黄曲霉致病基因cdc48在筛选防治黄曲霉污染药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及遗传工程，具体涉及黄曲霉致病基因cdc48在筛选防治黄曲霉污染药物中的应用。


背景技术：

2.黄曲霉是一种丝状真菌，广泛存在于我们生活的环境中，其产生的分生孢子和菌核播散在土壤中。黄曲霉是一种重要的致病真菌，可以感染人和动物的肺部和其他器官，引起过敏症状以及侵袭性曲霉病，给人类健康带来严重的威胁。黄曲霉能够感染许多重要的农作物，例如，花生、玉米、棉花等，其均可对收获前后的农作物进行污染，给世界各地的农业生产造成巨大的经济损失。我国是黄曲霉污染的重灾区，我国多个省份储存的玉米和花生中都有检测到黄曲霉毒素的污染，此外，在水产饲料等加工产品中都检出黄曲霉毒素。因此黄曲霉的污染给人类造成重大经济损失和安全隐患，研究预防和控制黄曲霉的污染具有十分重要的意义。
3.黄曲霉的无性繁殖、毒素合成能力与其生长、扩散、和毒性有着密切的联系，影响黄曲霉的致病性。随着黄曲霉全基因组中基因功能注释的完成，科学家围绕着黄曲霉致病相关的遗传因素展开大量的研究。细胞分裂周期蛋白cdc48参与调节细胞内一系列重要的过程，如有丝分裂，纺锤体的组装等。在真菌中，cdc48敲除导致线粒体功能异常，导致真菌凋亡。黄曲霉中还未见关于cdc48基因的研究报道，及其对黄曲霉致病性和毒性的影响目前也未知。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种筛选抑制黄曲霉致病或防治黄曲霉污染的药物的方法。
5.作为本发明的第一个方面，提供了一种黄曲霉致病基因cdc48在筛选防治黄曲霉污染药物中的应用。
6.进一步的，所述应用具体包括：
7.s1：构建检测组黄曲霉菌培养体系和对照组黄曲霉菌培养体系，其中，检测组中添加待筛选药物；
8.s2：将检测组和对照组在相同条件下培养一段时间后，对比检测组和对照组中黄曲霉菌内的cdc48基因或cdc48蛋白的表达水平，若检测组中黄曲霉菌内的cdc48基因或cdc48蛋白的表达水平在一定程度上低于对照组，则待筛选药物为潜在抑制黄曲霉致病性药物。
9.进一步的，所述步骤s2中，通过荧光定量qpcr或northern blot杂交分析分析检测检测组和对照组中的黄曲霉菌内cdc48基因mrna表达水平。
10.进一步的，所述步骤s2中，通过western blot免疫印迹杂交分析或酶联免疫吸附法分析检测检测组和对照组中的黄曲霉菌内cdc48蛋白表达水平。
11.进一步的，用于分析检测cdc48蛋白表达水平的相应抗体是针对cdc48蛋白或蛋白片段的抗体或是在cdc48蛋白c端与小分子多肽标签进行融合表达后针对小分子多肽标签的抗体。
12.进一步的，所述小分子多肽标签为gfp标签、rfp标签、his标签、ha标签、flag标签或gst标签。
13.进一步的，还包括步骤s3：使用筛选出的所述潜在抑制黄曲霉致病性药物进行黄曲霉生长、产孢、产毒抑制测试或黄曲霉种子侵染抑制测试确认所述潜在抑制黄曲霉致病性药物是否为抑制黄曲霉致病性药物。
14.与现有技术相比，本发明的有益效果：
15.本发明的筛选方法，只需要在转录水平或者蛋白水平检测鉴定药物对黄曲霉的抑制效果，而不需要检测对黄曲霉毒素的含量，缩短了实验周期和时间，减少各种有机化学试剂的是用，减少对环境的污染，同时也大大减少可能对实验操作人员产生的毒害。
附图说明
16.图1是基因的敲除的原理图和敲除验证结果，(a)敲除原理图说明利用黄曲霉argb基因来替换黄曲霉菌cdc48基因；(b)通过pcr的方法来验证基因敲除株，p1和argb/r来扩增敲除片段ap，并用argb/f和p6来扩增敲除片段bp；
17.图2是黄曲霉菌中敲除cdc48基因对黄曲霉生长和分生孢子发育的影响，(a)野生型黄曲霉和敲除菌δcdc48在pda和ygt培养基中的表型；(b)野生型黄曲霉wt和敲除菌δcdc48在pda和ygt培养基中的菌落直径；(c)野生型黄曲霉wt和敲除菌δcdc48在pda和gmm培养基中的产孢量；
18.图3是黄曲霉菌中敲除cdc48基因对黄曲霉菌核发育的影响，(a)野生型黄曲霉和敲除菌δcdc48在gmms培养基中产菌核表型；(b)野生型黄曲霉wt和敲除菌δcdc48在gmms培养基中菌核产量计数；
