包含硅纳米颗粒的递送系统的制作方法

1.本发明涉及用于递送生物活性剂的递送系统。更具体地，但非排他地，本发明涉及硅纳米颗粒用于递送短干扰rna、信使rna或其它核酸的用途。本发明还涉及相关组合物。


背景技术：

2.由于其特异性，基因疗法作为遗传疾病的治疗途径引起相当大的兴趣。短干扰rna(也称为小干扰rna或sirna)可以设计为几乎针对任何基因且具有治疗疾病的巨大潜力。很明显，sirna技术在医学上具有巨大的治疗潜力。然而，它们在体内和体外应用的主要限制之一是sirna分子不能穿过细胞膜并到达细胞质。sirna主链中磷酸基团产生的负电荷静电排斥带负电荷的细胞膜，且因此排斥sirna跨细胞膜扩散的能力。由于降解裸sirna分子的有效细胞和全身防御机制，所以sirna跨细胞膜的递送也受到其短体外半衰期的限制。sirna疗法在医学中的成功应用的其他障碍也存在，诸如sirna的高分子量、靶组织的差特异性和吸收、细胞毒性和不良的脱靶效应。
3.mrna也表现出作为治疗剂的前景。与dna相比，mrna有几个优势，包括不需要任何核定位，而且潜在破坏基因组整合的风险要低得多。虽然sirna在治疗由基因过度表达或不适当表达引起的疾病方面显示很大潜力，但mrna有用于治疗基因低表达引起的疾病的潜力。它还具有用于疫苗的潜力，包括抗肿瘤疫苗。基于mrna的疗法面临与任何治疗性核酸类似的挑战，即递送安全性、特异性和效率的挑战。
4.rna疗法(包括sirna和mrna疗法)也可用于治疗眼睛疾病，然而，眼部组织的内在物理障碍、有效药物清除机制和其他复杂性对眼部rna递送提出重大挑战。由于接触时间短、泪液的存在和角膜细胞渗透的综合作用，眼表是药物递送的更复杂生物屏障之一。眼睛疾病的局部治疗面临的更大挑战之一是角膜的结构，它适合形成防止体液流失和病原体渗透的有效屏障。
5.虽然眼睛的所有组织都可以通过注射进入，但局部施用对于sirna诱导的基因沉默和mrna介导的治疗所需的频繁治疗方案来说更可取。传统上，药物递送到角膜存在问题，因为滴眼液会通过泪腺迅速排出。眼泪的快速排出，结合瞬目反射，引起可用于通过角膜吸收活性物质的角膜前停留时间短。据估计，滴眼液配方中所含的95％活性化合物会丢失，因为它无法穿过结膜或通过泪腺排出而丢失。尽管具有眼部保护机制，局部制剂还是显示一定程度的成功，但由于角膜的屏障特性，局部制剂仍面临挑战。
6.将sirna直接滴入眼表已用于体外治疗眼表和眼前节疾病。然而，任何化合物(包括mrna和sirna)的局部眼部施用都受到眼部解剖学限制和生理保护机制的限制。下面列出已进入临床试验的几种化学工程化sirna疗法，但大多数涉及玻璃体内注射：
7.·
syl1001，sylenthis s.a.，1、2期完成，3期正在进行
‑
滴眼液
8.·
syl040012(bamosiran)，sylenthis s.a.，1、2期完成
‑
滴眼液
9.·
sirna
‑
027(agn211745)，allergan，1、2期完成
‑
ivt注射
10.·
bevasiranib(cand5)，opko health inc.，2期完成
‑
ivt注射
11.·
qpi
‑
1007，quark pharmaceuticals，1期完成
‑
ivt注射
12.·
pf
‑
04523655，quark pharmaceuticals，1期完成
‑
ivt注射
13.由于眼病的基于rna的疗法需要频繁的治疗方案，多次注射的需要增加白内障、视网膜脱离、玻璃体出血和眼内炎的可能性。
14.其他递送rna的方法包括眼睛注射制剂，其中含有工程化病毒颗粒。这些颗粒被设计成将核酸有效载荷递送到眼睛。此类病毒类型(腺病毒、腺相关病毒和慢病毒)已被研究作为rnai疗法的载体。修饰的病毒载体诸如自补aav或辅助依赖型腺病毒是目前病毒递送的最先进技术。目前正在开发多种眼科应用。然而，病毒载体存在缺陷，包括：诱变的潜在性、有限的加载能力、适当的靶向、插入的可预测性、高生产成本和不利的免疫反应性。
15.递送表达mrna或sirna的质粒载体的尝试已经取得一些成功，但这种基于dna的表达载体可能整合到宿主基因组中并增加插入诱变的机会。工程化非病毒rna递送系统的优势在于它们相对安全并且可以很容易地用靶向配体来修改。此外，将rna封装到纳米载体可有助于提供长时间内持续释放rna的形式，且从而改善治疗方案。
16.包括天然和合成聚合物、复合物、脂质体、脂质复合物、肽和树枝状纳米材料的许多非病毒载体已被提议用于rna递送。尽管大多数这些策略的尝试在体内和体外取得了不同程度的成功，但都没有用于眼睛和其他组织疾病的rna疗法的临床应用。
17.虽然许多类型的聚合物已被用于递送寡核苷酸，但更多关注聚焦于使用阳离子聚合物，这是因为阳离子聚合物静电结合rna而无需共价连接或封装的能力，以及胺官能化阳离子聚合物提供胞质内rna递送的核体内缓冲和逃逸的能力。许多材料正在探索中，然而，开发可生物降解的纳米载体以在不引起安全问题的情况下增强rna递送一直是个挑战。
18.尽管有多种可用的rna递送策略，但缺乏安全有效的体内递送已经限制了临床上rna疗法的转化。rna递送需要有效的载体系统，它能够有效地浓缩寡核苷酸，在生理条件下提供稳定性，有利于细胞摄取而不管眼部屏障机制如何，并有利于rna释放到细胞质中。
19.因此，仍然需要将sirna和mrna递送至身体部位(包括但不限于角膜)的有效、安全和非侵入性方式。


技术实现要素：

20.根据本发明的第一方面，提供用于控制释放诸如短干扰rna或mrna的核酸的组合物，其包含硅纳米颗粒、至少一种氨基酸和至少一种脂质，其中硅纳米颗粒包含至少50重量％的硅。
21.有利地，此类组合物中存在脂质对硅纳米颗粒的表面电荷具有有益影响，为它们提供必要的zeta电位以允许改进诸如sirna或mrna的核酸的加载，并控制核酸在目标部位处核酸释放速率。制剂中存在至少一种脂质还允许控制硅的水解速率，使得硅纳米颗粒水解成生物可利用的原硅酸(osa)降解产物。在某些实施方案中，核酸是rna。在某些实施方案中，rna是sirna。在某些实施方案中，rna是mrna。
22.该组合物还包含至少一种氨基酸。有利地，已发现组合物中氨基酸的存在影响由硅纳米颗粒运送的核酸随时间的释放速率。
23.优选地，组合物还包含转染试剂。
24.根据本发明的第二方面，提供用作药物的根据本发明的第一方面的组合物。
25.根据本发明的第三方面，提供根据本发明第一方面的组合物，其用于眼科递送。
26.当然可以理解，关于本发明的一个方面描述的特征可以并入本发明的其他方面。例如，本发明的方法可以结合参考本发明的设备描述的任何特征，反之亦然。
附图说明
27.图1示出加载和未加载sirna的本发明组合物的zeta电位的比较。
28.各制剂标记为f1到f5；
29.图2示出加载和未加载sirna的本发明组合物的zeta电位的比较，其中硅纳米颗粒用硬脂胺(图2)、pc(图3)或卵磷脂(图4)进行表面处理，且胺为精氨酸；
30.图5示出本发明的组合物在hce细胞中的转染效率的结果。第一列的细胞用dapi染色，并在原始细胞中荧光以蓝色示出细胞核。第二列的细胞在原始细胞中发出绿光，表明用本发明的制剂f2至f5成功转染；和
31.图6示出凝胶电泳实验的结果，表明根据本发明制备的硅纳米颗粒成功地捕集mrna，特别是在硅纳米颗粒与mrna的比率为2:1或更高时(例如在2:1到8:1的比率范围内)。
32.图7示出分光光度法实验的结果，证实根据本发明制备的硅纳米颗粒成功地捕集mrna，特别是在硅纳米颗粒与mrna的比率为2:1或更高时(例如在2:1到8:1的比率范围内)。
33.图8示出测定载有sirna的本发明的硅纳米颗粒递送系统的转染效率的实验结果。
34.图9示出测定用载有sirna的本发明的硅纳米颗粒递送系统处理的细胞的转染后活力的实验结果。
35.图10示出当使用根据本发明的硅纳米颗粒递送系统将sirna递送至细胞时测定sirna诱导的基因沉默的程度的实验结果。
36.图11示出评估通过局部硅纳米颗粒制剂的体内眼部sirna递送的实验结果。
37.图12示出在用载有sirna的本发明的硅纳米颗粒递送系统处理期间通过活体动物成像测定小鼠角膜体内荧光素酶表达的实验结果。
具体实施方式
38.根据本发明的第一方面，提供用于控制释放诸如sirna或mrna的核酸的组合物，该组合物包含硅纳米颗粒、至少一种氨基酸和至少一种脂质，其中硅纳米颗粒包含至少50重量％硅。
39.定义
40.根据本公开，化合物的衍生物可以是具有基本相同结构但具有一个或多个取代的化合物。例如，一个或多个化学基团可以被添加、删除或替代另一个基团。在某些优选的实施方案中，衍生物保留其衍生母化合物的至少部分药物或美容活性，例如至少90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％的衍生母化合物的活性。在一些实施方案中，与衍生母化合物相比，衍生物可表现出增加的药物或美容活性。例如，在肽的上下文中，肽衍生物可涵盖这样的肽，其中一个或多个氨基酸残基已被添加、删除或置换为另一氨基酸残基。在置换的情况下，置换可以是非保守置换或保守置换，优选保守置换。
