一种肾功能损害风险降低的方法及应用与流程

1.本发明涉及一种检测碱性磷酸酶(alp)活力和中性粒细胞计数的方法及其新用途，用于预测待测对象是否接受降血压药物与叶酸的联合治疗以降低肾功能损害风险，属于医学领域。


背景技术：

2.原发性高血压是一种受遗传背景与环境因素共同影响的多基因遗传性疾病，是心脑血管疾病发病与死亡的危险因素。肾脏是高血压病理损害的主要靶器官之一，因此高血压的常见并发症即包括慢性肾脏疾病(chronic kidney disease,ckd)。流行病学资料显示，因高血压造成患者进入肾功能损害的人数呈逐年增多的趋势。由ckd逐渐演变的终末期肾病(end-stagerenaldisease,esrd)可能成为导致高血压患者死亡率升高的主要因素之一。研究提示，肾小球滤过率、尿微量白蛋白、胰岛素抵抗等指标恶化与高血压患者肾功能损害呈独立相关，也是高血压患者因并发症致死的主要危险因素。
3.高血压造成肾脏损害的临床表现主要为蛋白尿和肾小球功能受损，早期大部分患者表现为肾小球滤过率下降、微量白蛋白尿，后期往往有肾小管功能受损，肾脏病理改变常表现为肾小动脉或肾实质损害，以良性小动脉性肾硬化为主，其发生与高血压的严重程度和持续时间呈正相关。一般来说，未经治疗的高血压持续5-10年，即可引起肾脏小动脉硬化，管壁增厚，管腔变窄，进而激发肾实质缺血性损害。研究显示，收缩压由120mmhg上升至130mmhg时，发生esrd风险明显增高。
4.依那普利是一种常用降血压药物，属于血管紧张素转换酶抑制药，口服后在肝脏内水解成依那普利拉而发挥作用。后者对血管紧张素转换酶的抑制作用为卡托普利的8倍以上。依那普利还能在降低血压的同时能保持心肌收缩力，不影响心输出量，故减轻心脏前、后负荷，改善心脏功能。依那普利是临床上治疗高血压的代表性药物之一，它还能增加肾血流量，对血糖、尿酸和胆固醇代谢无明显影响。
5.依那普利叶酸片(简称：依叶)为1.5类复方新药，由依那普利和叶酸两种活性成份组成，其中叶酸用来降低血浆同型半胱氨酸浓度或补充体内叶酸的不足。本发明人参与实施的一项临床研究(huo y,li j,qin x,et al.efficacy of folic acid therapy in primary prevention of stroke among adults with hypertension in china:the csppt randomized clinical trial.jama 2015；313:1325-35.)显示，在中国超过2万名高血压受试者中，每天服用10.8mg依叶(含10mg依那普利和0.8mg叶酸)，平均疗程4.5年，结果发现，与单纯服用10mg依那普利相比，依叶能够进一步降低脑卒中风险21％。在该研究中还发现，使用依叶有助于高血压患者的靶器官保护，包括肾功能改善。
6.鉴于上述研究成果，降血压药物与叶酸长期联合治疗高血压，能进一步发挥靶器官保护作用的优势，也适用于已并发肾功能损害的患者，预期可使高血压患者肾功能损害发生、进展的风险降低。但是这一临床价值发现来自于上述严格设计的临床试验研究，实际疗效在“真实世界”的高血压患者人群中存在个体差异。如果能够通过某种方法把握这种差
异，亦即预测高血压个体接受降血压药物与叶酸联合治疗的肾脏获益大小，从而确定该个体是否适合该联合用药，或者确定临床获益最大的患者人群特征(某些参数)，对于个体化医学实践具有重要意义。
7.碱性磷酸酯酶(alp)属磷酸单酯水解酶，是一组特异的磷酸酯酶，广泛分布于人体组织和体液，以骨、肝、乳腺、小肠中含量较高，大部分由骨细胞产生，小部分来自肝，经胆汁排入肠道，临床检测血清alp主要用于肝、胆及骨组织疾病的辅助诊断；中性粒细胞是循环血液中白细胞分类的一种，临床上中性粒细胞计数主要用于细菌感染性疾病、炎症、粒细胞白血病或粒细胞缺乏症等的诊断或辅助诊断。本发明人在研究分析中意外发现血alp活力水平与中性粒细胞计数可以预测降血压药物与叶酸联合治疗对高血压患者肾脏靶器官的保护作用大小，因此可以用来指导高血压患者的个体化用药，是对现有技术方案的一种显著改进。


