一种基于核酸适配体的荧光分子探针检测汞离子的方法与流程

1.本发明属于重金属离子的检测技术领域，具体涉及一种基于核酸适配体的荧光分子探针检测汞离子的方法。


背景技术：

2.汞是一种典型的重金属污染物，其因具有毒性高、污染持续性强、在环境中具有生物累积性等特点而受到全世界的广泛关注。作为无机汞中最稳定的形态，二价汞离子（hg
2
）即使浓度较低，也会造成严重的人体健康问题。环境、水以及食品中汞离子通过血液循环累积在体内，当hg
2
的浓度达到0.025 mmol/l时，会对人体内许多器官如心脏、肾脏、脑、胃和肠道具有不同程度的损伤。所以，进行hg
2
的有效监测对人类健康和生态系统稳定具有十分重要的意义。传统hg
2
的检测方法有原子荧光光谱、气相色谱
‑
质谱、电化学法、分光光度法和电感耦合等离子质谱等方法。但这些方法往往存在仪器昂贵、分析周期长、样品预处理复杂、检测费用昂贵等问题，越来越不适应汞离子检测的方便、快捷、高灵敏度等方面的要求。因此，急需开发建立一种快速、痕量、高灵敏度和特异性的检测汞离子方法。


技术实现要素：

3.本发明针对目前检测汞离子方法存在的不足，提供了一种基于核酸适配体的荧光分子探针检测汞离子的方法。本发明检测方法能够实现对水溶液中汞离子的特异性检测，且具有线性检测范围宽、检测限低、方便、快捷的优势，在食品、医疗和环境领域具有广泛的应用前景。
4.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种基于核酸适配体的荧光分子探针检测汞离子的方法，所述是以聚丙烯酸修饰的上转换纳米粒子为能量供体，以荧光染料cy5为能量受体；所述方法具体包括以下步骤：s1：聚丙烯酸修饰上转换纳米粒子的制备：先以稀土氯化物、油酸、1
‑
十八烯、氟化铵和氢氧化钠为原料通过高温热分解法制备油酸修饰上转换纳米粒子，再利用表面配体交换反应制备聚丙烯酸修饰上转换纳米粒子；s2：核酸适配体荧光分子探针的制备：采用酰胺化反应，在聚丙烯酸修饰上转换纳米粒子的表面连接核酸适配体，制备核酸适配体荧光分子探针；s3：“荧光强度
‑
汞离子浓度”标准工作曲线的绘制，线性工作方程的建立：将不同浓度的汞离子水溶液加入到步骤s2的核酸适配体荧光分子探针中，制备检测溶液；在980 nm激光作用下，检测不同汞离子浓度检测溶液的荧光强度，绘制“荧光强度
‑
汞离子浓度”标准工作曲线，建立线性工作方程。
5.上述一种基于核酸适配体的荧光分子探针检测汞离子的方法中，所述步骤s1具体如下：
①ꢀ
将1 mmol稀土氯化物加入到3~9 ml油酸和10~20 ml 1
‑
十八烯的混合液中，在氩气保护下，于90~130 ℃下磁力搅拌10~30 min，随后升温至140~180 ℃继续磁力搅拌20~40 min，以制备稀土氯化物、油酸和1
‑
十八烯的混合液；在磁力搅拌下，将上述稀土氯化物、油酸和1
‑
十八烯的混合液自然冷却至室温，滴加5~15 ml溶有0.1~0.2 g氟化铵和0.05~0.2 g氢氧化钠的甲醇溶液，先升温至40~60 ℃磁力搅拌20~40 min，再升温至60~80 ℃磁力搅拌5~20 min，然后升温至100~120 ℃磁力搅拌5~20 min，最后升温至280~320 ℃磁力搅拌60~120 min；反应结束后，在磁力搅拌下，将反应混合液自然冷却至室温，经过离心、体积比为1:1~3:1的乙醇和环己烷混合液洗涤，制备油酸修饰上转换纳米粒子；
②ꢀ