41.在本公开的上下文中，pc代表磷脂酰胆碱；sa代表硬脂胺；dope代表二油酰磷脂酰乙醇胺；dc
‑
胆固醇代表3β
‑
n
‑
(二甲氨基乙基)氨基甲酸胆固醇酯盐酸盐。
42.硅纳米颗粒
43.根据本发明的所有方面，组合物包含硅纳米颗粒。它们的标称直径介于5和400nm之间，例如50到350nm，例如80到310nm，例如100到250nm，例如120到240nm，例如150到220nm，例如约200nm。它们由纯硅或含可水解硅的材料制成。它们优选是多孔的。上面提到的标称直径可以指平均直径，并且硅纳米颗粒样品中总颗粒的至少90％可以落入指定的尺寸范围内。它们由纯硅或含可水解硅的材料制成。硅纳米颗粒可以通过标准技术制成多孔的，诸如将颗粒与氢氟酸(hf)/乙醇混合物接触并施加电流。孔的密度及其大小可以通过改变hf浓度和电流密度和暴露时间来控制，并可以通过扫描电子显微术和/或氮吸附解吸体积等温测量来监测。
44.硅纳米颗粒可以是纯硅或含可水解硅的另一种材料。如果它们不是纯硅，则它们包含至少50重量％的硅。例如，硅纳米颗粒可包含至少60％、70％、80％、90％或95％的硅。硅纳米颗粒优选地显示相同尺寸的纯硅颗粒的水解速率的至少10％的水解速率(例如在室温下pbs缓冲液中)。含硅材料水解的测定是本领域众所周知的，例如wo2011/001456。
45.根据本发明所有方面的纳米颗粒(例如，与精氨酸、甘氨酸和组氨酸中的一种或多种，和/或pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中的一种或多种配制在一起的纳米颗粒)优选是多孔的。例如，它们的孔隙率可以使它们的表面积比同等尺寸的无孔材料的表面积增加至少1.5、2、2.5、3、3.5或4倍。在一些实施方案中(例如，当纳米颗粒与精氨酸、甘氨酸和组氨酸中的一种或多种，和/或pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中的一种或多种配制在一起时)，优选地，它们的总表面积由于它们的孔隙率比相应的无孔颗粒的表面积增加至少50％或至少100％。在许多情况下，多孔硅纳米颗粒由于其孔隙率实际上将在总表面积上有极大的增加。
46.优选地(例如，当纳米颗粒与精氨酸、甘氨酸和组氨酸中的一种或多种，和/或pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中的一种或多种配制在一起时；此类纳米颗粒可配制用于局部递送，诸如递送至皮肤表面或局部递送至眼睛)，硅纳米颗粒具有2
‑
300nm之间的平均直径，例如20
‑
290nm、20
‑
280nm、20
‑
270nm、20
‑
260nm、20
‑
250nm、20
‑
240nm、20
‑
230nm、20
‑
220nm、20
‑
210nm，尤其是20
‑
200nm。有利的是，此尺寸的硅纳米颗粒非常适合皮肤递送，因为它们太小而不会阻塞毛囊皮脂腺(pilosebaceous ostra)或汗腺管(毛孔)，但它们的小尺寸允许颗粒主动渗透到毛囊底部，而不仅仅是充当表面药物库。
47.脂质
48.根据本发明的所有方面，(例如，当纳米颗粒与甘氨酸、精氨酸和组氨酸中的一种或多种配制在一起时)，硅纳米颗粒用至少一种脂质(例如，pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中一种或多种；以这种方式配制的纳米颗粒可适用于眼科递送)进行表面处理。已经发现，用脂质表面处理硅纳米颗粒有助于控制生物活性剂的释放速率。受制于生物活性剂(例如，核酸，诸如sirna或mrna)的性质，用于处理纳米颗粒表面的脂质类型会影响其释放速率。特别是，用脂质表面处理硅纳米颗粒有益地影响硅纳米颗粒的表面电荷，从而为它们提供必要的zeta电位，以允许改善短干扰rna或信使rna的加载，并控制它们在目标部位的释放速率。
49.硅与脂质的比率
50.优选地(例如，当脂质选自pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中的一种或
多种时)，脂质与硅的比率在1:1和15:1之间，例如1:1和13:1、1:1和12:1、1:1和11:1、1:1和10:1、1:1和9:1、1:1和8:1、1:1和13:1、2:1和12:1、2:1和11:1、2:1和10:1、2:1和9:1、2:1和8:1之间，例如在1:1和7:1、2:1和7:1、3:1和6:1、4:1和5:1之间。有利地，此脂质与硅的比率提供多层囊泡系统，该系统能够控制由硅纳米颗粒运送的生物活性剂(例如，核酸，诸如sirna或mrna)的释放和使其稳定，并有利于硅的生物可利用降解产物osa的受控释放。
51.有利地，脂质化合物可以对硅纳米颗粒的表面电荷产生显著影响。用磷脂酰胆碱(pc)、磷脂酰乙醇胺(pe)和卵磷脂处理的硅纳米颗粒在进行zeta电位分析时表现出负表面电荷(范围从
‑
60到
‑
20mv，硅与脂质的比率范围为1:1到1:3)。用硬脂胺处理的硅纳米颗粒表面显示正zeta电位(范围从0到40mv，硅与脂质的比率范围为1:1到1:3)。
52.在一个实施方案中，本发明第一方面的组合物包含经表面处理的硅纳米颗粒，基于经涂覆的纳米颗粒的总重量，该纳米颗粒以至少5重量％的脂质，例如至少20重量％，通常至少30重量％和尤其是至少50重量％的脂质来表面处理。已经发现在0.8:1和3:1之间的脂质与硅的摩尔比特别有利，例如1:1、1.5:1、2:1或2.5:1。
53.在某些实施方案中(例如，当纳米颗粒与精氨酸、甘氨酸和组氨酸中的一种或多种，和/或pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中的一种或多种配制在一起时；此类纳米颗粒可以适用于眼科递送)，基于经涂覆的纳米颗粒的总重量，本发明第一方面的组合物包含用至少5重量％磷脂，例如至少20重量％，通常至少30重量％，和尤其是至少50重量％的磷脂进行表面处理的硅纳米颗粒。已经发现，0.8:1至3:1之间的脂质与硅的摩尔比特别有利，例如1:1、1.5:1、2:1或2.5:1。
54.在一个实施方案中，磷脂具有500至1000的数均分子量。特别合适的磷脂是甘油磷脂。特别合适的磷脂是其中极性头基与季铵部分连接的那些磷脂，诸如磷脂酰胆碱(pc)或氢化磷脂酰胆碱。可以根据制剂的性质选择磷脂的类型，其中对于非质子制剂，优选中性或带负电荷的脂质，而对于质子制剂，优选带正电荷和小ch3链的脂质。优选地，侧链是具有15个或更多个碳原子的脂肪族侧链，或具有6个或更多个重复醚单元的醚侧链，诸如聚乙二醇或聚丙二醇链。
55.优选地(例如，在包含精氨酸、甘氨酸和组氨酸中的一种或多种的制剂中；此类制剂可能适合眼科递送)，脂质选自磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰胆碱(pc)、硬脂胺(sa)、卵磷脂或其任何组合。
56.在另外的实施方案中，可以用磷脂酰胆碱、氢化磷脂酰胆碱、硬脂胺、卵磷脂或其组合处理硅纳米颗粒的表面。如果sirna/mrna带电，这将特别有利。
57.在某些实施方案中(例如，当本发明的硅纳米颗粒与精氨酸、甘氨酸和组氨酸中的一种或多种，和/或pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中的一种或多种配制在一起时；此类纳米颗粒可配制用于眼科递送)，基于经涂覆的纳米颗粒的总重量，本发明的第一方面的组合物包含用至少5重量％氢化磷脂酰胆碱，例如至少20wt％，通常至少30wt％和尤其是至少50wt％的氢化磷脂酰胆碱来表面处理的硅纳米颗粒。已经发现，0.8:1至5:1之间的氢化磷脂酰胆碱与硅的摩尔比特别有利，例如1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1或4.5:1。
58.在某些实施方案中(例如，当本发明的硅纳米颗粒与精氨酸、甘氨酸和组氨酸中的一种或多种一起配制时；此类纳米颗粒可以配制用于眼科递送)，基于经涂覆的纳米颗粒的
总重量，本发明的第一方面的组合物包含用至少5重量％的磷脂酰胆碱，例如至少20wt％，通常至少30wt％和尤其是至少50wt％的磷脂酰胆碱来表面处理的硅纳米颗粒。已经发现，0.8:1至5:1之间的磷脂酰胆碱与硅的摩尔比特别有利，例如1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1或4.5:1。
59.在某些实施方案中(例如，当本发明的硅纳米颗粒与精氨酸、甘氨酸和组氨酸中的一种或多种一起配制时；此类纳米颗粒可以配制用于眼科递送)，基于经涂覆的纳米颗粒的总重量，本发明的第一方面的组合物包含用至少5重量％的卵磷脂，例如至少20wt％，通常至少30wt％和尤其是至少50wt％的卵磷脂来表面处理的硅纳米颗粒。已经发现，0.8:1至3:1之间的卵磷脂与硅的摩尔比特别有利，例如1:1、1.5:1、2:1或2.5:1。
