一种从牛蒡子提取共轭亚油酸的方法及其共轭亚油酸产品与流程

1.本发明涉及一种从牛蒡子提取共轭亚油酸的方法及其共轭亚油酸产品。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的一些理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.牛蒡子为菊科牛蒡属植物牛蒡的干燥成熟果实，牛蒡在江苏、山东、河北等省有大量栽培。牛蒡子中除了活性成分木脂素类物质外，还含有大量脂肪酸油，其中大部分为脂肪酸类成分，其中包括大量的亚油酸。
4.共轭亚油酸(conjugated linoleic acid，以下简称cla)是亚油酸的所有立体和位置异构体混合物的总称，可以看作是亚油酸的次生衍生物。共轭亚油酸是人和动物不可或缺的脂肪酸之一，却是自身无法合成一种具有显著药理作用和营养价值的物质，对人体健康大有益处。大量文献证明，共轭亚油酸具有抗肿瘤、抗氧化、抗突变、抗菌、降低人体胆固醇、抗动脉粥样硬化、提高免疫力、提高骨骼密度、防治糖尿病及促进生长等生理功能。近年来，又有一些临床研究报告证明，共轭亚油酸进入机体后能够增加体能消耗，因此在体重控制方面可以有效降低体内脂肪沉积。目前鲜有从牛蒡子中提取共轭亚油酸的报道。


技术实现要素：

5.针对以上背景技术，提供一种从牛蒡子提取共轭亚油酸的方法。
6.具体的，本发明采用以下技术方案：
7.在本发明的第一个方面，提供一种从牛蒡子提取共轭亚油酸的方法，该方法包括以下步骤：
8.(1)采用锅具将牛蒡子在100～150℃下炒制5～10min；
9.(2)将炒制后的牛蒡子进行粉碎，粉碎后进行超声波提取，提取介质为乙醚，超声波条件为：超声频率为20～40khz，功率为100～300w，温度30～50℃，超声时间为20～60min；超声波处理结束后，加入无水硫酸钠，过滤，滤液减压蒸馏回收乙醚，获得油状物质；
10.(3)将油状物质、吐温
‑
80、胆酸钠和水按照质量比例1:0.2～0.3:0.001～0.003:1～2混合，进行均质反应，形成乳化反应体系；
11.(4)向乳化反应体系加入磷酸盐缓冲液和米根霉脂肪酶，进行酶解反应，获得酶解液；
12.其中，酶解温度30～45℃，酶解时间为30～180min，ph为7.0～7.5，米根霉脂肪酶的用量为200～300u/ml
乳化反应体系
；
13.(5)将向步骤(4)中的酶解液加入保加利亚乳杆菌培养液进行共轭亚油酸转化，调节转化体系ph为4～6，转化温度为30～45℃，转化时间为20～24h，获得共轭亚油酸转化液；
14.(6)将尿素和乙醇混合，加入步骤(5)中的共轭亚油酸转化液，水浴回流30～
60min，反应结束后冷却至室温；然后在2～4℃下放置18～24h，析出结晶，过滤，采用乙醚洗涤结晶，获得的滤液去除乙醚，加入无水硫酸钠脱水，即可获得高纯度的共轭亚油酸。
15.优选的，步骤(1)中，所述锅具包括但不限于铁锅。
16.经过试验验证，将牛蒡子在100～150℃下炒制5～10min，能够最大程度的提高亚油酸、亚油酸乙酯和亚油酸甘油三酯含量。
17.优选的，步骤(2)中，超声波条件为：超声频率为35khz，功率为150w，温度35℃，超声时间为30min。
18.步骤(3)中，步骤(2)中的油状物质不溶于水，采用吐温
‑
80乳化油状物质形成水包油型，产生水
‑
油界面，利于米根霉脂肪酶的水解反应。
19.优选的，步骤(3)中，所述油状物质、吐温
‑
80、胆酸钠和水的质量比例为1:0.25:0.002:1.5。
20.优选的，步骤(3)中，采用均质机进行均质，均质条件为：均质压力为20～40mpa，均质温度为30～50℃，均质时间为5～15min。均质后可以形成一定粒径的乳状液，更有利于米根霉脂肪酶的水解。
21.优选的，步骤(4)中，所述磷酸盐缓冲液是由磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的溶液。
