一种PCR冻干试剂及其制备方法与流程

一种pcr冻干试剂及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及一种pcr冻干试剂及其制备方法，所述pcr冻干试剂在普通环境中吸水量显著降低，在出仓后能直接在普通低湿环境进行分装、加盖等操作。


背景技术：

2.传统的分子诊断试剂盒是液态进行生产、包装、发货和使用的。由于试剂盒中含有dna聚合酶、逆转录酶等生物活性大分子，需要全流程控制产品在适宜的温度，通常为
‑
20摄氏度或以下。如此严苛的要求给运输和使用带来了极大的不便。夏季长途低温运输不仅需要高昂的运输成本，而且容易因运输条件不合规而导致产品失效或不合格。在使用中，因产品保存于
‑
20摄氏度或以下而结冰，需要在使用前进行化冻。反复的冻融不仅会降低产品稳定性，也使得检测时间变得更长。
3.真空冷冻干燥是利用升华的原理使物料脱水的一种干燥技术。冷冻干燥不仅使物料原有结构和形状得到最大程度保护，还可以保存生物活性物质的活性。对制备好的冷冻干燥制品而言，一方面是含水量极低(通常小于5％)，远低于普通环境相对湿度(50％)；另一方面，冻干后的制品干燥疏松多孔结构，极易吸收空气中的水分。冻干制品一旦吸收空气的水分，会引起冻干制品中生物活性物质活性的丧失。因此，通常情况下，对冻干完成的制品的操作需要在严格的控湿环境中进行。
4.传统的医药类生物冻干制品主要是在西林瓶中进行冷冻干燥的，冻干完成后，利用冻干机板层的升降来进行压盖，完成西林瓶的初步密封，随后出仓转移到低湿车间内进行二次密封。然而，对于分子诊断试剂盒而言，其冻干容器往往是pcr管、8连管、96孔板等，是非传统冻干用的标准容器，无法进行压塞，需要出仓后进行人工加盖封装。而如果是将反应试剂制备成冻干珠，则需要冻干出仓后的分装操作，将冻干珠分装到检测容器内进行加盖密封。因此，对这些无法在冻干机内进行压盖的产品，需要在出仓时、分装时、加盖时均在低温低湿的环境(通常湿度要求10％或更低)中进行。为了达到这样的要求，要么进行全车间湿度、温度控制，这样极端的温湿度控制会造成极大的能源消耗；要么定制隔离罩或手套箱等，通过向隔离罩或手套箱通高纯度惰性气体来降低湿度。但隔着厚厚的手套进行分装、加盖等操作，会极大的降低生产效率。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种pcr冻干试剂及其制备方法，所述pcr冻干试剂暴露在环境中吸水量显著降低，解决了出仓后在普通低湿环境中无法进行分装、加盖等操作的问题。
6.为了解决上述问题，本发明采用的技术如下：
7.本发明提供了一种pcr冻干试剂,所述pcr冻干试剂由pcr反应体系经过真空冷冻干燥所得，所述pcr试剂的组分包括：普鲁兰多糖0.01％～20％、dna聚合酶0.01u/ul～
0.4u/ul、反应缓冲液5mmol/l～500mmol/l、阳离子1.5mmol/l～80mmol/l、脱氧核糖核苷酸20umol/l～500umol/l、冻干保护剂2％～20％，其中％是质量百分比。
8.进一步地，所述dna聚合酶包括taq、phanta、pfu、kod、primerstar、klenow、bst和phi29中的至少一种。
9.进一步地，所述反应缓冲液包括tris
‑
hcl、hepes、mops、kcl和硫酸铵中的至少一种。
10.进一步地，所述阳离子包括单价阳离子和二价阳离子中的至少一种。
11.进一步地，所述单价阳离子包括k

和/或nh
4
，浓度优选为30～80mmol/l。
12.进一步地，所述二价阳离子包括mg
2
和/或mn
2
，浓度优选为1.5mmol/l～6mmol/l。
13.进一步地，所述冻干保护剂包括海藻糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、棉子糖、松三糖、羟丙基淀粉、葡聚糖、peg、pvp至少一种。