将20~60 mg油酸修饰上转换纳米粒子加入到3~5 ml氯仿中，于室温下超声分散5~20 min，制备油酸修饰上转换纳米粒子氯仿分散液；将油酸修饰上转换纳米粒子氯仿分散液加入到5~20 ml溶有100~300 mg聚丙烯酸的乙醇分散液中，在室温下磁力搅拌12~20 h，经过离心、体积比为1:1~3:1的乙醇和去离子水混合液洗涤，制得聚丙烯酸修饰上转换纳米粒子。
6.所述步骤
①
中的稀土氯化物包含六水合氯化钇、六水合氯化镱和六水合氯化铒，其中钇、镱与铒元素的摩尔比为(60~80):(20~30):(1~3)。
7.上述一种基于核酸适配体的荧光分子探针检测汞离子的方法中，所述步骤s2具体如下：
①ꢀ
在超声作用下，先将5~10 mg聚丙烯酸修饰上转换纳米粒子分散在4~10 ml二甲基亚砜中，再向其中加入10~20 mg 1
‑
乙基
‑
(3二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和30~40 mg n
‑
羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐，最后加入0.04~0.08 ml溶有核酸适配体的pbs缓冲液，得到混合分散液；
②ꢀ
将步骤
ꢀ①ꢀ
的混合分散液在30~40 ℃下孵育12~24 h，产物经离心、pbs缓冲液洗涤后，在室温下超声分散于4 ml pbs缓冲液中，制备核酸适配体荧光分子探针。
8.所述步骤s2中的pbs缓冲液是先将8 g氯化钠、0.24 g磷酸二氢钾、1.44 g磷酸氢二钠和0.2 g氯化钾溶于800 ml去离子水，再用0.1 mol/l盐酸调节ph值至7.4，最后再加入200 ml去离子水，经过超声作用配制而成。
9.所述步骤s2中的核酸适配体的完整序列为5
’‑
cytosine
‑
cy5
‑
ttgtttgtcccctctttctta
‑
(ch2)6‑
nh2‑3’
；所述pbs缓冲液中的核酸适配体的浓度为0.1 mmol/l。
10.上述一种基于核酸适配体的荧光分子探针检测汞离子的方法中，所述步骤s3具体如下：
①ꢀ
将0.1 ml不同浓度的汞离子水溶液分别加入到0.1 ml核酸适配体荧光分子探针中，于室温下孵育40 min，制备检测溶液；
②ꢀ
在980 nm激光作用下，测试步骤
ꢀ①ꢀ
制备的检测溶液在654 nm处的荧光强度，以汞离子浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制“荧光强度
‑
汞离子浓度”标准工作曲线，建立线性工作方程。
11.优所述步骤s3中的汞离子水溶液的汞离子的浓度为0.1 nmol/l、0.5 nmol/l、1nmol/l、5 nmol/l、50 nmol/l、100 nmol/l和500 nmol/l。
12.上述方法在汞离子检测中的应用。
13.本发明的显著优点在于：（1）本发明以聚丙烯酸修饰上转换纳米粒子作为能量供体，以荧光染料cy5作为能量受体，构建荧光共振能量转移体系，不仅可以利用激光诱导上转换荧光发射具有检测背景低的优势，显著提高检测的灵敏度，而且检测过程中不需要分离，操作简便。
14.（2）本发明采用酰胺化反应，将含有荧光染料cy5的核酸适配体5
’‑
cytosine
‑
cy5
‑
ttgtttgtcccctctttctta
‑
(ch2)6‑
nh2‑3’
连接在上转换纳米粒子的表面，利用核酸适配体对汞离子的特异性识别，提高了检测汞离子的准确性和稳定性。
15.（3）本发明中，上转换纳米粒子和荧光染料cy5在核酸适配体的两端，避免使用互补链，简化了荧光分子探针的制备步骤，缩短了荧光分子探针的制备时间，降低了荧光分子探针的制备成本。