60.在某些实施方案中(例如，当本发明的硅纳米颗粒与精氨酸、甘氨酸和组氨酸中的一种或多种一起配制时；此类纳米颗粒可以配制用于眼科递送)，基于经涂覆的纳米颗粒的总重量，本发明的第一方面的组合物包含用至少5重量％的硬脂胺，例如至少20wt％，通常至少30wt％和尤其是至少50wt％的硬脂胺来表面处理的硅纳米颗粒。已经发现，在0.8:1至3.5:1之间的脂质与硅的摩尔比特别有利，例如1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、2:0.75、2:1.5或3:1。
61.在某些实施方案中(例如，当本发明的硅纳米颗粒与精氨酸、甘氨酸和组氨酸中的一种或多种一起配制时；此类纳米颗粒可以配制用于眼科递送)，本发明的第一方面的组合物包含用pc和sa(优选pc:sa的重量比为1:1至20:1，更优选7:1至10:1，诸如pc:sa的重量比为72:8)表面处理的硅纳米颗粒。
62.在某些实施方案中(例如，当本发明的硅纳米颗粒与精氨酸、甘氨酸和组氨酸中的一种或多种一起配制时；此类纳米颗粒可以配制用于眼科递送)，本发明的第一方面的组合物包含用dope、sa和dc
‑
胆固醇表面处理的硅纳米颗粒。dope:sa的重量比可以在1:1到10:1的范围内，例如4:1到8:1。dope:dc
‑
胆固醇的重量比可以在1:1至5:1的范围内，例如1:1至3:1。sa:dc
‑
胆固醇的重量比可以在1:1至1:5的范围内，例如1:2至1:4。在一些实施方案中(例如，当本发明的硅纳米颗粒与精氨酸、甘氨酸和组氨酸中的一种或多种一起配制时；此类纳米颗粒可配制用于眼科递送)，dope:sa:dc
‑
胆固醇的重量比可为48:8:24。
63.氨基酸
64.根据本发明的所有方面(例如，当本发明的纳米颗粒与pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中的一种或多种配制在一起时)，脂质处理的硅纳米颗粒进一步用氨基酸处理。在其最广泛的意义上，术语“氨基酸”涵盖含有胺(
‑
nh2)和羧基(
‑
cooh)官能团的任何人工或天然存在的有机化合物。它包括α、β、γ和δ氨基酸。它包括任何手性构型的氨基酸。根据一些实施方案(例如，当本发明的纳米颗粒与pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中的一种或多种配制在一起时)，氨基酸优选是天然存在的α氨基酸。它可以是蛋白质氨基酸或非蛋白质氨基酸(诸如肉碱、左旋甲状腺素、羟脯氨酸、鸟氨酸或瓜氨酸)。在优选的实施方案中(例如，当本发明的纳米颗粒与pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中的一种或多种配制在一起时)，氨基酸包含精氨酸、组氨酸或甘氨酸，或精氨酸和甘氨酸的混合物。在特别优选的实施方案中，氨基酸包括甘氨酸。
65.根据优选的实施方案(例如，当纳米颗粒与精氨酸、甘氨酸和组氨酸中的一种或多种，和/或pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中的一种或多种配制在一起时)，在本
发明的所有方面的产品中存在的至少70重量％，例如至少80重量％，例如至少90重量％的sirna或mrna与表面处理的纳米颗粒缔合。
66.诸如sirna或mrna的核酸与脂质处理的硅纳米颗粒之间的分子缔合有利地确保诸如sirna或mrna的核酸在表面处理的硅纳米颗粒(例如，用pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中的一种或多种，和/或甘氨酸、精氨酸和组氨酸中的一种或多种处理的纳米颗粒)降解时变得可生物利用。组合物的降解速率由硅纳米颗粒的水解控制。由于可以控制该速率，因此也可以控制诸如sirna或mrna的核酸变得生物可利用的速率，以避免剂量倾泻和/或以确保仅当纳米颗粒找到其到达远离施用部位的位置的途径时才释放。例如，这可在纳米颗粒从它们被施用到的皮肤表面转移到基底位置时。
67.用氨基酸(例如，甘氨酸、精氨酸和组氨酸中的一种或多种，优选甘氨酸)处理经脂质处理的硅纳米颗粒(例如，用pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中的一种或多种处理的纳米颗粒)已被发现对加载在硅纳米颗粒上的诸如rna(例如，mrna或sirna)的核酸提供有益的稳定作用。特别是，用氨基酸处理经脂质处理的硅纳米颗粒已示出稳定例如眼部组织中的生物流体中的核酸，诸如rna。以此方式与氨基酸配制在一起的经脂质处理的硅纳米颗粒可特别适合眼科递送，并且可以提供用于眼科递送核酸(诸如sirna或mrna)的递送系统。
68.根据本发明所有方面的某些实施方案(例如，当纳米颗粒与pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中的一种或多种配制在一起时)，经脂质处理的硅纳米颗粒进一步用精氨酸、甘氨酸或其组合处理。用甘氨酸和精氨酸中的一种或多种表面处理并加载有诸如rna的核酸的硅纳米颗粒，表现出在生物体液中的更好生物活性稳定性，以及在眼部细胞和细胞质环境中对诸如rna(诸如sirna或mrna)的带电核酸的有效递送。
69.氨基酸与硅的比率
70.优选地(例如，当本发明的硅纳米颗粒与精氨酸、组氨酸和甘氨酸中的一种或多种，和/或pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中的一种或多种配制在一起时)，氨基酸与硅的比率在0.05:1和2:1之间，例如在0.05:1和1.8:1、0.05:1和1.6:1、0.05:1和1.4:1、0.05:1和1.2:1、0.05:1和1:1、0.05:1和0.9:1、0.05:1和0.8:1、0.05:1和0.6:1、0.05:1和0.5:1、0.05:1和0.4:1、0.05:1和0.3:1、0.05:1和0.2:1之间，优选在0.2:1和0.8:1之间，尤其是在0.3:1和0.7:1之间。有利地，氨基酸与硅的此比率进一步影响由硅纳米颗粒运送的rna分子的释放速率并使其稳定。
71.根据本发明的所有方面，用脂质(例如，pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中的一种或多种)和氨基酸(例如，甘氨酸、精氨酸和组氨酸中的一种或多种，诸如甘氨酸或甘氨酸和精氨酸的混合物)处理硅纳米颗粒(其可以配制用于眼科递送)。氨基酸可以是任何氨基酸。优选地，氨基酸是精氨酸或甘氨酸或甘氨酸和精氨酸的组合。脂质可以是任何脂质。优选地，脂质是磷脂。更优选地，其选自氢化pc、pc、dope、卵磷脂、硬脂胺及其衍生物中的一种或多种。任选地，脂质包含dc
‑
胆固醇和/或其衍生物。优选地，氨基酸与硅的比率在0.05:1至0.4:1之间，例如在0.08:1至0.35:1之间，尤其是0.09:1至0.32:1之间。在一些实施方案中(例如，当脂质选自pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中的一种或多种时)，氨基酸是精氨酸和甘氨酸的组合，其中arg:gly的比率在1:0.6和3:1之间，例如在1:0.8和2.5:1之间，例如在1:1和2:1之间。有利地，已经发现此类比率在眼部细胞和细胞质环
境中提供高rna释放速率以及rna(诸如sirna或mrna)的有效递送。因此，与氨基酸配制在一起的本发明的经脂质处理的硅纳米颗粒可以特别适合眼科递送，并且可以提供用于眼科递送核酸(诸如sirna或mrna)的递送系统。
72.根据本发明所有方面的其他实施方案(例如，当本发明的纳米颗粒被配制用于眼科递送时)，经脂质处理的硅纳米颗粒用精氨酸处理。脂质可以是任何脂质。优选地，脂质选自氢化pc、pc、dope、卵磷脂、硬脂胺及其衍生物中的一种或多种。任选地，脂质包含dc
‑
胆固醇和/或其衍生物。优选地，精氨酸与硅的比率在0.05:1和0.4:1之间，例如在0.08:1和0.35:1之间，尤其是0.09:1和0.32:1之间。有利地，已经发现此类比率在眼部细胞和细胞质环境中提供高rna释放速率以及rna(诸如sirna或mrna)的有效递送。因此，与氨基酸配制在一起的本发明的经脂质处理的硅纳米颗粒可以特别适合眼科递送，并且可以提供用于眼科递送核酸(诸如sirna或mrna)的递送系统。
73.根据本发明所有方面的其他实施方案(例如，当纳米颗粒被配制用于眼科递送时)，经脂质处理的硅纳米颗粒用甘氨酸处理。脂质可以是任何脂质。优选地，脂质选自氢化pc、pc、dope、卵磷脂、硬脂胺及其衍生物中的一种或多种。任选地，脂质包含dc
‑
胆固醇和/或其衍生物。优选地，甘氨酸与硅的比率在0.05:1和0.5:1之间，例如在0.08:1和0.45:1之间，尤其是0.09:1至0.42:1之间。有利地，已经发现此类比率在眼部细胞和细胞质环境中提供高rna释放速率，有效递送带电rna，诸如sirna和mrna，并且此类比率有利于细胞内化。因此，与氨基酸配制在一起的本发明的经脂质处理的硅纳米颗粒可以特别适合眼科递送，并且可以提供用于眼科递送核酸(诸如sirna或mrna)的递送系统。