14.进一步地，所述pcr试剂的组分还包括逆转录酶0.01u/ul～8u/ul、标记物0.3μmol/l～1.0μmol/l、pcr添加剂0.05mg/ml～10mg/ml、上下游引物0.3μmol/l～1.0μmol/l的至少一种。
15.进一步地，所述标记物为荧光染料和/或荧光探针。
16.进一步地，所述pcr添加剂包括海藻糖、甜菜碱、bsa和明胶的至少一种。
17.进一步地，所述逆转录酶优选包括amv逆转录酶和/或m
‑
mlv逆转录酶。
18.一种pcr冻干试剂的制备方法，包括如下步骤：
19.a)预冷冻:取权利要求1
‑
9中任一项所述的pcr试剂，用连续分液器按照24
‑
26微升/滴滴入液氮中，将液氮预冷冻的小珠迅速转移到预冷的真空冷冻干燥机中；
20.b)初级干燥：分为三个阶段，第一阶段，真空冷冻干燥机设定预冷冻温度为
‑
45
±
2℃，持续时间160
‑
200min；第二阶段设定为0.5
±
0.1℃/分钟的升温，升至
‑
40
±
2℃，达到温度后自动进入第三阶段；第三阶段设定温度为
‑
40
±
2℃，持续时间为700
‑
750min；
21.c)次级干燥：分为两个阶段，第一阶段设定为0.5
±
0.1℃/分钟的升温，升至25
±
2℃，达到温度后自动进入第二阶段；第二阶段设定温度为25
±
2℃，持续220
‑
150min。
22.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
23.1.本发明所述的一种pcr冻干试剂，由pcr试剂经过真空冷冻干燥制得。在所述的pcr试剂中加入质量比为0.01％～20％普鲁兰多糖，经过真空冷冻干燥得到的pcr冻干试剂暴露在普通环境中，吸水量显著降低。不加普鲁兰多糖的pcr冻干试剂暴露在普通低湿环境中(相对湿度50％)，短时间内含水量以较高的速率呈线性增加；加入质量百分比为10％普鲁兰多糖的pcr冻干试剂在普通低湿环境中(相对湿度50％)，含水量在1小时内没有变化。
24.2.本发明所述的一种pcr冻干试剂，可以在普通低湿环境中进行出仓、分装、加工等操作而不影响生物制品的含水量和活性。因而，一方面不用为了保证极低温极低湿而进行全车间极端的温湿度严格控制，从而极大的降低了能源的消耗；另一方面也不用定制隔离罩或手套箱等，通过向隔离罩或手套箱通高纯度惰性气体来降低湿度，从而减少了资源浪费，操作更方便，极大的提高了生产效率。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所
需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
26.图1为不含普鲁兰多糖的冻干珠暴露于33％、50％和70％相对湿度环境中，随着时间变化含水量变化情况。
27.图2为0.01％普鲁兰多糖的冻干珠暴露于33％、50％和70％相对湿度环境中，随着时间变化含水量变化情况，其中％为质量百分比。
28.图3为10％普鲁兰多糖的冻干珠暴露于33％、50％和70％相对湿度环境中，随着时间变化含水量变化情况，其中％为质量百分比。
29.图4为0％、0.01％和10％浓度普鲁兰多糖的冻干珠暴露于50％相对湿度环境中，随着时间变化含水量变化趋势，其中％为质量百分比。
具体实施方式
30.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
31.实施例1
32.1.配制pcr试剂
33.荧光定量pcr试剂为珠海宝锐公司的robustart taq(dg)，neoscript rtase(dg)及10xbuffer，引物及探针由生工合成。
34.1)配制不含普鲁兰多糖的pcr试剂，具体如表1所示。
35.表1不含普鲁兰多糖的pcr试剂
[0036][0037][0038]
2)配制质量百分比为0.01％的普鲁兰多糖的pcr试剂，具体如表2所示。
[0039]
表2质量百分比为0.01％普鲁兰多糖的pcr试剂