16.（4）本发明检测方法能够实现对水溶液中汞离子的特异性检测，且具有线性检测范围宽、检测限低、方便、快捷的优势，线性检测范围为0.1~500 nmol/l，线性相关系数为0.9508~0.9647，检测限为1.2575~1.2965 nmol/l，在食品、医疗和环境领域具有广泛的应用前景。
附图说明
17.图1为本发明基于核酸适配体的荧光分子探针检测汞离子的机理示意图。
18.图2为本发明实施例1制备的油酸修饰上转换纳米粒子、聚丙烯酸修饰上转换纳米粒子的红外光谱图。
19.图3为本发明实施例1制备的聚丙烯酸修饰上转换纳米粒子和核酸适配体荧光分子探针的紫外可见吸收光谱图。
20.图4为本发明实施例1制备的油酸修饰上转换纳米粒子的x
‑
射线衍射谱图。
21.图6为本发明实施例1制备的油酸修饰上转换纳米粒子的扫描电子显微镜照片。
22.图5为本发明实施例1制备的油酸修饰上转换纳米粒子的荧光发射谱图和荧光染料cy5的紫外可见吸收光谱图。
23.图7为本发明实施例1制备的核酸适配体荧光分子探针在不同汞离子浓度时的荧光发射谱图。
24.图8为本发明实施例1得到的“荧光强度
‑
汞离子浓度”标准工作曲线图。
25.图9为本发明实施例1制备的核酸适配体荧光分子探针的特异性检测结果图。
具体实施方式
26.为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
27.实施例1一种基于核酸适配体的荧光分子探针检测汞离子的方法，具体包括以下步骤：s1：聚丙烯酸修饰上转换纳米粒子的制备
①ꢀ
将1 mmol稀土氯化物加入到6 ml油酸和15 ml 1
‑
十八烯的混合液中，在氩气保护下，于110 ℃下磁力搅拌20 min，随后升温至160 ℃继续磁力搅拌30 min，以制备稀土氯化物、油酸和1
‑
十八烯的混合液；在磁力搅拌下，将稀土氯化物、油酸和1
‑
十八烯的混合
液自然冷却至室温，向其中滴加10 ml溶有0.15 g氟化铵和0.1 g氢氧化钠的甲醇溶液，先升温至50 ℃磁力搅拌30 min，再升温至70 ℃磁力搅拌10 min，然后升温至110 ℃磁力搅拌10 min，最后升温至300 ℃磁力搅拌90 min；反应结束后，在磁力搅拌下，将反应混合液自然冷却至室温，经过离心、体积比为2:1的乙醇和环己烷混合液洗涤，制备油酸修饰上转换纳米粒子；
②ꢀ
将40 mg油酸修饰上转换纳米粒子加入到4 ml氯仿中，于室温下超声分散10 min，制备油酸修饰上转换纳米粒子氯仿分散液；将油酸修饰上转换纳米粒子氯仿分散液加入到10 ml溶有200 mg聚丙烯酸的乙醇分散液中，在室温下磁力搅拌16 h，经过离心、体积比为2:1的乙醇和去离子水混合液洗涤，制得聚丙烯酸修饰上转换纳米粒子；所述稀土氯化物包含六水合氯化钇、六水合氯化镱和六水合氯化铒，其中钇、镱与铒元素的摩尔比为70:25:2。
28.s2：核酸适配体荧光分子探针的制备
①ꢀ
在超声作用下，先将8 mg聚丙烯酸修饰上转换纳米粒子分散在7 ml二甲基亚砜中，再加入15 mg 1
‑
乙基
‑
(3二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和35 mg n
‑
羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐，最后加入0.06 ml溶有核酸适配体的pbs缓冲液，得到混合分散液；
②ꢀ
将步骤
①
的混合分散液在35 ℃下孵育18 h，产物经离心、pbs缓冲液洗涤后，在室温下超声分散于4 ml pbs缓冲液中，制备核酸适配体荧光分子探针。