74.rna
75.根据本发明所有方面的优选实施方案(例如，当本发明的硅纳米颗粒与精氨酸、组氨酸和甘氨酸中的一种或多种，和/或pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中的一种或多种配制在一起时；此类制剂可适用于眼科递送)，经脂质处理的硅纳米颗粒加载有rna，其可为sirna或mrna。在其最广泛的意义上讲，术语“sirna”涵盖小干扰rna(sirna)(有时也称为短干扰rna或沉默rna)，且包括长度为5至50个碱基对的双链rna分子，并在rna干扰(rnai)途径起作用。例如长度为10至45个碱基对、15至40个碱基对、20
‑
30个碱基对，尤其是20至25个碱基对。术语“mrna”涵盖信使rna并且可以任选地包括包含5
‑
引物帽和/或聚腺苷酸化末端的mrna。替代地，这两个特征之一可不存在。
76.根据本发明所有方面的优选实施方案的rna(例如，当本发明的硅纳米颗粒与精氨酸、组氨酸和甘氨酸中的一种或多种，和/或pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中的一种或多种配制在一起时；此类制剂可适用于眼科递送)可以是天然存在的或经化学修饰以增强它们的治疗特性，诸如增强活性、增加血清稳定性、更少脱靶和更低免疫激活。对rna的化学修饰可包括本领域公知的任何修饰。
77.根据某些实施方案(例如，当本发明的硅纳米颗粒与精氨酸、组氨酸和甘氨酸中的一种或多种，和/或pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中的一种或多种配制在一起时；此类制剂可适用于眼科递送)，rna是sirna。根据其他实施方案(例如，当本发明的硅纳米颗粒与精氨酸、组氨酸和甘氨酸中的一种或多种，和/或pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇和/或其衍生物的一种或多种配制在一起时；此类制剂可适用于眼科递送)，rna是mrna。
78.根据其他实施方案(例如，当本发明的硅纳米颗粒与精氨酸、组氨酸和甘氨酸中的
一种或多种，和/或pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中的一种或多种配制在一起时；此类制剂可适用于眼科递送)，核酸是dna或dna/rna杂交产物。
79.硅与核酸的比率
80.优选地(例如，当本发明的硅纳米颗粒与精氨酸、组氨酸和甘氨酸中的一种或多种，和/或pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中的一种或多种配制在一起时；此类制剂可适用于眼科递送)，硅与核酸(诸如sirna或mrna)的比率在1:1和8:1之间，例如在1:1和6:1、1:1和5:1、1:1和4:1或1:1和3:1之间。优选地，硅与核酸的比率在1:1和3:1之间。有利地，硅与核酸的此比率进一步影响由硅纳米颗粒运送的核酸分子(诸如sirna或mrna分子)的释放速率并稳定该核酸分子。具有硅与核酸的此类比率的制剂可特别适合眼科递送，并且可以提供用于将核酸递送至眼部组织的递送系统。
81.其他组分
82.转染试剂
83.根据本发明所有方面的优选实施方案(例如，当本发明的硅纳米颗粒与精氨酸、组氨酸和甘氨酸中的一种或多种，和/或pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中的一种或多种配制在一起时；此类制剂可适用于眼科递送)，经脂质处理的硅纳米颗粒可用转染剂表面处理。在其最广泛的意义上，“转染”是有意地将裸露或纯化的核酸引入真核细胞的过程。转染也可以指其他方法和细胞类型。可以将mrna转染到细胞中以实现其序列的翻译。可以转染sirna以实现rna沉默(即从目标基因中丢失rna和蛋白质)。
84.在其最广泛意义上，“转染剂”是有利于将裸核酸或纯化核酸引入真核细胞的试剂。例如，一些转染剂是促进将裸露或纯化sirna或mrna诱导到真核细胞中的试剂。
85.根据本发明所有方面的其他实施方案(例如，当本发明的硅纳米颗粒与精氨酸、组氨酸和甘氨酸中的一种或多种，和/或pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中的一种或多种配制在一起时；此类制剂可适用于眼科递送)，转染剂可以是脂质转染(脂质体转染)试剂、树枝状分子、与氯化钙溶液组合的含磷酸根离子的hepes缓冲盐溶液(hebs)、或阳离子聚合物，诸如二乙氨基乙基
‑
葡聚糖(deae
‑
葡聚糖)或聚乙烯亚胺(pei)。
86.在优选的实施方案中(例如，当本发明的硅纳米颗粒与精氨酸、组氨酸和甘氨酸中的一种或多种，和/或pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中的一种或多种配制在一起时)，转染剂为脂质转染试剂，诸如lipofectamine。
87.用于本发明各个方面的核酸诸如rna(诸如sirna或mrna)可以以各种形式提供。例如，在一些实施方案中(例如，当本发明的硅纳米颗粒与精氨酸、组氨酸和甘氨酸中的一种或多种，和/或pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中的一种或多种配制在一起时)，诸如rna的核酸提供在溶液中(单独或与各种其他核酸组合)，例如缓冲液。在一些实施方案中(例如，当本发明的硅纳米颗粒与精氨酸、组氨酸和甘氨酸中的一种或多种，和/或pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中的一种或多种配制在一起时)，作为盐的形式提供诸如rna的核酸，单独或与其他分离的核酸组合。在一些实施方案中(例如，当本发明的硅纳米颗粒与精氨酸、组氨酸和甘氨酸中的一种或多种，和/或pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中的一种或多种配制在一起时)，诸如rna的核酸以可重构的冻干形式提供。例如，在一些实施方案中，诸如rna的核酸可以单独以冻干丸粒的形式提供，或与其他分离的核酸一起以冻干丸粒的形式提供。在一些实施方案中(例如，当本发明的硅纳米颗粒与精氨
酸、组氨酸和甘氨酸中的一种或多种，和/或pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中的一种或多种配制在一起时)，诸如rna的核酸被提供附于固体物质，诸如珠子、膜等之上。在一些实施方案中(例如，当本发明的硅纳米颗粒与精氨酸、组氨酸和甘氨酸中的一种或多种，和/或pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中的一种或多种配制在一起时)，诸如rna的核酸提供在宿主细胞中，例如携带质粒的细胞系、或携带稳定整合序列的细胞系。
88.根据本发明使用的例如rna的核酸包括双链和单链dna、rna、dna:rna杂合体、以及pna(肽核酸)或rna或dna之间的杂合体。该术语还包括已知类型的修饰，例如本领域已知的标记，甲基化，“帽”，用类似物置换一个或多个天然存在的核苷酸，核苷酸间修饰，例如具有不带电荷的键(例如，甲基磷酸酯、磷酸三酯、磷酰胺酯、氨基甲酸酯等)、带负电荷的键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、和带正电荷的键(例如氨基烷基磷酰胺酯、氨基烷基磷酸三酯)的那些修饰，含有侧基部分的那些修饰，例如蛋白质(包括核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚
‑
l
‑
赖氨酸等)，具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的那些修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的那些修饰、含有烷基化剂的那些修饰、具有修饰键(例如，α异头核酸等)的那些修饰，以及未修饰形式的聚核苷酸或寡核苷酸。
89.应当理解，如本文所用，术语“核苷”和“核苷酸”将包括以下部分，其不仅包含已知嘌呤和嘧啶碱基，而且包含已被修饰的其他杂环碱基。此类修饰包括甲基化嘌呤或嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶、或其他杂环。修饰的核苷或核苷酸也将包括对糖部分的修饰，例如，其中羟基中的一个或多个被卤素、脂肪族基团取代，或被官能化为醚、胺等。对核苷酸或多核苷酸的其他修饰涉及重排、附加、取代或以其他方式改变嘌呤或嘧啶碱基上的官能团，其与相应互补嘧啶或嘌呤例如异鸟嘌呤、异半胱氨酸等形成氢键。在一些实施方案中，寡核苷酸和/或探针包括至少一个、两个、三个或四个修饰的核苷酸。
90.在一些实施方案中，本文公开的诸如rna的核酸包括一种或多种通用碱基。如本文所用，术语“通用碱基”是指可与选自a、u/t、c和g的多于一种核苷酸杂交的核苷酸类似物。在一些实施方案中，通用碱基可选由脱氧肌苷、3