技术实现要素：

8.本发明所要解决的技术问题是克服临床上降血压药物与叶酸联合治疗存在的现有理论和技术的不足，为预测高血压患者应用这种联合治疗的肾靶器官保护作用疗效提供新的方法。
9.本发明通过对“中国脑卒中一级预防试验(csppt)”的肾脏亚组研究事后分析，发现基线alp水平和中性粒细胞计数的某个切点值与降血压药物与叶酸联合干预后高血压患者蛋白尿、肾功能损害发生或进展密切相关。这意味着可将alp水平、中性粒细胞计数作为预测高血压患者接受降压药物与叶酸联合治疗后对肾功能损害预防或改善效果的实验室检测新用途，即通过检测高血压患者alp水平及中性粒细胞计数，判断患者是否可以接受这种联合治疗，给出合理的用药建议，指导个体化治疗，达到提高临床疗效、改善患者生活质量的目的。
10.一方面，本发明提供了alp及中性粒细胞作为评估待测个体应用降压药物与叶酸联合治疗对肾功能损害预防或改善作用效果的方法；另一方面，本发明还提供了检测alp水平、中性粒细胞计数的试剂在制备用于预测联合治疗临床效果的检测剂或检测系统中的应用。
11.根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述待测个体为原发性高血压患者。
12.根据本发明的具体实施方案，本发明中，来自待测个体的样本中alp水平或中性粒细胞计数升高，则该待测个体使用降压药物与叶酸联合治疗的肾保护疗效较好。
13.根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述alp的水平是alp的血清、血浆水平。
14.根据本发明的具体实施方案，本发明中，检测alp的水平的方法可以是本领域中已知的任何可行的方法，例如，酶联免疫法、pnp微板法、pnp比色法、磷酸苯二钠微板法、磷酸苯二钠比色法。
15.根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述中性粒细胞计数是指循环血液中中性粒细胞的计数。
16.根据本发明的具体实施方案，本发明中，检测中性粒细胞计数的方法可以是本领域中已知的任何可行的方法。
17.根据本发明的具体实施方案，本发明中，当血浆或血清alp≥110iu/l或中性粒细
胞计数≥4.6
×
109/l时，则建议待测个体接受降压药物与叶酸联合治疗，预计对高血压患者的肾功能损害预防或改善效果较好。
18.另一方面，本发明还提供了一种用于指导待测个体是否接受降压药物与叶酸联合治疗的检测系统(检测装置)，该检测系统包括：
19.检测单元，该检测单元包括检测alp水平和中性粒细胞计数的试剂；
20.分析单元，该分析单元用于对检测单元的检测结果进行分析，评估待测个体是否接受上述联合治疗。
21.根据本发明的具体实施方案，本发明用于评估待测个体是否接受降压药物与叶酸联合治疗的检测系统，是根据来自待测个体的样品中alp水平、中性粒细胞计数的高低，来评估该待测个体接受降压药物与叶酸联合治疗降低肾功能损害风险的效果。其中，来自待测个体的样品中alp水平升高和中性粒细胞计数增高，该待测个体适合接受这种联合治疗。
22.在本发明的具体实施方案中，本发明用于评估待测个体是否接受降压药物与叶酸联合治疗的检测系统中，所述分析单元进行分析评估时按照以下操作(评估原则)进行：
23.当血清或血浆alp水平≥110iu/l、中性粒细胞计数≥4.6
×
109/l时，则建议待测个体接受降压药物与叶酸联合治疗，该药对于高血压患者肾功能损害预防或改善效果较好。