29.所述pbs缓冲液是先将8 g氯化钠、0.24 g磷酸二氢钾、1.44 g磷酸氢二钠和0.2 g氯化钾溶于800 ml去离子水，再用0.1 mol/l盐酸调节ph值至7.4，最后再加入200 ml去离子水，经过超声作用配制而成。
30.所述核酸适配体的序列为：5
’‑
cytosine
‑
cy5
‑
ttgtttgtcccctctttctta
‑
(ch2)6‑
nh2‑3’
；所述pbs缓冲液中的核酸适配体的浓度为0.1 mmol/l。
31.s3：“荧光强度
‑
汞离子浓度”标准工作曲线的绘制，线性工作方程的建立
①ꢀ
将0.1 ml不同浓度的汞离子水溶液分别加入到0.1 ml核酸适配体荧光分子探针中，于室温下孵育40 min，制备检测溶液；
②ꢀ
在980 nm激光作用下，测试步骤
ꢀ①ꢀ
制备的检测溶液在654 nm处的荧光强度，以汞离子浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制“荧光强度
‑
汞离子浓度”标准工作曲线，建立线性工作方程。
32.所述汞离子水溶液中的汞离子的浓度为0.1 nmol/l、0.5 nmol/l、1nmol/l、5 nmol/l、50 nmol/l、100 nmol/l和500 nmol/l。
33.图1为本发明基于核酸适配体的荧光分子探针检测汞离子的机理示意图。如图1所示，本发明荧光分子探针是以上转换纳米粒子作为能量供体，荧光染料cy5作为能量受体，上转换纳米粒子和荧光染料之间通过核酸适配体连接。如图1（左）所示，当溶液中没有加入汞离子时，在980 nm光激发下，上转换纳米粒子在波长为540 nm和654 nm处各有一个发射峰。如图1（右）所示，当溶液中加入汞离子后，汞离子与核酸适配体之间发生特异性结合，核酸适配体折叠形成发夹状结构，导致上转换纳米粒子与荧光染料cy5之间的距离变短。此时，上转换纳米粒子和荧光染料cy5之间发生荧光能量共振转移，导致上转换纳米粒子在波长为654 nm的荧光被淬灭，并且这种荧光被淬灭的程度与加入的汞离子浓度之间成线性关
系，从而达到对汞离子定量检测的目的。
34.图2为本实施例制备的油酸修饰上转换纳米粒子和聚丙烯酸修饰上转换纳米粒子的红外光谱图。从油酸修饰上转换纳米粒子的红外光谱图中可以看出，波数为2928 cm
‑1和2857 cm
‑1处吸收峰分别对应长链烷基的亚甲基的非对称和对称伸缩振动，1563 cm
‑1和1467 cm
‑1分别为羧基的非对称和对称伸缩振动吸收峰，这些说明油酸成功修饰在上转换纳米粒子表面。从聚丙烯酸修饰上转换纳米粒子的红外光谱可以看出，在波数为1723 cm
‑1处观察到新的较强的羰基伸缩振动吸收峰，说明产物中羧基的含量增加，同时，亚甲基在波数为2928 cm
‑1和2857 cm
‑1处的伸缩振动吸收峰的强度减弱，这些都说明聚丙烯酸成功取代油酸修饰在上转换纳米粒子的表面。
35.图3为本实施例制备的聚丙烯酸修饰上转换纳米粒子和核酸适配体荧光分子探针的紫外可见吸收光谱图。由图可知，聚丙烯酸修饰上转换纳米粒子在测试波长范围内没有显示明显的吸收峰，核酸适配体荧光分子探针在波长为260 nm和654 nm处分别出现了核酸适配体和荧光染料cy5的特征吸收峰，这表明核酸适配体成功修饰在上转换纳米粒子的表面。
36.图4为本实施例制备的油酸修饰上转换纳米粒子的x
‑
射线衍射谱图。从图中可以发现，本实施例制备的油酸修饰上转换纳米粒子的衍射峰和标准卡片jcpds no.28
‑
1192显示的衍射峰一致，这表明本实施例的油酸修饰上转换纳米粒子为六方相β
‑
nayf4。
