)小鼠皮肤创面collage i，fn组化染色和masson染色；图5(b)示免疫组化染色定量统计结果；与dm组相比，*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001.
36.图6示hacat细胞在kgh水凝胶中成3d模式生长；其中，图6(a)示细胞培养模式图；图6(b)示二维培养及kgh水凝胶中培养的hacat细胞扫描电镜图；图6(c)示二维培养及kgh水凝胶中培养的hacat细胞光镜图(上)；鬼笔环肽染色示二维培养及kgh水凝胶中培养的hacat细胞骨架(中)；calcein/pi试剂盒染色显示二维培养及kgh水凝胶中培养的hacat细胞毒性(下)；
37.图7示kgh水凝胶促进hacat细胞分泌生长因子和细胞外基质；其中，图7(a)示细胞中ln和tgf
‑
β的mrna水平；图7(b)示细胞ln免疫荧光染色；图7(c)示细胞中pdgf和vegf的mrna水平；图7(d)示细胞vegf免疫荧光染色；与正常培养组(con)相比，*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001.
具体实施方式
38.本发明公开了促进皮肤修复的多肽水凝胶及其制备方法和用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本

技术实现要素：
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
39.本发明提供了一种自组装肽，它的氨基酸序列为ac
‑
kldlkldlkldlggh
‑
conh2；
40.本发明提供了一种多肽水凝胶，它是所述的自组装肽的水溶液所形成；
41.本发明还提供了一种制备前述的多肽水凝胶的方法，它包含如下步骤：
42.(3)将100
‑
300份自组装肽干粉溶于水中，配制成自组装肽水溶液；
43.(4)将100份步骤(1)得到的水溶液，加入10
‑
100份0.9％生理盐水，即得多肽水凝胶；
44.本发明还提供了前述多肽水凝胶在治疗糖尿病小鼠皮肤损伤中的用途。
45.其中，所述的多肽水凝胶能促进糖尿病小鼠损伤皮肤的愈合，皮肤附属物生成，提高pcna细胞阳性率，促进cd31阳性血管和胶原累积。
46.本发明还提供了前述多肽水凝胶在体外进行细胞3d培养的用途；
47.其中，人角质形成细胞系hacat细胞在所述的多肽水凝胶中成球状生长，细胞pdgf和vegf表达水平较二维培养细胞高。
48.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
49.本发明提供的促进皮肤修复的多肽水凝胶及其制备方法和用途中，所用原料及试剂均可由市场购得。
50.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
51.实施例1本发明kgh水凝胶的制备
52.根据本发明治疗所需，依据预实验结果(治疗效果)，实验动物(c57小鼠)及施用部位(小鼠皮肤创面)确定治疗体系如下：
[0053][0054]
1)自组装短肽kgh(序列：ac
‑
kldlkldlkldlggh
‑
conh
2，
如seq id no.1所示)由上海波泰生物科技合成纯化，干粉溶解于无菌水中，配制成10mg/ml的储液，取30μl加入到皮肤创面；
[0055]
2)缓慢滴加10μl生理盐水至创面上，即可形成水凝胶。
[0056]
实施例2本发明kgh水凝胶在皮肤创面的分布实验
[0057]
1)实验材料
[0058]
·
自组装短肽kgh(序列：ac
‑
kldlkldlkldlggh
‑
conh2)
[0059]
·
cy7荧光染料(solarbio)
[0060]
·
1.5ml ep管(thermo)
[0061]
·
10μl、200μl、1ml移液枪枪头(eppendorf)
[0062]
·
pbs溶液(0.1m，ph＝7.2)
[0063]
·
nahco3溶液(1m)
[0064]
·
c57小鼠(8周龄)
[0065]
·
戊巴比妥钠(merck)
[0066]
·
异氟烷(rwd life science)
[0067]
·
动物实验相关器械(1ml注射器，剃毛刀，脱毛膏，碘伏，8mm皮肤活检穿孔器，眼科剪，眼科镊，棉签，纱布，手术巾等)
[0068]
2)实验方法
[0069]
动物分组：cy7，cy7
‑
kgh二组
[0070]
·
根据cy7荧光染料说明书标记kgh水凝胶，并通过超滤去除游离荧光探针；
[0071]
·
c57小鼠，戊巴比妥钠腹腔注射，麻醉；
[0072]
·
用剃毛刀剃毛刀再使用脱毛膏进行充分脱毛；
[0073]
·
碘伏消毒备皮；
[0074]
·
用皮肤活检穿孔器在小鼠背部对称做两个直径为8mm全层皮肤缺损创面；
[0075]
·
按照分组，每组3只，分别用移液枪在创面滴加40ul cy7标记的kgh水凝胶及等量的cy7染料；
[0076]
·
创面用透明敷贴覆盖后于小鼠活体成像系统(in
‑
vivo xtreme)上进行第一次图像采集，并记录为0时实验结果。
[0077]
·
图像采集完后，将小鼠送回动物房正常饲养。再分别于术后24h，48h，72h，96h，168h异氟烷麻醉后进行活体成像。
[0078]
3)实验结果
[0079]
将cy7染料和cy7标记的水凝胶(cy7
‑
kgh)分别滴加于小鼠皮肤创面，并于各检测点进行活体荧光成像。结果表明，游离cy7在小鼠体内代谢较快，24h后已检测不到cy7。而cy7标记的水凝胶滴加于创面活体成像可见荧光一直集中于创面。(如图2所示)。