24.本发明所述的用于评估待测个体是否接受降压药物与叶酸联合治疗的检测系统，可以是虚拟装置，只要能实现所述检测单元以及分析单元的功能即可。所述的检测单元可以是包括各种检测试剂、试剂盒或检测仪器；所述的数据分析单元可以是任何可以实现对检测单元的检测结果进行分析处理而得出降压药物与叶酸联合治疗作用效果的运算仪器、模块或是虚拟设备，例如可以是预先按照上述评估原则将alp水平、中性粒细胞计数及其对应个体是否接受降压药物与叶酸联合治疗制定成便于对照查阅的数据图表，将检测单元的检测结果对照该数据图表即能得出待测个体是否接受这种联合治疗的合理预测。
25.另一方面，本发明还提供了一种针对待测个体是否接受降压药物与叶酸联合治疗的预测方法，该方法包括：检测个体(可以是来自待测个体的样品)的alp水平检测和中性粒细胞计数；根据个体alp水平和中性粒细胞计数高低，来评估该个体是否接受这种联合治疗。
26.综上所述，本发明将检测血液alp水平、中性粒细胞计数作为预测高血压患者是否接受降压药物与叶酸联合治疗以降低肾功能损害发生风险的新方法和用途，并为临床实践中高血压患者的个体化医疗提供依据。
具体实施方式
27.实施例1降压药物与叶酸联合治疗高血压患者血浆alp水平与肾功能损害关系的分析研究
28.(一)方法：
29.a.中国脑卒中一级预防研究(csppt)及其肾脏亚组研究：
30.csppt是一项随机双盲对照试验，于2008-2013年在中国安徽和江苏省的32个社区实施，共纳入20702名男、女性高血压患者，年龄45～75岁，高血压定义为坐位收缩压≥140mmhg和/或舒张压≥90mmhg。患者以1：1的比例随机分配至2个治疗组之一：每日口服1片
含10mg依那普利和0.8mg叶酸的复方片剂(依叶组)，或每日口服1片仅含10mg依那普利的单药片剂(依那普利组)；对患者每3个月进行一次随访；试验期间允许同时使用其他抗高血压药物(主要是钙通道阻滞剂或利尿剂)，但不允许使用b族维生素。平均4.5年治疗后结果表明，依叶组比依那普利组减少首次脑卒中发病风险21％。
31.csppt肾脏亚组研究纳入了csppt队列中的15104名患者，纳入标准是egfr(估算肾小球滤过率)≥30ml/min/1.73m2，其中1671例伴有肾功能损害。结果发现，在总人群中，依叶组与依那普利组相比，肾功能损害进展几率没有显著差异，但在基线egfr<60ml/min/1.73m2或蛋白尿的患者中，添加叶酸治疗显著降低肾功能损害进展几率高达55％。
32.b.csppt肾脏研究的事后分析
33.对上述csppt肾脏亚组研究进行事后分析，纳入标准为有基线alp检测结果的病例，共纳入12734名患者资料进行分析,中位疗程为4.4年。这些患者来自江苏省的20个农村社区(叶酸水平较低的地区)。
34.实验室检测：(1)在基线和退出访问时收集患者血清和尿样，送至广州国家肾脏疾病临床研究中心实验室，使用全自动生化分析仪(beckman coulter)测量血清肌酸、同型半胱氨酸(hcy)、血脂和空腹血糖。使用肾功能损害流行病学协作(肾功能损害-epi)方程计算egfr。(2)alp检测：1)血样静置4h后，常温、6000转离心5分钟，取上清。2)试剂盒组成包括酶标板、塑料膜盖板、标准品、对照品、标准品稀释缓冲液、生物素标记的抗txa2抗体、亲和链霉素-hrp、洗涤缓冲液、底物a、底物b、终止液、标本稀释液。3)检测方法：固相夹心法酶联免疫吸附法(elisa)，已知浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将待测物质和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的hrp。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物a、b，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中待测物质的浓度呈比例关系。