22.优选的，步骤(4)中，酶解反应温度为35℃，ph为7.4，酶用量为240u/ml
乳化反应体系
，酶解较佳时间根据不同的处理方式(静置或超声波或摇床酶解)而定。此优选条件下的米根霉脂肪酶水解率能达到95％以上。
23.优选的，步骤(5)中，保加利亚乳杆菌培养液是通过以下方法制备得到的：
24.将保加利亚乳杆菌接种至mrs斜面培养基上，35～40℃培养24～48h后，接种至脱脂乳培养基(质量分数为10～12％)中，35～40℃培养12～24h，获得种子液；
25.向脱脂乳培养基(质量分数为10～12％)中加入步骤(4)中的含有亚油酸的酶解液，接种种子液，35～40℃培养24～36h，获得保加利亚乳杆菌培养液。
26.优选的，步骤(5)中，为提高转化效率，采用摇床培养转化，摇床转速为50～100rpm。
27.优选的，步骤(5)中，酶解液与保加利亚乳杆菌培养液的体积比例为1：(1～3)。
28.优选的，步骤(6)中，所述尿素、乙醇和步骤(5)中的共轭亚油酸转化液添加量比为1g：(3～7)ml：(0.2～0.5)g。
29.在本发明的第二个方面，采用上述方法制备得到的牛蒡子共轭亚油酸产品。
30.与本发明人知晓的相关技术相比，本发明其中的一个技术方案具有如下有益效果：
31.本发明首先对牛蒡子进行炒制，试验证明，在转化cla之前进行炒制，可将牛蒡子中的一些脂肪油成分转化为亚油酸、亚油酸乙酯和亚油酸甘油三酯，提高了亚油酸的含量；然后对炒制后的牛蒡子进行超声波提取，亚油酸的提取率高；采用吐温
‑
80乳化剂制备均一乳化体系，乳化体系中加入胆酸钠能够进一步提高米根霉脂肪酶活性，从而将反应体系中的亚油酸酯最大程度的水解，同时还能提高保加利亚乳杆菌共轭亚油酸异构酶的活力，获得更高含量的亚油酸；采用保加利亚乳杆菌培养液将酶解液进行共轭亚油酸的高效转化；转化后采用尿素和乙醇进行分离纯化，获得高品质高纯度的共轭亚油酸。
具体实施方式
32.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
33.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
34.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
35.实施例1
36.一种从牛蒡子提取共轭亚油酸的方法，该方法包括以下步骤：
37.(1)采用铁锅将50g牛蒡子(采自江苏徐州牛蒡种植基地)在130℃下炒制8.5min；
38.(2)将炒制后的牛蒡子进行粉碎，粉碎粒径为120～80目，粉碎后放入超声波仪器中进行超声波提取，提取介质为乙醚，设置超声波条件为：超声频率为35khz，功率为150w，温度35℃，超声时间为30min；
39.超声波处理结束后，冷却至室温，加入无水硫酸钠，过滤，获得残渣和滤液，经测定残渣质量为39.385g；滤液经减压蒸馏回收乙醚，获得黄色油状物质，油状物质的收率为22.43％，经检测主要物质为：亚油酸含量43.32％左右，棕榈酸含量11.54％左右，油酸含量7.39％左右；
40.(3)将油状物质、吐温
‑
80、猪胆酸钠和水按照质量比例1:0.25:0.002:1.5混合，采用均质机进行均质，均质条件为：25mpa，均质温度为35℃，均质时间为10min，形成分散均一的乳化反应体系；
41.(4)向乳化反应体系加入磷酸盐缓冲液，调节ph7.5，然后加入米根霉脂肪酶(购自sigma)，放入恒温摇床中进行酶解反应，获得酶解液；
42.其中，酶解温度35℃，酶解时间为60min，摇床转速为100rpm，米根霉脂肪酶的用量为240u/ml
乳化反应体系
；