‑
硝基吡咯、4
‑
硝基吲哚、6
‑
硝基吲哚、5
‑
硝基吲哚。
91.硅纳米颗粒的制备
92.与本发明相关的硅纳米颗粒可以通过本领域常规技术方便地制备，例如通过研磨工艺或通过用于减小粒度的其他已知技术。含硅纳米颗粒可由硅酸钠颗粒、胶体二氧化硅或硅片材料制成。大尺寸或微尺寸颗粒在球磨机、行星式球磨机或其他尺寸减小机构中研磨。所得颗粒可以被空气分级以回收纳米颗粒。也可以使用等离子体方法和激光烧蚀来生产纳米颗粒。
93.多孔颗粒可通过本领域常规方法(包括本文所述的方法)来制备。
94.乳膏和凝胶的制备
95.乳膏和凝胶可以简单地通过分散(即混合)本发明的硅纳米颗粒与乳膏或凝胶基质来配制。例如，可以将硅纳米颗粒搅拌到药物乳膏基质中。对于凝胶，可以将粉末以粉末形式搅拌到凝胶基质中，然后可以将凝胶水合，或者可以将粉末搅拌到预水合的凝胶中。
96.眼科递送
97.根据本发明的第三方面，提供根据本发明第一方面的组合物(例如，用精氨酸、组氨酸和甘氨酸中的一种或多种，和/或pc、氢化pc、sa、dope、dc
‑
胆固醇及其衍生物中的一种
或多种配制的组合物)，其用于眼科递送。
98.虽然眼睛的所有组织都可以通过注射进入，但局部施用是优选用于对于sirna诱导的基因沉默治疗所需的频繁治疗方案。然而，由于接触时间短、泪液稀释和角膜细胞渗透性差的综合作用，眼表是更复杂的药物递送的生物屏障之一。
99.本发明的组合物提供将sirna递送至眼睛组织(诸如至纤维层、血管层和视网膜的一种或多种组织)的有效的、临床安全的和非侵入性的方式。例如，本发明的组合物提供将sirna递送至选自角膜、巩膜、虹膜、睫状体、脉络膜、小带纤维、晶状体囊、晶状体核、玻璃体和视网膜中的一种或多种组织的有效的、临床安全的和非侵入性的方法。
100.本发明的组合物可以捕集和稳定活性药剂，特别是核酸，诸如sirna和mrna。反过来，本发明的纳米颗粒能够将这些活性药剂，诸如核酸(诸如sirna或mrna)，递送至眼睛的细胞(例如，至角膜、巩膜、虹膜、睫状体、脉络膜、小带纤维、晶状体囊、晶状体核、玻璃体和视网膜的细胞中的一种或多种)。在将组合物施用到一种或多种眼睛组织后，眼部细胞将纳米颗粒内化。这使得活性药剂诸如核酸(例如，sirna或mrna)能够渗入眼部细胞，确保核酸在靶部位的受控释放。
101.本发明第一方面的组合物可以配制用于眼科递送。例如，组合物可以与一种或多种眼科相容的赋形剂配制在一起。组合物可用于治疗眼科疾病。例如，本发明第一方面的组合物可用于治疗黄斑变性、结膜炎、青光眼、糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、圆锥角膜、白内障、视网膜炎和葡萄膜炎，特别是黄斑变性。黄斑变性可包括与年龄相关的黄斑变性。
102.在另一方面中，本发明还提供与本发明第一方面的组合物相关的方法和试剂。例如，提供包括将根据本发明第一方面的组合物任选地与一种或多种眼科相容的赋形剂组合递送至眼睛的一个或多个组织(例如，至选自角膜、巩膜、虹膜、睫状体、脉络膜、小带纤维、晶状体囊、晶状体核、玻璃体和视网膜的一个或多个组织)的方法。提供治疗眼科疾病的方法，其包括将根据本发明第一方面的组合物任选地与一种或多种眼科相容的赋形剂组合递送至眼睛的一个或多个组织。例如，此类方法可以包括治疗黄斑变性、结膜炎、青光眼、糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、圆锥角膜、白内障、视网膜炎或葡萄膜炎，特别是黄斑变性。
103.实施例
104.本发明可通过以下非限制性实施例进一步说明。
105.材料
106.硅制备
107.单面抛光的p型或n型硅片购自德国si
‑
mat。所有清洁和蚀刻试剂均为无尘室级。蚀刻硅通过在1:1(v/v)纯乙醇和10％hf酸水溶液中以80ma/cm2的阳极电流密度对p型硅进行阳极蚀刻2
‑
10分钟来制备。蚀刻后，样品在使用前用纯乙醇冲洗并在干燥的高纯氮气流下干燥。
108.蚀刻的硅片，使用研磨球和/或研杵和研钵进行p 或n
‑
粉碎。使用retsch品牌的筛规38um和振荡器as200筛分细粉。均匀和选定的尺寸(20
‑
100um)是通过筛子的孔径大小来实现的。粒度由马尔文仪器(malvern instrument)的康塔(quantachrome)系统和pcs来测量。样品保存在密闭容器中直至进一步使用。
109.纳米硅粉末也从西格玛(sigma)和中国合肥凯尔(hefel kaier,china)获得。在进行加载和蚀刻之前，通过pcs测量粒度并记录颗粒尺寸(尺寸范围在20
‑
100nm之间)。使用研磨球或使用研钵和研杵粉碎硅片。使用retsch牌筛规38um和振荡器as200对细粉筛分，并收集具有所需尺寸的均匀纳米颗粒。
110.硅纳米颗粒的活化
111.将250ml乙醇和500mg直径100nm的多孔硅纳米颗粒混合并使用磁棒搅拌30分钟。然后将溶液以3000rpm离心30分钟。弃去上清液，且纳米颗粒在5ml蒸馏水中洗涤并转移到圆底烧瓶中。将烧瓶的内容物冷冻(在
‑
25℃下2小时)。使用冷冻干燥机将冷冻的纳米颗粒冷冻干燥过夜。所得干粉是活化的纳米颗粒。
112.胺、脂质、lipofectamine加载的sirna纳米颗粒的制备。
113.制剂sis005
‑
ps91和sis005
‑
ds61(含甘氨酸)均通过将脂质体形成材料的薄膜溶解在含sirna的硅纳米颗粒的水性悬浮液中来制备。然后将混合物三次冻融，并在体外测试hces细胞的转染效率。同时，在进一步修改后测试sis005
‑
pds1051配方，旨在引入更多正电荷(因为它被证明具有负zeta电位)，这被认为对于用于角膜的sirna递送系统是优选的。为此，增加制剂中阳离子脂质的比率。
114.胶体稳定性通过动态光散射方法与zeta电位测量平行评估，无加载和加载制剂均如此。sirma的封装率也通过分光光度法测定。转染效率(细胞内化)通过以下来评估：在人角膜上皮细胞中的流式细胞术，然后是双萤光素酶测定，该测定用于确定在用加载sirna的制剂处理后的体外敲低(knockdown)。
115.转染制剂(si005
‑
ps91、si005
‑
ds61、si005
‑
dsc613等)的制备过程
116.这些和其他制剂的成分如下表所示。
[0117][0118]
材料
[0119]
硅纳米颗粒、不含核酸酶的水、氯仿
[0120]
脂质：硬脂胺(sa)，目录号305391(sigma
‑
aldrich)
[0121]
来自蛋黄的l
‑
α
‑
磷脂酰胆碱(pc)，目录号61755(sigma
‑
aldrich)
[0122]
二油酰l
‑
α
‑
磷脂酰乙醇胺(dope)，目录号p1223(sigma
‑
aldrich)
[0123]
n
‑
(2
‑
二甲氨基乙基)氨基甲酸酯胆固醇(dc
‑
chol)，目录号92243(sigma
‑
aldrich)
[0124]
100μm(1.33μg/μl)非特异性nsc4(定制sirna双链体，eurogentec)
[0125]
100μm(1.33μg/μl)靶向siluc(定制sirna寡核苷酸双链体，eurogentec)
[0126]
100μm(1.33μg/μl)fam标记sirna(green siglo，dharmacon)
[0127]
设备
[0128]
旋转蒸发系统、涡流机、浴式超声波仪、水浴、圆底烧瓶、万能试管、eppendorf管、微量移液管、冻干系统、zetasizer、高速离心机、nanodrop分光光度计、荧光读数器
[0129]
过程
[0130]
荧光sirna(siglo)的nb在操作过程中避免光暴露(例如用铝箔盖住烧瓶和试管)
[0131]
a部分
‑
将sirna加载到硅纳米颗粒/脂质组合物中
[0132]
步骤i＝准备组分1：sirna
‑
sinp混合
[0133]
1.在不含核酸酶的水中制备0.2mg/ml的过滤硅纳米颗粒溶液。
[0134]
2.将上述溶液分装(700μl)到8个eppendorf微管中，使得每个微管含有140μg sinp。
[0135]
3.向每个等分试样中加入sirna和甘氨酸，并用不含核酸酶的水将体积调至1.4ml：
[0136][0137]
4.彻底混合管并在室温下搅拌温育样品1小时。
[0138]
步骤ii＝制备组分2：脂质膜
[0139]
1.将每种脂成分(sa、pc、dope、dc
‑
chol)溶解在氯仿中，至浓度为0.2mg/ml。
[0140]
2.将所需量的每种脂质转移到小圆底烧瓶中并充分混合。将每种脂质混合物制备8个拷贝(在8个烧瓶中)：
[0141]
a.脂质基ds61
[0142]
68μg dope(340μl)
[0143]
12μg sa(60μl)
[0144]
b.脂质基ps91
[0145]
72μg pc(360μl)
[0146]
8μg sa(40μl)
[0147]
c.脂质基dsc613
[0148]
48μg dope(240μl)
[0149]
8μg sa(40μl)