35.结局指标：(1)主要结局指标：肾功能损害进展，定义为egfr下降≥30％，或基线egfr≥60ml/min/1.73m2，出组时降至<60ml/min/1.73m2；或如果基线egfr<60ml/min/1.73m2，则在出组时egfr下降≥50％；或肾功能衰竭(egfr<15ml/min/1.73m2)；或需要透析。(2)次要结局指标：1)肾功能损害发生，定义为基线egfr≥60ml/min/1.73m2，出组时egfr<60ml/min/1.73m2，且egfr每年下降率>1ml/min/1.73m2；2)egfr快速下降，定义为egfr每年平均下降≥5ml/min/1.73m2；3)egfr年下降速率，估算为其中t是从基线检测到出组的年份时间。
36.数据分析：治疗组根据基线alp二分位数(分割值为110iu/l)计算群体特征的平均值
±
标准差和比例。用t检验或x2检验比较总体特征的差异，用logistic或线性回归模型来评估基线alp二分位数对降压之外添加叶酸治疗与主要或次要肾脏结局之间的关联的影响，混杂因素包含年龄、性别、体重指数、吸烟、饮酒、白蛋白校正的钙、磷酸盐、尿酸、egfr、收缩压、空腹血糖水平、总胆固醇水平、蛋白尿、治疗期间钙通道阻滞剂(ccb)和利尿剂的使用情况等；alp和叶酸的交互作用通过将交互作用项纳入多变量矫正模型进行检验。p<0.05被认为具有统计学意义，所有统计分析使用r软件(版本3.4.3)。
37.(二)结果：
38.首先，在基线alp水平较高(≥110iu/l)的患者者中，与依那普利相比，依叶治疗在
预防肾功能损害进展(or，0.54；95％ci，0.35-0.85)及降低肾功能损害发生率(or，0.62；95％ci，0.42-0.91)方面均有显著效果，说明alp水平与依叶治疗存在明显交互作用(见表1)。
39.表1基线血清alp水平(<110或≥110iu/l)对两组患者肾功能损害发生或进展的影响
[0040][0041]
*
根据基线时的年龄、性别、体重指数、吸烟、饮酒、白蛋白校正的钙、磷酸盐、尿酸、总胆固醇、egfr、收缩压、蛋白尿、糖尿病、治疗期间ccb和利尿剂的使用情况进行调整。
[0042]
这项分析只包括基线egfr≥60ml/min/1.73m2的参与者。
[0043]
其次，在基线alp水平较高(≥110iu/l)的患者中，与依那普利相比，依叶治疗在预防egfr快速下降方面虽然没有显著差别(or，0.63；95％ci，0.36-1.11)，但在预防egfr下降速率(％)方面，依叶治疗比依那普利作用更加明显(or，-0.30；95％ci，-0.55～-0.06)(见表2)。
[0044]
表2基线血清alp水平对两组患者egfr的影响
[0045][0046]
*
根据基线时的年龄、性别、体重指数、吸烟、饮酒、白蛋白校正的钙、磷酸盐、尿酸、总胆固醇、egfr、收缩压、蛋白尿、糖尿病、治疗期间ccb和利尿剂的使用情况进行调整。
[0047]
糖尿病也是肾功能损害的重要危险因素。因此，我们对是否存在糖尿病这一情况进行了分层分析，结果表明：当患者不伴有糖尿病，且基线alp水平较高(≥110iu/l)时，单用依那普利与依叶治疗对肾功能损害的作用有显著差异(or，0.49；95％ci，0.28-0.83)；当患者存在糖尿病，且基线alp水平较高(≥110iu/l)时，单用依那普利与依叶治疗对肾功能损害的作用无显著差异(or，0.66；95％ci，0.29-1.50)(见表3)。
[0048]
表3基线alp水平对患者(不伴发糖尿病)肾功能损害发生或进展的影响
[0049][0050]
*根据基线的年龄、性别、体重指数、吸烟、饮酒、白蛋白校正的钙、磷酸盐、尿酸、总胆固醇、egfr、收缩压(sbp)、时间平均sbp、蛋白尿、糖尿病、治疗期间钙通道阻滞剂(ccb)和利尿剂使用情况进行调整
[0051]