43.(5)将向步骤(4)中的酶解液加入保加利亚乳杆菌cicc20254培养液进行共轭亚油酸转化，两者的体积比例为1:2，调节转化体系ph为4.5，转化温度为37℃，转化时间为24h，获得共轭亚油酸转化液；经光谱扫描，发现酶解液在200nm处左右的吸光值降低，而233nm左右的吸光值升高，说明亚油酸成功转化为共轭亚油酸，转化液中的共轭亚油酸含量为1325.45μg/ml，转化率为43.68％；
44.其中，所述保加利亚乳杆菌cicc20254培养液是通过以下方法制备得到的：
45.将保加利亚乳杆菌cicc20254接种至mrs斜面培养基上，40℃培养48h后，接种至脱脂乳培养基中，40℃培养12h，获得种子液(10
×
109cfu/ml)；
46.向脱脂乳培养基中加入步骤(4)中的含有亚油酸的酶解液，酶解液的体积为脱脂乳培养基的1％，接种2％体积分数的种子液，40℃培养36h，获得保加利亚乳杆菌培养液；
47.(6)将尿素和乙醇混合，加入步骤(5)中的共轭亚油酸转化液，所述尿素、乙醇和步骤(5)中的共轭亚油酸转化液添加量比为1g：4ml：0.3g，水浴回流45min，反应结束后冷却至
室温；然后在4℃下放置24h，析出结晶，过滤，采用乙醚洗涤结晶，获得的滤液去除乙醚，加入无水硫酸钠脱水，即可获得2.03g高纯度的共轭亚油酸，产品澄清透明，纯度为96.28％，产品酸值为203.42koh/g。
48.实施例2
49.一种从牛蒡子提取共轭亚油酸的方法，该方法包括以下步骤：
50.(1)采用铁锅将50g牛蒡子(采自江苏徐州牛蒡种植基地)在135℃下炒制10min；
51.(2)将炒制后的牛蒡子进行粉碎，粉碎粒径为120～80目，粉碎后放入超声波仪器中进行超声波提取，提取介质为乙醚，设置超声波条件为：超声频率为30khz，功率为120w，温度40℃，超声时间为25min；
52.超声波处理结束后，冷却至室温，加入无水硫酸钠，过滤，获得残渣和滤液，经测定残渣质量为39.448g；滤液经减压蒸馏回收乙醚，获得黄色油状物质，油状物质的收率为21.10％，经检测主要物质为：亚油酸含量42.58％左右，棕榈酸含量10.65％左右，油酸含量7.12％左右；
53.(3)将油状物质、吐温
‑
80、猪胆酸钠和水按照质量比例1:0.2:0.001:1.5混合，采用均质机进行均质，均质条件为：20mpa，均质温度为40℃，均质时间为15min，形成分散均一的乳化反应体系；
54.(4)向乳化反应体系加入磷酸盐缓冲液，调节ph7.5，然后加入米根霉脂肪酶(购自sigma)，放入恒温摇床中进行酶解反应，获得酶解液；
55.其中，酶解温度40℃，酶解时间为50min，摇床转速为80rpm，米根霉脂肪酶的用量为250u/ml
乳化反应体系
；
56.(5)将向步骤(4)中的酶解液加入保加利亚乳杆菌cicc20254培养液进行共轭亚油酸转化，两者的体积比例为1:1.5，调节转化体系ph为4.5，转化温度为37℃，转化时间为24h，获得共轭亚油酸转化液；经光谱扫描，发现酶解液在200nm处左右的吸光值降低，而233nm左右的吸光值升高，说明亚油酸成功转化为共轭亚油酸，转化液中的共轭亚油酸含量为1286.29μg/ml，转化率为42.47％；
57.其中，所述保加利亚乳杆菌cicc20254培养液是通过以下方法制备得到的：
58.将保加利亚乳杆菌cicc20254接种至mrs斜面培养基上，40℃培养48h后，接种至脱脂乳培养基中，40℃培养12h，获得种子液(10
×
109cfu/ml)；
59.向脱脂乳培养基中加入步骤(4)中的含有亚油酸的酶解液，酶解液的体积为脱脂乳培养基的1％，接种2％体积分数的种子液，40℃培养36h，获得保加利亚乳杆菌培养液；
60.(6)将尿素和乙醇混合，加入步骤(5)中的共轭亚油酸转化液，所述尿素、乙醇和步骤(5)中的共轭亚油酸转化液添加量比为1g：5ml：0.4g，水浴回流60min，反应结束后冷却至室温；然后在4℃下放置24h，析出结晶，过滤，采用乙醚洗涤结晶，获得的滤液去除乙醚，加入无水硫酸钠脱水，即可获得1.94g高纯度的共轭亚油酸，产品澄清透明，纯度为95.36％，产品酸值为200.98koh/g。
