一种毛囊干细胞的原代分离方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种毛囊干细胞的原代分离方法。


背景技术：

2.皮肤是身体上最大的器官，覆盖着身体表面，并与外界接触。它是由角化分层表皮和富含胶原蛋白的皮肤结缔组织组成的，其中包括来自表皮的毛囊、皮脂腺、汗腺和指甲等附属器官。皮肤及其附属物为动物的生存提供了至关重要的保护性屏障。毛囊是皮肤的重要附属器官，具有独特的结构和周期性生长的能力，在哺乳动物的整个生命周期具有再生的特征，而毛囊干细胞（hair follicle stem cell, hfsc）是维持毛囊组织自我更新的基础。
3.干细胞是一类具有自我更新能力和分化能力的原始细胞，在细胞的生长和分化过程中期主要作用。毛囊的周期性生长提示着毛囊结构中也存在着干细胞，即毛囊干细胞。它和其他成体干细胞一样，其超微结构及生化特征方面都具有未分化细胞的一些共有特征。hfsc最显著的特征是慢周期性和自我更新能力，下行迁移则分化可分化为毛囊和毛干的各种上皮类群细胞，向上迁移则分化成皮脂腺和表皮细胞。
4.现有研究表明，hfsc位于皮脂腺下部的外根鞘，立毛肌与毛囊根鞘相交汇的地方 ，通常称为隆突部。皮肤中的毛囊深入到真皮和真皮下，其自身处于不断自我更新的循环周期中，但是只有毛囊根鞘的隆突部是一个稳定存在的部位 ，被认为是干细胞存在的部位，是毛囊更新的细胞来源。
5.毛囊相对其他诸如胎盘、脐带等组织而言非常小，采用组织块贴壁法，难以辨识隆突部位；采用酶消化法又因具体的组织状况不同而难以统一酶的作用时间，因此毛囊干细胞的分离较困难。