在大多数没有强制性食品中添加叶酸的国家中(包括中国)，叶酸摄入量不足是普遍存在的现象。研究证实，人体内血液低叶酸水平或高hcy水平均是心血管疾病危险因子，补充叶酸不仅可以弥补体内叶酸缺乏，也能显著降低血hcy水平，此外叶酸具有抗氧化、改善内皮功能、增强氧化应激等作用，故可减轻或预防肾脏损伤，降低肾功能损害风险。
[0052]
实施例2长期服用依叶的高血压患者中性粒细胞计数与肾功能损害关系的分析研究
[0053]
(一)方法：
[0054]
a.中国脑卒中一级预防研究(csppt)及其肾脏亚组研究：
[0055]
(同实施例1，略)
[0056]
b.csppt肾脏研究的事后分析
[0057]
对上述csppt肾脏亚组研究进行事后分析，纳入标准为基线有中性粒细胞计数测定结果的病例，共纳入9448名(依叶组4678例，依那普利组4770例)患者资料进行分析,中位疗程为4.4年，这些患者来自江苏省的20个农村社区(叶酸水平较低的地区)。
[0058]
实验室检测：(1)在基线和退出访问时收集患者血清和尿样，送至广州国家肾脏疾病临床研究中心实验室，使用全自动生化分析仪(beckman coulter)测量血清肌酸、hcy、血脂、血糖等。使用肾功能损害流行病学协作(肾功能损害-epi)方程计算egfr。(2)中性粒细胞计数检测：取得血液样本，可通过指尖取血或肘部静脉抽血。轻轻摇动血液，使之与抗凝剂混匀。血液检查的标本量与抗凝剂比例要合适。然后使用自动化血液分析仪做血常规检验(血液学分析)，试剂盒组成包括稀释液(sandem氯化钠6.38g/l、硼酸1.0g/l、四硼酸钠0.2g/l、edta-2k0.2g/l)、hb溶血素(sulfolyser(sl s-200a)、月桂洗硫酸钠1.7g/l)、清洗液(sandem cellclean、staccleaner-sys、次氯酸盐5％)、抗凝剂(kedta.2h0(1.5-2.2mg每毫升血液))。
[0059]
结局指标：(1)主要指标：肾功能损害进展，定义为egfr下降≥30％，或基线egfr≥60ml/min/1.73m2，出组时降至<60ml/min/1.73m2；或如果基线egfr<60ml/min/1.73m2，则在出组时egfr下降≥50％；或肾功能衰竭(egfr<15ml/min/1.73m2)；或需要透析。(2)次要指标：1)egfr快速下降，定义为egfr每年平均下降≥5ml/min/1.73m2；2)egfr年下降速率，估
算为其中t是从基线检测到出组的年份时间。
[0060]
数据分析：治疗组根据基线中性粒细胞计数二分位数(分割值为4.6
×
109/l)计算群体特征的平均值
±
标准差和比例。用t检验或x2检验比较总体特征的差异，用logistic或线性回归模型来评估基线中性粒细胞计数二分位数对降压之外添加叶酸治疗与主要或次要肾脏结局之间的关联的影响，混杂因素包含年龄、性别、体重指数、吸烟、饮酒、尿酸、白蛋白、egfr、蛋白尿、收缩压、空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、叶酸、维生素b
12
、hcy、收缩压、平均收缩压等；中性粒细胞计数和叶酸的交互作用通过将交互作用项纳入多变量矫正模型进行检验。p<0.05被认为具有统计学意义，所有统计分析使用r软件(版本3.4.3)。
[0061]
(二)结果：
[0062]
首先，在中性粒细胞计数较高(≥4.6
×
109/l)的患者中，与单用依那普利相比，依叶治疗与在预防肾功能损害进展(or，0.44；95％ci，0.26-0.77)方面有显著效果(见表4)。
[0063]
表4基线中性粒细胞计数对两组患者肾功能损害进展的影响
[0064][0065]
*
调整：年龄、性别、体重指数、吸烟、空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、白蛋白、egfr、蛋白尿、尿酸、叶酸、维生素b