61.实施例3
62.一种从牛蒡子提取共轭亚油酸的方法，该方法包括以下步骤：
63.(1)采用铁锅将50g牛蒡子(采自江苏徐州牛蒡种植基地)在140℃下炒制10min；
64.(2)将炒制后的牛蒡子进行粉碎，粉碎粒径为120～80目，粉碎后放入超声波仪器
中进行超声波提取，提取介质为乙醚，设置超声波条件为：超声频率为30khz，功率为150w，温度35℃，超声时间为25min；
65.超声波处理结束后，冷却至室温，加入无水硫酸钠，过滤，获得残渣和滤液，经测定残渣质量为39.792滤液经减压蒸馏回收乙醚，获得黄色油状物质，油状物质的收率为20.41％，经检测主要物质为：亚油酸含量41.32％左右，棕榈酸含量10.58％左右，油酸含量7.54％左右；
66.(3)将油状物质、吐温
‑
80、猪胆酸钠和水按照质量比例1:0.3:0.003:2混合，采用均质机进行均质，均质条件为：35mpa，均质温度为45℃，均质时间为8min，形成分散均一的乳化反应体系；
67.(4)向乳化反应体系加入磷酸盐缓冲液，调节ph7.5，然后加入米根霉脂肪酶(购自sigma)，放入恒温摇床中进行酶解反应，获得酶解液；
68.其中，酶解温度45℃，酶解时间为40min，摇床转速为90rpm，米根霉脂肪酶的用量为300u/ml
乳化反应体系
；
69.(5)将向步骤(4)中的酶解液加入保加利亚乳杆菌cicc20254培养液进行共轭亚油酸转化，两者的体积比例为1:2.5，调节转化体系ph为4.5，转化温度为37℃，转化时间为24h，获得共轭亚油酸转化液；经光谱扫描，发现酶解液在200nm处左右的吸光值降低，而233nm左右的吸光值升高，说明亚油酸成功转化为共轭亚油酸，转化液中的共轭亚油酸含量为1267.41μg/ml，转化率为41.64％；
70.其中，所述保加利亚乳杆菌cicc20254培养液是通过以下方法制备得到的：
71.将保加利亚乳杆菌cicc20254接种至mrs斜面培养基上，40℃培养48h后，接种至脱脂乳培养基中，40℃培养12h，获得种子液(1
×
109cfu/ml)；
72.向脱脂乳培养基中加入步骤(4)中的含有亚油酸的酶解液，酶解液的体积为脱脂乳培养基的1％，接种体积2％的种子液，40℃培养36h，获得保加利亚乳杆菌培养液；
73.(6)将尿素和乙醇混合，加入步骤(5)中的共轭亚油酸转化液，所述尿素、乙醇和步骤(5)中的共轭亚油酸转化液添加量比为1g：6ml：0.5g，水浴回流60min，反应结束后冷却至室温；然后在4℃下放置24h，析出结晶，过滤，采用乙醚洗涤结晶，获得的滤液去除乙醚，加入无水硫酸钠脱水，即可获得1.97g高纯度的共轭亚油酸，产品澄清透明，纯度为95.58％，产品酸值为202.39koh/g。
74.对比例1
75.与实施例1相同，不同的是：没有进行步骤(1)中的炒制步骤。
76.最终获得了1.43g共轭亚油酸产品。通过该对比例可知，炒制步骤对于提高共轭亚油酸收率具有重要的影响。
77.对比例2
78.与实施例1相同，不同的是：将步骤(4)中的米根霉脂肪酶替换为黑曲霉脂肪酶。
79.最终获得了1.54g共轭亚油酸产品，纯度为82.45％。通过该对比例可知，脂肪酶的选择对于提高共轭亚油酸收率和产品纯度具有重要的影响。
80.对比例3
81.与实施例1相同，不同的是：步骤(3)中不添加猪胆酸钠。
82.最终获得了1.52g共轭亚油酸产品，纯度为83.21％。通过该对比例可知，脂肪酶的
选择对于提高共轭亚油酸收率和产品纯度具有重要的影响。
83.对比例4
84.与实施例1相同，不同的是：将步骤(5)中的保加利亚乳杆菌cicc20254替换为植物乳杆菌cicc20038，转化液中的共轭亚油酸含量为843.29μg/ml，转化率仅为27.96％。
85.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。