[0080]
实施例3本发明kgh水凝胶治疗糖尿病小鼠皮肤损伤的实验
[0081]
1)实验材料
[0082]
·
自组装短肽kgh(序列：ac
‑
kldlkldlkldlggh
‑
conh2)
[0083]
·
链脲佐菌素(stz,sigma)
[0084]
·
柠檬酸缓冲液(0.1m,ph＝4.5)
[0085]
·
1.5ml ep管(thermo)
[0086]
·
10μl、200μl、1ml移液枪枪头(eppendorf)
[0087]
·
pbs溶液(0.1m，ph＝7.2)
[0088]
·
c57小鼠(8周龄)
[0089]
·
戊巴比妥钠(merck)
[0090]
·
动物实验相关器械(1ml注射器，剃毛刀，脱毛膏，碘伏，8mm皮肤活检穿孔器，眼科剪，眼科镊，棉签，纱布，手术巾等)
[0091]
2)实验方法
[0092]
动物分组：dm( ns)，dm kgh二组
[0093]
·
小鼠注射stz前禁食12h，可自由饮水，每只小鼠以150mg/kg腹腔注射stz；
[0094]
·
注射后3d开始测小鼠随机血糖，连续3天血糖值高于16.7mm的小鼠归为糖尿病模型鼠，备用；
[0095]
·
stz建模后2周后，腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)，麻醉小鼠；
[0096]
·
用剃毛刀剃毛刀后再使用脱毛膏充分脱毛；
[0097]
·
碘伏消毒备皮；
[0098]
·
用皮肤活检穿孔器在小鼠背部对称做两个直径为8mm全层皮肤缺损创面；
[0099]
·
按照分组，每组12只，分别用移液枪在创面滴加40ul生理盐水或kgh水凝胶；
[0100]
·
在创面上覆盖10mm垫圈。拍照；
[0101]
·
拍照结束后创面用透明敷贴覆盖，待小鼠醒后，将其送回动物房正常饲养。
[0102]
·
分别于术后3d，7d，10d，14d进行创面照片采集，统计伤口面积，计算小鼠创面愈合率。14天取材组在第7天时进行第二次给药。
[0103]
·
在术后第7天和14天每组分别处死6只小鼠，取皮肤组织进行组织病理(he，masson)染色，组化染色。
[0104]
3)实验结果
[0105]
如图3b
‑
c所示，用kgh水凝胶进行干预的小鼠，创面愈合率显著高于生理盐水干预组。此外，kgh水凝胶干预显著促进了肉芽组织和皮肤附属物(如毛囊和皮脂腺)的形成(图3d)。组化染色结果显示，kgh水凝胶还促进了创面组织vegf的表达，pcna阳性细胞(增殖细胞)含量。cd31作为血管内皮的标记物，其染色结果显示kgh水凝胶干预组创面组织血管含量更丰富。此外，组化染色结果显示，kgh水凝胶促进了创面胶原形成(图4)
[0106]
实施例4本发明kgh水凝胶用于细胞三维培养的实验
[0107]
1)实验材料
[0108]
·
自组装短肽kgh(序列：ac
‑
kldlkldlkldlggh
‑
conh2)
[0109]
·
人角质形成细胞系hacat
[0110]
·
dmem培养基(gibico)
[0111]
·
胎牛血清(gibico)
[0112]
·
玻底皿(nest)
[0113]
·
细胞培养孔板(thermo)
[0114]
·
10μl、200μl、1ml移液枪枪头(eppendorf)
[0115]
·
calcein/pi细胞活性与细胞毒性检测试剂盒(碧云天)
[0116]
·
鬼笔环肽(sigma)
[0117]
·
dapi(sigma)
[0118]
2)实验方法
[0119]
实验分组：正常培养细胞(2d)，kgh水凝胶中培养细胞(3d)
[0120]
对于正常培养细胞，根据检测需求将细胞接种于6孔板(用于rna提取)，24孔板(用于扫描电镜)，玻底皿(用于光镜采图和荧光染色采图)。对于kgh水凝胶中培养的细胞，分别加入10mg/ml的kgh溶液1ml，1ml，200μl于六孔板、玻底皿、24孔板中，小心加入等体积无血清培养基诱导形成水凝胶。静止5min后去除培养基，将重悬的细胞加入到水凝胶上。置于细胞培养箱中进行培养。
[0121]
48h后，a.收集细胞提取rna，通过实时荧光定量pcr检测细胞中mrna水平；b.细胞固定、脱水、喷金后扫描电镜下成像；c.鬼笔环肽染色示细胞骨架、calcein/pi试剂盒染色示细胞毒性，confocal采图；d.免疫荧光染色示细胞ln，vegf表达水平。
[0122]
3)实验结果
[0123]
与传统2d培养下的单层细胞不同，人角质形成细胞(hacat)在kgh水凝胶中培养形成一些球状或簇状细胞(图6b
‑
c)。细胞球状体的数量和大小从24小时到72小时逐渐增加，但这些细胞球状体在一段时间后最终保持一定的大小(图6c)。扫描电镜结果显示，细胞球状体或团簇嵌入或附着在kgh纳米纤维网络上(图6b)。此外，细胞的伪足紧密附着在kgh支架上(图6b，蓝色箭头)。鬼笔环肽染色结果显示，kgh水凝胶中形成的细胞球状体由多个单细胞组成，球状体中的每个细胞也是球形的(图6c)。此外，在kgh水凝胶培养3天的细胞球形
体中，很少有pi

(凋亡)的hacat细胞，说明kgh水凝胶具有理想的生物相容性，对细胞没有显著的细胞毒性(图6c)。
[0124]
此外rt
‑
pcr检测及免疫荧光染色检测结果显示，在kgh水凝胶中生长的角质形成细胞其细胞外基质成分ln和tgf
‑
β表达水平较高，生长因子pdgf和vegf表达水平也较高(图7)。
[0125]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。