[0040]
组分体积(μl)终浓度10x pcr buffer2.51
×
上游引物混合物(10μm)1.250.5μm下游引物混合物(10μm)1.250.5μm探针(10μm)1.250.5μm1％普鲁兰多糖溶液0.250.01％mgcl2(250mm)0.252.5mmdntp(10mm each)1200μmrobustart taq(dg)1 neoscript rtase(dg)1 2x冻干保护剂12.5 ddwater2.75 total25 [0041]
3)配制质量百分比为10％的普鲁兰多糖的pcr试剂，具体如表3所示。
[0042]
表3质量百分比为10％普鲁兰多糖的pcr试剂
[0043][0044]
注：普鲁兰多糖和冻干保护剂一起溶解配制成混合溶液
[0045]
2.冻干珠制备
[0046]
按照上述配方配制反应混合液，用连续分液器按照25微升/滴滴入液氮中，将液氮预冷冻的小珠迅速转移到预冷的真空冷冻干燥机中，按照表4条件进行真空冷冻干燥。
[0047]
表4冻干流程
[0048][0049]
冻干后，将冻干珠暴露在33％、50％和70％相对湿度的环境中，测定含水量。
[0050]
3.实验结果
[0051]
1)不含普鲁兰多糖的冻干小球在普通环境中的吸潮含水量测定
[0052]
将不含普鲁兰多糖的冻干小球暴露于不同湿度环境(33％，50％，70％)中0,1,2,4小时后测定含水量，结果如表5所示。
[0053]
表5不含普鲁兰多糖冻干珠暴露处理含水量测定
[0054][0055]
注：
‑
：含水量较高，卡尔费休水分测定仪无法稳定。
[0056]
将上表数据用柱状图展示，能更直观的看出不同环境湿度(33％，50％，70％)下，随着时间的变化，含水量的变化情况，结果见图1。
[0057]
2)加入质量百分比为0.01％普鲁兰多糖的冻干小球在普通环境中的吸潮含水量测定
[0058]
将质量百分比为0.01％普鲁兰多糖的冻干小球暴露于不同湿度环境(33％，50％，70％)中0,1,2,4小时后测定含水量，结果如表6所示。
[0059]
表6含质量百分比0.01％普鲁兰多糖的冻干珠暴露处理含水量测定
[0060][0061][0062]
将上表数据用柱状图展示，能更直观的看出不同环境湿度(33％，50％，70％)下，随着时间的变化，含水量的变化情况。结果见图2。
[0063]
3)加入质量百分比为10％普鲁兰多糖的冻干小球在普通环境中的吸潮含水量测定
[0064]
将质量百分比为10％普鲁兰多糖的冻干小球暴露于不同湿度环境(33％，50％，70％)中0,1,2,4小时后测定含水量，结果如表7所示。
[0065]
表7含质量百分比10％普鲁兰多糖的冻干珠暴露处理含水量测定
[0066][0067]
将上表数据用柱状图展示，能更直观的看出不同环境湿度下，随着时间的变化，含水量的变化情况。结果见图3。
[0068]
如上所述，比较三种不同浓度普鲁兰多糖的冻干珠暴露在环境湿度为50％的环境中的含水量变化，可以发现，加入普鲁兰多糖后，含水量显著降低；同时，随着普鲁兰多糖浓
度的升高，含水量有所降低。结果见图4。
[0069]
在正常生产流程中，1平方米的冻干机能冻干800支左右pcr管，出仓、分装、加盖等操作能在很短的时间内完成。由以上实验结果可知，在pcr冻干试剂中加入一定量的普鲁兰多糖，可以显著降低其暴露在环境中的吸水量，在短时间内含水量和出仓时无差异，进而，在普通低湿环境中进行出仓、分装、加盖等操作，对pcr冻干试剂的含水量没有显著影响，可以满足出厂标准。
[0070]
本领域技术人员在考虑说明书及实践公开的发明后，将容易想到本发明的其它实施方案。本技术旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由下面的权利要求指出。
[0071]
应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。