[0150]
24μg dc
‑
chol(120μl)
[0151]
d.脂质基pds1051
[0152]
50μg pc(250μl)
[0153]
25μg dope(125μl)
[0154]
5μg sa(25μl)
[0155]
e.脂质基pds1052
[0156]
48μg pc(240μl)
[0157]
23μg dope(115μl)
[0158]
9μg sa(45μl)
[0159]
f.脂质基pdsc10514
[0160]
40μg pc(200μl)
[0161]
20μg dope(100μl)
[0162]
4μg sa(20μl)
[0163]
16μg dc
‑
chol(80μl)
[0164]
3.使用旋转蒸发系统小心地蒸发溶剂以形成薄脂质膜。将干燥脂质置于真空下以去除残留溶剂。
[0165]
步骤iii＝用脂质体(组分2)封装sirna
‑
sinp(组分1)
[0166]
1.用加载有sirna或空的硅纳米颗粒样品(来自步骤i)溶解薄脂质膜(来自步骤ii)。向每个含有脂质膜(a、b、c、d、e、f)的烧瓶中独立地加入200μl的第1、第2、第3或第4硅纳米颗粒/sirna混合物：
[0167][0168]
2.通过向每个烧瓶中加入200μl不含核酸酶的水，将溶液体积调整至400μl。
[0169]
3.用封口膜覆盖每个烧瓶，彻底混合内容物并在室温下温育1小时。
[0170]
4.涡旋以使脂质膜完全溶解。将烧瓶放入浴超声处理15秒以帮助溶解脂质。
[0171]
5.将每个烧瓶中的所有内容物独立地转移到eppendorf微量管中。
[0172]
6.将所有试管放入冷冻器(
‑
20℃)并保存至少3小时(或过夜)。
[0173]
7.从冷冻器中取出样品，且放入30℃水浴10分钟。在室温下冷却并彻底涡旋。
[0174]
8.再重复冻融(步骤5和6)两次。
[0175]
9.将所有样品保存在冷冻器(
‑
20℃)中直至分析。
[0176]
10.每个加载的样品在体积400μl中含有[10μg sirna:20μg sinp:80μg脂质基:10μg甘氨酸]。
[0177]
部分b
‑
硅纳米颗粒/脂质制剂的表征
[0178]
封装效率
[0179]
sirna的封装效率通过测定在经高速离心将加载的颗粒与游离(未结合的)sirna分离后的封装效率来研究。
[0180]
1.50μl每个样品收集到离心微管。
[0181]
2.将所有样品以21,000xg离心30分钟。
[0182]
3.将每个样品的25μl(上半部分)上清液转移到单独的管中(表示为s1)，并在4℃下储存直至分析(在siglo加载样品的情况下避免光暴露)。
[0183]
4.将25μl的2％sds加入丸块样品(带有剩余的上清液)中以破坏脂质双层并释放结合的sirna。
[0184]
5.再次以21,000xg对管离心30分钟并收集上清液(表示为s2)。
[0185]
6.使用nanodrop分光光度计测量所有上清液s1和s2样品在260nm处的吸光度(od)。对于加载siglo的样品，测量s1和s2上清液样品中的荧光强度(fi)。
[0186]
7.计算封装效率(ee％)：
[0187][0188]
其中od
s1
‑
上清液s1(第一次离心后)的吸光度(260nm)
[0189]
od
s2
‑
上清液s2(第二次离心后)的吸光度(260nm)
[0190]
对于加载siglo的样本，分别使用fi
s1
和fi
s2
代替od
s1
和od
s2
。
[0191]
8.上清液样品中sirna的浓度和被硅纳米颗粒制剂捕集的sirna的量可以使用sirna校准曲线(如前所述)确定。
[0192]
zetasizer测量
[0193]
胶体稳定性通过动态光散射法与zeta电位测量平行进行评估。对未加载(空)制剂样品以及加载siluc/nsc4的样品进行测量。
[0194]
1.收集每个样品200μl，其用不含核酸酶的超纯水稀释至总体积1ml。
[0195]
2.将样品加载到折叠的毛细管池。
[0196]
3.使用zetasizer读取样品：颗粒尺寸、多分散指数和zeta电位。一式三份运行每个测量。数据如图1、2和3所示。
[0197]
hces细胞的转染效率
[0198]
通过流式细胞术在人角膜上皮细胞中评估转染(细胞内化)的效率。出于本研究的目的，使用加载有荧光标记的sirna探针(siglo)的制剂样品。
[0199]
1.每孔接种在1ml富含10％fbs的dmem中的2x105个hces细胞(在12孔板上)，并在
标准条件下生长24小时(直到80％汇合)。
[0200]
2.将培养基更换为每孔950μl新鲜的富含10％fbs的dmem。
[0201]
3.将加载有siglo的硅纳米颗粒/脂质样品调整到室温。
[0202]
4.通过将6μl lipofectamine rnaimax试剂与3μl siglo原液(100μm)在151μl optimem中混合并在室温下温育15分钟，制备具有lipofectamine转染试剂的对照样品。
[0203]
5.通过在每孔中加入53.3μl的每种siglo加载制剂或lpf对照以获得0.1μm siglo浓度，以3个拷贝处理细胞。
[0204]
6.在标准条件下(37℃和5％co2)使细胞生长24小时。
[0205]
7.弃去培养基并用500μl pbs清洗孔。
[0206]
8.加入300μl胰蛋白酶
‑
edta并在37℃下温育板10分钟。
[0207]
9.立即加入300μl富含10％fbs的dmem以停止胰蛋白酶作用(trypsination)。
[0208]
10.将细胞分别转移到微管中，在1000
‑
2000rpm下离心5分钟。
[0209]
11.弃去上清液，小心地将细胞悬浮在500μl pbs中。
[0210]
12.以1000
‑
2000rpm离心样品5分钟。
[0211]
13.弃去上清液，小心地将细胞重悬在600μl含有pi染料的facs缓冲液中。
[0212]
14.使用流式细胞仪分析样品。
[0213]
敲低效率
[0214]
要确定敲低诱导的效率，用加载有特异性(siluc)、非特异性(nsc4)和未加载制剂的测试制剂样品进行双荧光素酶分析。
[0215]
1.每孔接种在100μl富含10％fbs的dmem中的6.5x10
3 hces细胞(在96孔板上)，并在标准条件下生长24小时。准备2个板来研究所有制剂样品，每种样品5个拷贝。
[0216]
2.按照制造商的说明，使用lipofectamine 2000，用renilla和luc2p质粒转染细胞。向每孔添加50μl试剂混合物，其中含有0.3μl lipofectamine 2000、1ng renilla质粒和5ng luc2p质粒，在optimem培养基中稀释至50μl的总体积。
[0217]
3.在37℃和5％co2下培养细胞24小时。
[0218]
4.每孔更换90μl新鲜dmem培养基。
[0219]
5.将制剂样品调至室温。将每个样品的32μl与28μl的optimem混合。
[0220]
6.用lipofectamine转染试剂制备对照样品：
[0221]
·
将1.2μl lipofectamine rnaimax试剂与55.8μl optimem混合并在室温下温育5分钟，然后加入3μl siluc储备液并继续温育10分钟
[0222]
·
将1.2μl lipofectamine rnaimax试剂与55.8μl optimem混合并在室温下温育5分钟，然后加入3μl nsc4储备液并继续温育10分钟
[0223]
·
将1.2μl lipofectamine rnaimax试剂与58.8μl optimem混合，并在室温下温育15分钟
[0224]
7.通过在每孔中加入10μl加载或空制剂或lpf对照，以5个拷贝处理细胞。
[0225]
8.在标准条件下(37℃和5％co2)生长细胞。
[0226]
9.在48小时后，弃去培养基并用pbs洗涤孔。
[0227]
10.每孔加入20μl passive lysis缓冲液。
[0228]
11.在定轨振荡器(900rpm)上室温温育板15分钟。
[0229]
12.使用dual
‑
luciferase reporter assay试剂盒和lumistar optima板读取器，按照制造商的方案读取发光水平。
[0230]
将加载sirna的硅纳米颗粒与lipofectamine(sis005
‑
lpf)结合
[0231]
1.将硅纳米颗粒悬浮液分装到6个eppendorf微管中，使得每个微管都含有20μg sinp。
[0232]
2.向上述sinp等分试样中加入10μg sirna：
[0233]
a.向2个微管添加37μl 20μg siluc2p＝靶向sirna
[0234]
b.向2个微管添加37μl 20μm nsc4＝非特异性sirna
[0235]
c.未加载控制：剩下的2个含有sinp的微管没有sirna，用于制备空对照
[0236]
3.在室温下搅拌温育样品1小时，然后涡旋并将试管放入冷冻器(
‑
20℃)中并保持2