19.图4是薄层层析tlc法检测cdc48基因对黄曲霉毒素合成的影响，(a)薄层层析tlc检测野生型黄曲霉wt和敲除菌δcdc48在yes产毒培养基中的产毒情况；(b)对野生型wt，敲除菌δcdc48在yes培养基的产毒情况进行定量；
20.图5是黄曲霉菌中敲除cdc48基因对黄曲霉侵染玉米种子的影响，(a)野生型黄曲霉wt，敲除菌δcdc48对玉米侵染7d后的情况；(b)野生型wt，敲除菌δcdc48侵染玉米7d后的产孢情况；(c)野生型wt，敲除菌δcdc48侵染玉米7d后的产毒情况；
21.图6是在广谱抗真菌药物紫苏醛(perillaldehyde，pae)作用下，黄曲霉野生型菌株中cdc48基因的表达情况，黄曲霉在培养体系内加入0.5μl/ml紫苏醛pae后，分别培养2小时、4小时和6小时，0小时表示未加入pae。
具体实施方式：
22.发明人通过大量的研究，首次在黄曲霉中鉴定到一种黄曲霉致病相关基因——cdc48。通过同源重组的方法将黄曲霉菌株中的cdc48基因敲除后，黄曲霉的生长和孢子合成受到了严重的影响，黄曲霉也无法产生黄曲霉毒素。通过检测黄曲霉菌内的cdc48基因的表达水平，就可以判断黄曲霉菌的致病性和毒性。通过检测黄曲霉菌中cdc48基因的表达水
平来筛选抑制黄曲霉致病或筛选防治黄曲霉污染的药物的方法。
23.以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，如sambrook等分子克隆实验手册，或按照产品说明书建议的条件。
24.实施例
25.1.黄曲霉菌中cdc48基因的敲除
26.搜索ncbi数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)，利用生物信息学方法在黄曲霉的基因组中鉴定到一个编号为afla_002370(gene id:238502409)的功能未知的新基因，该基因与酿酒酵母的cdc48(ydl126c)基因同源，因此将其命名为cdc48基因(seq id no.1)，cdc48蛋白具有seq id no.2所示的氨基酸序列。为了研究黄曲霉菌中cdc48基因在黄曲霉生长发育和毒性方面中的功能，在体外构建cdc48基因敲除的融合片段，通过同源重组的方法，把黄曲霉基因组中的2466bp dna同源片段用黄曲霉argb基因片段进行替换，从而敲除黄曲霉基因组中的cdc48基因。图1a所示为该基因敲除的原理。
27.具体方法如下：
28.利用上游引物ctccattctatgaagggagg(seq id no.3)和下游引物ttctaccgaactcatcaccaccgggagctcttgaagtagggtaggc(seq id no.5)，从野生型黄曲霉的基因组中用pcr扩增上游同源臂约1.2kb片段；
29.利用上游引物tggtgcccgcattcacatgtcacgggtgaacagggtttgtccatct(seq id no.6)和下游引物gtccacggaccaataacgg(seq id no.8)，从野生型黄曲霉的基因组中用pcr扩增下游同源臂约1.2kb片段；
30.利用上游引物tcccggtggtgatgagttc(seq id no.9)和下游引物cccgtgacatgtgaatgcg(seq id no.10)，从野生型黄曲霉的基因组中用pcr扩增约1.8kb的黄曲霉argb片段；
31.利用上游引物cttggacgaactatgtaatgg(seq id no.4)和下游引物gaataaatccagcagcgagc(seq id no.7)，通过重叠pcr将黄曲霉cdc48基因的上下游同源臂片段与黄曲霉argb基因片段连接构建敲除片段，利用同源重组方法将敲除片段同时导入到黄曲霉tjes20.1δku70δargb菌株的原生质体中(yang,k.et al.virulence,2018,aug 23,9(1):1273
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1286)，以argb为筛选标记，通过pcr筛选鉴定敲除的阳性转化子。如图1b所示，因为野生型黄曲霉wt中含有cdc48目的基因，而敲除菌株在cdc48的基因组位置被argb替换，所以利用cdc48基因上游同源臂引物p1(seq id no.3)和argb下游引物(seq id no.10)，以及argb上游引物(seq id no.10)和p6(seq id no.8)在野生型菌中无法扩增出ap、bp片段。反之，δcdc48敲除菌株因为含有argb片段，可以分别扩增出ap、bp片段。