技术实现要素：

6.为解决成功分离毛囊干细胞，并对传代的毛囊干细胞的增殖能力无影响的问题，本发明目的在于：一种毛囊干细胞的原代分离方法。
7.本发明目的通过如下方案实现：一种毛囊干细胞的原代分离方法，其特征在于包括以下步骤：步骤1、清洗头皮组织，达到灭菌和去除皮下脂肪，采用生理盐水或含双抗的pbs反复清洗从志愿者手术后得到头皮，去除多余的皮下脂肪组织；步骤2、解剖镜下用灭菌的镊子从脂肪端拉出毛囊，得到单个毛囊；步骤3、将单个毛囊加入到0.25%中性蛋白酶，37℃消化13
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30分钟，去除真皮鞘；步骤4、将去除真皮鞘的毛囊于0.25%胰蛋白酶中37℃消化10
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20分钟，待细胞完全解离后，用含10�s和双抗的dmem/f12完全培养基终止消化，然后用含双抗的pbs清洗两次；步骤5、将清洗完的毛囊放置在直径10cm的培养皿中，用灭菌的手术刀或者手术剪
切碎，分散在培养皿中，周围滴加50
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100ul dmem/f12完全培养基，润湿切碎的毛囊，使之贴壁，然后放入37℃、含5% co2的培养箱中，倒置培养2小时；步骤6、2小时后，沿着培养皿壁缓慢添加5
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10ml dmem/f12完全培养基，完全没过碎毛囊；步骤7、前三天完全不动，第四天开始每3天隔着培养箱的玻璃观察是否需要添加培养基。
8.进一步的，步骤1为：将得到的头皮采用75%的乙醇浸泡1
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3分钟，以灭杀可能存在的细菌、真菌，避免对之后的培养造成干扰；然后再采用生理盐水或含双抗的pbs反复清洗，去除多余的皮下脂肪。
9.步骤5分散碎毛囊时，间距相隔为1cm。
10.上述步骤5中的操作均在装满冰的灭菌冰盒上进行。
11.毛囊相对其他诸如胎盘、脐带等组织而言非常小，采用组织块贴壁法时，由于干细胞存在的隆突部位过小而较难辨识和分离；采用酶消化法又因具体的组织状况不同而难以统一酶的作用时间，可能导致消化程度不足，细胞难以爬出或者过渡消化损伤细胞等问题，因此毛囊干细胞的分离较困难。有鉴于此，本发明的目的在于一种毛囊干细胞的原代分离方法，综合了组织块法和酶消化法各自的优势，目的是成功分离毛囊干细胞，提高分离的效率，并对传代的毛囊干细胞的增殖能力无影响。
附图说明
12.图1，实施例3毛囊处理后放置在培养皿中的示意图；图2，实施例3中毛囊干细胞在培养皿中爬出并生长的示意图。
具体实施方式
13.本发明实施例公开了一种毛囊干细胞的原代分离方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的分离方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述分离方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
14.本发明具体实施方式中所用头皮组织均经过当事人授权同意，并以自愿捐助的方式采集获得，采集方式通过所在医院按照正常医疗手段进行。
15.为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种毛囊干细胞的原代分离方法进行详细说明。
16.实施例1一种毛囊干细胞的原代分离方法，按以下步骤：步骤1、将采集的头皮组织先用75%乙醇浸泡1
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3分钟灭菌后，用含双抗的pbs清洗，去除多余的皮下脂肪组织；步骤2、直接用灭菌的手术刀或手术剪切碎，分散在培养皿中；步骤3、周围滴加50
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100ul dmem/f12完全培养基，润湿切碎的毛囊，使之贴壁，然后放入37℃、含5% co2的培养箱中，倒置培养2小时；之后，
步骤4、沿着培养皿壁缓慢添加5
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10ml dmem/f12完全培养基，完全没过碎毛囊，送入培养箱中培养；步骤5、前三天完全不动，第四天开始每3天隔着培养箱的玻璃观察是否需要添加培养基。
17.在培养14天后，记录是否有细胞爬出的迹象；在培养21天后，记录是否有细胞爬出的迹象。
18.实施例2一种毛囊干细胞的原代分离方法，按以下步骤：步骤1、将采集的头皮组织先用75%乙醇浸泡1
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3分钟灭菌后，用含双抗的pbs清洗后，去除多余的皮下脂肪组织；步骤2、解剖镜下用灭菌的镊子取出单个毛囊；步骤3、将单个毛囊于0.25%胰蛋白酶中37℃消化10
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20分钟，待细胞完全解离后，用含10�s和双抗的dmem/f12完全培养基终止消化，然后用含双抗的pbs清洗两次；步骤4、将清洗完的毛囊放置在直径10cm的培养皿中，用灭菌的手术刀或者手术剪切碎，分散在培养皿中，周围滴加50
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100ul dmem/f12完全培养基，润湿切碎的毛囊，使之贴壁，然后放入37℃、含5% co2的培养箱中，倒置培养2小时；之后，步骤5、沿着培养皿壁缓慢添加5
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10ml dmem/f12完全培养基，完全没过碎毛囊，送入培养箱中培养。
19.在培养14天后，记录是否有细胞爬出出的迹象；在培养21天后，记录是否有细胞爬出出的迹象。实施例3一种毛囊干细胞的原代分离方法，按以下步骤：步骤1、将采集的头皮组织先用75%乙醇浸泡1
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3分钟灭菌后，用含双抗的pbs清洗，去除多余的皮下脂肪组织；步骤2、解剖镜下用灭菌的镊子取出单个毛囊；步骤3、将单个毛囊加入到0.25%中性蛋白酶，37℃消化13
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30分钟，去除真皮鞘；步骤4、将去除真皮鞘的毛囊于0.25%胰蛋白酶中37℃消化10
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20分钟，待细胞完全解离后，用含10�s和双抗的dmem/f12完全培养基终止消化，然后用含双抗的pbs清洗两次；步骤5、将清洗完的毛囊放置在直径10cm的培养皿中，用灭菌的手术刀或者手术剪切碎，分散在培养皿中，周围滴加50
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100ul dmem/f12完全培养基，润湿切碎的毛囊，使之贴壁，然后放入37℃、含5% co2的培养箱中，倒置培养2小时；之后，步骤6、沿着培养皿壁缓慢添加5
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10ml dmem/f12完全培养基，完全没过碎毛囊，送入培养箱中培养。
20.前三天完全不动，第四天开始每3天隔着培养箱的玻璃观察是否需要添加培养基。
21.在培养14天后，记录是否有细胞爬出的迹象；在培养21天后，记录是否有细胞爬出的迹象。
22.结果显示，在培养14天后，实施例1和2均没有细胞爬出，实施例3有细胞爬出的迹象；
结果显示，在培养21天后，实施例1和2均没有细胞爬出，实施例3开始有细胞爬出。结果如附图1毛囊处理后放置在培养皿中的示意图和图2毛囊干细胞在培养皿中爬出并生长的示意图所示。
23.以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。