‑
3小时。
[0237]
4.将样品连接到冷冻干燥系统过夜以蒸发水分。
[0238]
5.在进一步分析之前，将上述加载sirna(或未加载的对照)的sinp样品溶解在lipofectamine溶液(lipofectamine rnaimax试剂，目录号13778075，thermofisher scientific)中，并在不含核酸酶的水中稀释至150μl，涡旋和在室温温育l小时：
[0239][0240]
图3中示出的结果
[0241]
评估在加载时本发明的硅纳米颗粒的表面电荷的变化。通常，在表面上结合带负电荷的sirna分子后，颗粒的表面电荷降低(从更正值变为更负值)。对于几乎一半的测试制剂样品观察到此效果，而其余样品没有示出任何显著差异。加载sirna后zp的变化如图3所示。含有pe的所有样品的zeta电位不受sirna加载的影响。类似地，大多数含有卵磷脂的制剂没有示出显著zp差异。只有卵磷脂
‑
si
‑
np比率为75μg:200μg(f31)的样品示出在加载sirna时表面电荷降低(p＝0.0001)。此外，对于加载pc的纳米颗粒(f01、f02)，在加载sirna后观察到zp显著降低(75μg:200μg的si:pc比率的p＝0.0002，且150μg:200μg的si:pc比率的p＝0.0005)，且对于加载精氨酸的pc
‑
sinp(f04、f07)也是如此，无论氨基酸含量如何(75μg:200μg:20μg的si:pc:arg比率的p＝0.0196，且75μg:200μg:40μg的si:pc:arg比率的p＝0.0490)。
[0242]
sirna加载对硬脂胺表面处理的硅纳米颗粒的表面电荷影响最大，诱导高负电荷。正如之前的分析示出，加载有sa和sa 精氨酸的空si
‑
np具有正或接近中性的表面电荷，因此它们有效地吸引阴离子sirna分子。
[0243]
加载比率对mrna捕集效率的影响
[0244]
根据上述针对sis005
‑
dsc613g的方案制备样品。每个样品包含以下的重量比率：
硅纳米颗粒:二油酰磷脂酰乙醇胺(dope):硬脂胺:3β
‑
n
‑
(二甲氨基乙基)氨基甲酸胆固醇酯盐酸盐(dc
‑
胆固醇):甘氨酸为10:24:4:12:5。样品以不同的核酸与硅纳米颗粒的比率制备，如下表所示。
[0245]
具有不同mrna加载比率的prosilic
‑
dsc613g制剂样品
[0246][0247]
*这是所有其他组分(硅纳米颗粒、脂质和氨基酸)与mrna的重量比率。
[0248]
**近似电荷比(称为n/p比)基于mrna的长度、rna的平均分子量(大约325da)和阳离子脂质的分子量(硬脂胺：269.5da；dc
‑
胆固醇：500.8da)计算。
[0249]
使用凝胶电泳评估硅纳米颗粒制剂对mrna的捕集
[0250]
硅纳米颗粒与mrna的加载比对mrna捕集效率的影响通过凝胶电泳来研究。使用1％e
‑
gel ex预制琼脂糖凝胶。使用gel logic 100 imaging system(kodak)使凝胶可视化。结果在图6中示出。
[0251]
图6在第1行示出未加载mrna(u0)。加载有mrna的硅纳米颗粒(l0.5、l1、l2、l3、l4、l5、l6、l8)在第2至9行，按硅纳米颗粒与mrna的比率增加(从左到右)的顺序。将等量的mrna(100ng)加载到第1至第9行的每个中。invitrogen e
‑
gel 1kb plus express dna ladder(80ng)加载到第m行中作为标记。第10行留空(作为水空白)。
[0252]
电泳证明本发明的sis005
‑
dsc613g制剂成功地捕集mrna，并且在硅纳米颗粒与mrna的更高比率下，诸如高于2:1的比率，表现得特别好。图6中的对照泳道(未加载的mrna，u0)示出预期的单个快速移动条带。条带也在第2行(加载l0.5)和第3行(加载l1)中可见。此可见条带对应于未结合的mrna。与对照(u0)相比，第2行和第3行(尤其是第3行)中的条带强度较低。这表明即使在硅纳米颗粒与mrna比率非常低的样品中，一些mrna仍然被硅纳米颗粒捕集，且因此在条带中不可见。
[0253]
有效捕集的mrna无法穿过凝胶孔并保留在孔中(因此不会出现条带，与u0、l0.5和
l1不同)。图6示出样品l2至l8，与第1至3行相比，硅纳米颗粒的含量增加，成功捕集mrna。这通过没有看到u0、l0.5和l1的条带而证明。这表明本发明的硅纳米颗粒制剂能够成功地捕集mrna。结果表明，最佳加载比率(mrna最大捕集的比率，同时使用的纳米颗粒的量最少)为l2，对应于2:1(硅纳米颗粒:mrna)和11:1(递送系统的所有其他成分:mrna)的比率。已发现相同的加载率对sirna加载有效。此比率对应于大约2.5的n/p电荷比。
[0254]
使用分光光度法评估捕集效率
[0255]
为了评估mrna捕集的效率(ee，表达为百分比)，还对sis005
‑
dsc613g样品(u0至l8)离心以分离未结合的mrna。上清液中核酸含量采用分光光度法测定，且使用下式计算捕集效率：
[0256][0257]
od
未加载
是未加载mrna对照(u0)的吸光度。od
加载
是每个样品l0.5到l8的吸光度。
[0258]
结果在图7中示出，符合凝胶电泳实验的结果。随着硅纳米颗粒与mrna的比率增加，捕集效率增加，直到达到平台期，在硅与mrna的比率大于2:1的比率时趋于平稳。
[0259]
体内评估硅纳米颗粒制剂的活性
[0260]
根据上述针对sis005
‑
ps91g和sis005
‑
dsc613g的方案制备样品。这些样品包含以下重量比的sirna、硅纳米颗粒、脂质和甘氨酸：
[0261][0262]
sa是硬脂胺，dope是二油酰磷脂酰乙醇胺，pc是磷脂酰胆碱，且dc
‑
chol是3β
‑
n
‑
(二甲氨基乙基)氨基甲酸胆固醇酯盐酸盐。
[0263]
加载sirna的硅纳米颗粒制剂的制备
[0264]
制备包含特异性sirna(siluc)和非特异性sirna(nsc4)的样品。两种sirna(siluc和nsc4)均设计为21聚体，具有中心19bp双链体区域和每个3'端的对称dtdt二核苷酸突出端。sirna由eurogentec(比利时)提供。
[0265]
为了制备样品，将溶解在不含核酸酶的水中的sirna添加到纳米颗粒的水溶液中，并在室温下温育60分钟。使用2:1的硅纳米颗粒与mrna的比率(因为在凝胶电泳和分光光度法实验中发现这是最佳比率，参见上文)。
[0266]
活体动物成像
[0267]
根据英国动物福利法，在获得内政部(苏格兰)和卫生、社会服务和公共安全部(北爱尔兰)的伦理批准的情况下，将动物用于以下实验。对野生型c57bl/6小鼠进行评估荧光sirna(dy
‑
547标记的siglo，dharmacon，英国)递送至角膜的实验。为了评估制剂的sirna生物利用度和沉默活性，使用报告基因敲入型小鼠系(krt12 /luc2)，其中萤火虫荧光素酶在角膜上皮中特异性表达(在内源性krt12启动子的控制下)。此动物模型是在先前报道的
c57bl/6背景上开发的，且为使用报告基因表达监测的sirna递送方法的体内评估提供可靠的模型。对于体内成像，使用1.5
‑
2％异氟醚(abbott laboratories ltd.，英国)在大约1.5l/min氧气流中麻醉小鼠。在局部施用后的确定时间点，使用dsred滤光器组合(激发535nm，发射570nm)，使用带有livingimage 3.2软件的xenogen ivis spectrum(均为perkin elmer，英国)检测siglo的荧光。为了测量荧光素酶报告基因表达，即将成像前，将与viscotears凝胶(novartis，英国)按1:1w/w混合的荧光素(30mg/ml d
‑
荧光素钾盐；gold biotechnology，美国)滴在麻醉小鼠的眼睛上。生物发光读数由ivis spectrum在大约10分钟时间内获取，并在确保信号在获取时间内保持稳定后使用livingimage软件量化。对于信号强度量化，为每只眼睛分别选择感兴趣区域(roi)，在整个实验过程中保持roi参数(大小和形状)恒定。使用分体控制测量方案将值表示为右/左眼比(re/le)。
[0268]
体内sirna处理
[0269]
通过比较在一只眼睛中在测试下的处理与相同动物的另一只眼睛中的阴性对照，使用分体对照进行实验。在处理期间，如上所述对小鼠进行麻醉。制备含有25μm sirna的硅纳米颗粒制剂，以2:1的sinp与mrna的重量比复合，并以每只眼睛4μl的总体积作为滴剂局部施用到完整角膜。施用后，小鼠保持麻醉状态15分钟以允许吸收并最大限度地摄入。处理后，如下所述进行荧光和发光实验。
[0270]
评估sirna对角膜的渗透
[0271]
为了研究sirna向角膜的递送，使用含有siglo的滴眼液对野生型小鼠进行体内荧光研究。将荧光sirna
‑