32.2.cdc48基因敲除对黄曲霉生长的影响
33.通过同源重组的方法在黄曲霉菌中将cdc48基因缺失，并用pcr方法成功验证cdc48在黄曲霉基因组中被敲除。为了检测cdc48基因对黄曲霉生长的影响，本发明在pda固体培养基和ygt固体培养基上连续培养4天后，观察野生型黄曲霉和δcdc48突变体的形态，并测量直径。在pda固体培养基和ygt固体培养基上，cdc48的敲除导致黄曲霉生长受到了明显的抑制(图2a、2b)。
34.3.cdc48基因敲除对黄曲霉无性繁殖的影响
35.为研究cdc48对黄曲霉分生孢子形成的影响，将野生型黄曲霉wt和δcdc48突变体接种在pda和gmm固体培养基，在黑暗中培养4天后对孢子进行计数统计。结果发现，δcdc48突变体在固体培养基中的产孢量均明显下降(图2c)。
36.为了验证cdc48在黄曲霉中是否对黄曲霉菌核发育有影响，将黄曲霉接种在gmms菌核诱导培养基中，在黑暗中培养5天后进行观察发现，cdc48基因的敲除导致黄曲霉菌核发育受到了抑制，δcdc48突变体中产生较少的菌核(图3a、3b)。
37.4.cdc48基因敲除对黄曲霉毒素合成的影响
38.为了研究cdc48基因敲除对黄曲霉毒素形成是否有影响，将野生型菌株和突变体菌株分别接种到yes液体培养基，37℃黑暗培养5天。结果发现，δcdc48突变体中产生的黄曲霉毒素b1产量显著下降，数据统计分析也说明了这点(图4a、b)。
39.以上结果表明，cdc48基因的敲除会抑制黄曲霉毒素的合成。
40.5.cdc48基因敲除对黄曲霉致病力的影响
41.黄曲霉的生长、产孢和毒素合成与黄曲霉的致病力有着密切的联系，黄曲霉产孢或者产毒下降，将导致其致病力下降甚至丧失。为了研究cdc48基因在黄曲霉致病过程中的作用，将新鲜收集的野生型黄曲霉wt和δcdc48菌株分生孢子与已经消毒处理的玉米籽粒在29℃条件下共同培养7天。结果发现，与野生型相比，δcdc48敲除菌株在玉米籽粒中不能正常生长，分生孢子的形成受到了明显的抑制(图5a)。通过统计侵染后的产孢情况发现，δcdc48敲除菌株产生分生孢子严重受到了影响(图5b)。进一步检测侵染玉米中的黄曲霉毒素发现，δcdc48敲除菌株在侵染玉米的过程中产生的毒素明显下降。
42.以上结果表明，cdc48基因在黄曲霉的致病力以及侵染过程发挥着非常重要的作用。因此，cdc48是一个重要的致病相关因子。
43.6.根据cdc48基因表达水平筛选黄曲霉致病性或防治黄曲霉污染的潜在药物
44.为了验证黄曲霉菌内cdc48基因表达水平与黄曲霉致病性的联系，本发明设计建立了荧光定量pcr方法分析系统。具体方法如下：
45.在野生型黄曲霉菌的培养体系中，加入或不加入广谱抗真菌药物紫苏醛(perillaldehyde，pae)培养时间24小时，提取总rna并反转录成cdna，检测黄曲霉野生型菌株中cdc48基因的表达情况。利用上游引物ctacagacccgtgagacagg(seq id no.11)和下游引物gatctgtgccatctgtttcc(seq id no.12)，从上述cdna中用pcr的方法扩增约223bp片段来代表cdc48基因的表达水平。
46.利用上游引物acggtgtcgtcacaaactgg(seq id no.13)和下游引物cggttggacttagggttgatag(seq id no.14)，从上述cdna中用pcr的方法扩增约129bp片段来代表内参基因actin的表达水平。
47.统计分析显示，在加入紫苏醛条件下并胁迫4h后，野生型黄曲霉菌中的cdc48基因表达水平显著上调(p<0.001)，在胁迫6h后，cdc48基因表达水平开始受到抑制并下降。这一结果表明，cdc48基因的表达水平不仅与黄曲霉的致病性密切相关，而且可作为黄曲霉应激外源药物的耐药基因，紫苏醛pae是抑制黄曲霉致病性或防治黄曲霉污染的潜在药物。
48.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。