12
、hcy、收缩压、平均收缩压。
[0066]
其次，在中性粒细胞计数较高(≥4.6
×
109/l)的患者中，与单用依那普利相比，依叶治疗与在预防及延缓egfr迅速下降(or，0.65；95％ci，0.47-0.91)方面有显著效果(见表5)。
[0067]
表5基线中性粒细胞计数对两组患者egfr的影响
[0068][0069]
*
调整：年龄、性别、体重指数、吸烟、空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、白蛋白、egfr、蛋白尿、尿酸、叶酸、维生素b
12
、hcy、收缩压、平均收缩压。
[0070]
实施例3长期服用依叶的高血压患者中性粒细胞计数与新发蛋白尿关系的分析研究
[0071]
(一)方法：
[0072]
a.中国脑卒中一级预防研究(csppt)及其肾脏亚组研究：
[0073]
(同实施例1，略)
[0074]
b.csppt肾脏研究的事后分析
[0075]
对上述csppt肾脏亚组研究进行事后分析，纳入标准为有基线中性粒细胞计数、入组和出组有尿蛋白测定结果的病例，共纳入8208名(依叶组4101例，依那普利组4107例)患者资料进行分析,中位疗程为4.4年，这些患者来自江苏省的20个农村社区(叶酸水平较低的地区)。
[0076]
实验室检测：(1)在基线和退出访问(出组)时收集患者血样和尿样，送至广州国家肾脏疾病临床研究中心实验室，使用全自动生化分析仪测量血清肌酸、hcy、血脂、血糖等，使用肾功能损害流行病学协作(肾功能损害-epi)方程计算egfr，使用蛋白试纸法测定蛋白尿。(2)中性粒细胞计数检测：同实施例2。
[0077]
结局指标：新发蛋白尿，即试纸法尿蛋白由基线时阴性转为出组时阳性(试纸显示至少1个 )
[0078]
数据分析：治疗组根据基线中性粒细胞计数二分位数(分割值4.8
×
109/l)计算群体特征的平均值
±
标准差和比例。用t检验或x2检验比较总体特征的差异，用logistic或线性回归模型来评估基线中性粒细胞计数二分位数对降压之外添加叶酸治疗与结局指标之间的关联的影响，混杂因素包含年龄、性别、体重指数(bmi)、吸烟、饮酒、尿酸、收缩压(sbp)、舒张压(dbp)、空腹血糖、总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)、egfr、叶酸、hcy等。p<0.05被认为具有统计学意义，所有统计分析使用r软件(版本3.4.3)。
[0079]
(二)结果：
[0080]
按照基线中性粒细胞计数二分位数分层的受试者人群特征见下表6。由表可见，基线状态时依那普利组和依叶组间的人群特征基本一致，具有可比性；经治疗后，与依那普利组比较，依叶组血液叶酸水平显著上升，hcy水平显著下降，提示补充叶酸效果明显。
[0081]
表6按中性粒细胞切点值(<4.8
×
109/l)分层的受试者人群特征
[0082][0083]
蛋白尿从无到有，常常提示早期的肾功能受损，从表7统计分析可见，在中性粒细胞计数较高(≥4.8
×
109/l)的患者中，与单用依那普利组相比，依叶组(补充叶酸)新发蛋白尿事件更少见(or，0.53；95％ci，0.32-0.88，p＝0.044)，调整其它干扰因素后，这一效应更显著(or，0.48；95％ci，0.29-0.82，p＝0.033)。本结果表明，基线中性粒细胞计数较高的高血压患者接受降压药加叶酸的联合治疗可预防肾功能受损，相比单用降压药有更多的临床获益。
[0084]
表7基线中性粒细胞计数与两组患者新发蛋白尿的关系
[0085][0086]
注：*调整因素包括：组、年龄、性别、体重指数、吸烟、空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯、egfr、尿酸、叶酸、hcy、收缩压(sbp)、治疗期间平均sbp等。