硅纳米颗粒制剂施用到右眼上方，而将相同量的裸siglo局部施用于每只小鼠的左眼作为对照。在siglo施用后15分钟(即治疗程序后立即)和3、6和24小时，使用ivis spectrum获取荧光实时成像，并将信号强度标准化为治疗前(即未治疗的眼睛)测量的背景荧光，并按之前所述那样进行量化。在3小时或24小时进行测量后，处死小鼠，且摘除眼睛，在室温下在pbs中的4％多聚甲醛中固定30分钟，浸没在polyfreeze(sigma
‑
aldrich，英国)中，并立即在
‑
80℃冷冻。使用低温恒温器(cm 1850，leica)切割5微米切片，置于apes涂覆的载玻片(3
‑
氨基丙基三乙氧基硅烷，sigma
‑
aldrich，英国)上，该载玻片具有含dapi的封固剂(dapi i，vysis，美国)，且荧光用配备有axiocam mrc相机上的20x/40x n archoplan镜头的axioscope a1显微镜(carl zeiss，德国)来可视化。
[0272]
sirna介导的基因沉默的评估
[0273]
荧光素酶报告基因小鼠(n＝7)用于确定在局部递送本发明的硅纳米颗粒后sirna在角膜中的生物利用度。在分体对照实验中，将与硅纳米颗粒制剂复合的荧光素酶靶向siluc作为滴剂局部施用到麻醉小鼠右眼(re)的完整角膜，而左眼(le)则相应地用与硅纳米颗粒制剂复合的nsc4来处理，作为阴性对照。每天重复治疗，连续8天，大约4
‑
5小时后进行体内眼部发光测量。通过在整个治疗方案期间每天测量荧光素酶生物发光活性(如上所述)，并在治疗停止后的另外8天期间监测清除(wash
‑
out)期，确定治疗对荧光素酶报告基因表达的影响。通过在治疗前4天内以24小时间隔监测眼部荧光素酶活性来定义每只实验动物的基线发光。使用ivis livingimage软件量化相对re/le荧光素酶生物发光活性，并绘制为平均值
±
标准偏差。
[0274]
统计分析
[0275]
除非另有说明，数据表示为平均值
±
标准偏差，并代表至少3次独立测量结果。统
计显著性通过以下来分析评估：单向或双向方差分析(anova)，然后在95％置信水平下进行tukey的hsd事后检验。对于体外双荧光素酶测定，对每个制剂分别进行双尾学生t检验以分析敲低水平(siluc与nsc4对照)。对于体内荧光素酶实验，通过将治疗开始前的前4天的所有七只小鼠的平均右/左比率(设置为基线)与随后日期测量的r/l比率进行比较来进行统计分析。使用graphpad prism软件(graphpad software，美国)进行统计分析。
[0276]
结果
[0277]
硅基sirna递送系统的特征
[0278]
本发明的硅纳米颗粒递送系统的两种变体(sis005
‑
ps91g和sis005
‑
dsc613g)通过用核酸递送中常用的阳离子脂质、硬脂胺和dc
‑
胆固醇对硅的表面官能化来配制，这导致混合颗粒具有相似的大约350nm的流体动力学尺寸和比较正的zeta电位值。通过凝胶电泳研究的阳离子硅纳米颗粒制剂与sirna的复合显示核酸完全捕获，最小sinp
‑
sirna的w/w比率为2:1。不同w/w比率下的复合sirna的百分比通过分光光度法来测定，并通过添加到载体的sirna量与颗粒分离后溶液中的sirna浓度的差来计算。与用硬脂胺官能化的颗粒相比，与含有阳离子胆固醇衍生物的纳米颗粒复合时观察到更高的sirna捕获效率。然而，两种变体均显示每1mg硅纳米颗粒13
‑
48nmol sirna的加载容量。在上述sirna加载研究之后，所有进一步的实验都选择固定的sinp/sirna比率2:1。
[0279]
由于纳米颗粒的理化性质在药物的递送中起重要作用，所以确定加载sirna的复合物的粒径和表面电荷。在将空的与加载的载体相比时，sis005
‑
dsc613g在尺寸和zeta电位方面未示出显著差异，而sis005
‑
ps91g在与sirna复合时显示增加的平均粒径和负表面电荷，表明除了内部sirna捕获外，在杂化颗粒的表面吸收核酸分子(见下表)。此研究中考虑的制剂与基因沉默的黄金标准lipofectamine
tm rnaimax(市售的基于脂质的载体，专为sirna递送而设计)进行比较。空的和加载sirna的rnaimax的zetasizer分析还显示，在与核酸复合后，粒径增加，且表面电荷从正值反转为负值。
[0280]
示出颗粒性质的表征的表
[0281][0282]
测量在不含核酸酶的水中进行。数据代表平均值
±
标准偏差(n＝3)。
[0283]
体外sirna递送至角膜细胞的评估
[0284]
对于初始体外筛选，人角膜上皮细胞系(hce
‑
s)用于评估本发明的硅纳米颗粒递送系统在细胞转染中的效力，及其潜在细胞毒性。通过在用加载到载体系统的荧光寡核苷酸双链体处理后24小时进行的流式细胞术分析来量化转染效率，参见图8。sis005
‑
dsc613g显示55
±
2％且sis005
‑
ps91g显示65
±
6％的fam阳性细胞，相比之下，对于rnaimax试剂，观察到84
±
1％。
[0285]
基于碘化丙啶(pi)的活/死染色(膜崩解的常见指标)评估转染后细胞活力。这表明，与lipofectamine相比，硅纳米颗粒制剂对角膜上皮细胞具有良好的耐受性，参见图9。尽管lipofectamine在体外将外源核酸递送到细胞中非常有效，但其不适合临床应用。超过50％的用lipofectamine rnaimax转染的细胞显示出具有受损的膜和内化的膜，其不渗透pi染料，而在用硅纳米颗粒制剂处理后观察到超过86％和98％的完整细胞。
[0286]
在使用双荧光素酶报告基因检测的基因表达研究中评估sirna的生物利用度。用与硅基递送系统复合的0.1μm siluc处理hce
‑
s细胞后，对于sis005
‑
ps91g和sis005
‑
dcs613g分别实现46
±
5％(p<0.01，siluc与nsc4对照)和38
±
8％(p<0.01)的敲低，而用rnaimax转染的siluc将荧光素酶报告基因表达降低66
±
9％(p<0.001)。参见图10。因此，硅纳米颗粒递送系统证明高达70％的商售sirna转染试剂的效力，同时安全且细胞耐受良好。
[0287]
通过局部硅纳米颗粒制剂评估体内眼部sirna递送
[0288]
在证明体外成功sirna递送和基因敲低后，在体内评估两种硅纳米颗粒制剂(sis005
‑
ps91g和sis005
‑
dcs613g)用于前眼局部施用。首先，sis005
‑
ps91g和sis005
‑
dcs613g与荧光siglo复合，并根据单侧程序作为滴眼液施用到野生型小鼠，其中裸siglo对照被滴入另一只眼睛。使用体内成像系统监测眼部荧光长达24小时。第一次测量是在小鼠在治疗后仍处于麻醉状态下的施用后15分钟进行，并在施用后3、6和24小时重复随后的测量。尽管将等量siglo局部施用于每只眼睛，在15分钟后对于用sis005
‑
dsc613g的处理观察到最高荧光强度，sis005
‑
ps91g略低，而裸siglo低至1/2(p<0.05)，参见图11。这表明与裸寡核苷酸相比，对于两种硅纳米颗粒制剂，配制药物的眼部表面粘附增加并且停留时间增加。三小时后，体内荧光信号在siglo
‑
sis005
‑
dsc613g处理的眼睛中降低到1/3，而对于siglo
‑
sis005
‑
ps91g和未配制的siglo滴眼液，由于主动眼部清除机制，体内荧光信号已恢复到基线水平。尽管观察到体内信号强度的进一步逐渐降低，但在所有时间点，用siglo
‑
sis005
‑
dsc613g处理的眼睛中的荧光持续长达24小时，并且显著高于用未配制的裸siglo处理的眼睛(在3小时和6小时，p<0.01，在24小时，p<0.05)。这表明有效吸收局部施用的用本发明的硅纳米颗粒配制的sirna药物。为了验证纳米颗粒渗透到组织中，通过治疗后角膜切片的荧光显微镜研究sirna在整个角膜层的分布。在滴眼液施用后3小时收集的眼睛的所有prosilic处理切片中的所有角膜层中都检测到红色siglo荧光，而在裸siglo对照中没有观察到超过背景的荧光。sirna制剂施用24小时后，仅在用sis005
‑
dsc613g处理的角膜切片中观察到荧光。
[0289]
在体内摄取研究之后，在功能测定中进一步研究使用sis005
‑
dsc613g的sirna递送，使用荧光素酶表达排他地局限于角膜上皮的小鼠报告基因模型。在体内治疗之前，每24小时对报告基因小鼠中的基底角膜荧光素酶活性进行量化，持续4天，以确认分体对照实验的一致的右左比。将与siluc或对照sirna复合的sis005
‑
dsc613g，以滴眼剂的形式、以日间隔局部施用到相同动物的对侧眼睛8次，并且在整个治疗方案中和之后的8天每天通过活体动物成像评估角膜荧光素酶表达。在治疗开始后24小时内观察到荧光素酶表达降低，在第11天达到最大抑制(41％
±
13，p<0.001)。显著的基因沉默效应在整个治疗方案中持续，并在治疗结束后持续4天。正如预期的那样，在停止治疗后，降低的眼部生物发光水平逐渐恢复到基线，这表明已从基因抑制成功恢复。这些结果请参见图12和13。重要的是，局部治疗后对治疗眼睛的粗检和动物的日常目视检查揭示滴眼液没有副作用，这表明硅纳米颗粒制
剂在体内具有良好耐受性。