37.图5为本实施例制备的油酸修饰上转换纳米粒子的扫描电子显微镜照片。从图中结果可以看出，油酸修饰上转换纳米粒子的尺寸均匀，粒径约为24.5 nm。
38.图6为本实施例油酸修饰上转换纳米粒子的荧光发射谱图和荧光染料cy5的紫外可见吸收光谱图。从图中可以看出，油酸修饰上转换纳米粒子在654 nm处的荧光发射峰与荧光染料cy5的紫外可见吸收峰重叠，符合荧光共振能量转移条件，因此，上转换纳米粒子在654 nm处的荧光会被荧光染料cy5猝灭。
39.图7为本实施例制备的核酸适配体荧光分子探针在汞离子浓度分别为0.1 nmol/l、0.5 nmol/l、1 nmol/l、5 nmol/l、50 nmol/l、100 nmol/l和500 nmol/l时的荧光发射谱图。由图可知，随着汞离子浓度增加，核酸适配体荧光分子探针的荧光发射峰的强度降低，当汞离子的浓度为500 nmol/ml时，核酸适配体荧光分子探针的荧光发射峰强度降至初始值的15%左右，这表明本发明制备的核酸适配体荧光分子探针可以用于痕量汞离子的高灵敏检测。
40.图8为本实施例得到的“荧光强度
‑
汞离子浓度”标准工作曲线图。从图中可以看出，汞离子浓度在0.1~500 nmol/l范围内，本实施例制备的核酸适配体荧光分子探针的荧光发射峰的强度和汞离子浓度之间呈良好的线性关系，线性工作方程为y=
‑
46944.1ln(x) 213167.7，线性相关系数为0.9647，检测限为1.2575 nmol/l。
41.图9为本实施例制备的核酸适配体荧光分子探针的特异性检测结果图。将浓度为10 mmol/l的钙离子（ca
2
）、钠离子（na

）、锰离子（mn
2
）、钾离子（k

）、铁离子（fe
3
）、铝离子（al
3
）、镁离子（mg
2
）、锌离子（zn
2
）等干扰离子和浓度为500 nmol/l的汞离子（hg
2
）分别加入到本实施例制备的核酸适配体荧光分子探针检测体系中，结果发现，干扰离子对核酸适配体荧光分子探针的荧光发射峰强度几乎没有影响，这说明本发明制备的核酸适配体荧光分子探针对汞离子具有高的特异性检测。
42.实施例2一种基于核酸适配体的荧光分子探针检测汞离子的方法，具体包括以下步骤：s1：聚丙烯酸修饰上转换纳米粒子的制备
①ꢀ
将1 mmol稀土氯化物加入到3 ml油酸和10 ml 1
‑
十八烯的混合液中，在氩气保护下，于90 ℃，磁力搅拌30 min，升温至140 ℃，继续磁力搅拌40 min，制备稀土氯化物、油酸和1
‑
十八烯的混合液；在磁力搅拌下，将稀土氯化物、油酸和1
‑
十八烯的混合液自然冷却至室温，滴加5 ml溶有0.1 g氟化铵和0.05 g氢氧化钠的甲醇溶液，先升温至40 ℃磁力搅拌40 min，再升温至60 ℃磁力搅拌20 min，然后升温至100 ℃磁力搅拌20 min，最后升温至280 ℃磁力搅拌120 min；反应结束后，在磁力搅拌下，将反应混合液自然冷却至室温，经过离心、体积比为1:1的乙醇和环己烷混合液洗涤，制备油酸修饰上转换纳米粒子；
②ꢀ
将20 mg油酸修饰上转换纳米粒子加入到3 ml氯仿中，于室温下超声分散5 min，制备油酸修饰上转换纳米粒子氯仿分散液；将油酸修饰上转换纳米粒子氯仿分散液加入到5 ml溶有100 mg聚丙烯酸的乙醇分散液中，在室温下磁力搅拌12 h，经过离心、体积比为1:1的乙醇和去离子水混合液洗涤，制得聚丙烯酸修饰上转换纳米粒子。
43.所述稀土氯化物包含六水合氯化钇、六水合氯化镱和六水合氯化铒，其中钇、镱与铒元素的摩尔比为60:20:1。
44.s2：核酸适配体荧光分子探针的制备
①ꢀ
在超声作用下，先将5 mg聚丙烯酸修饰上转换纳米粒子分散在4 ml二甲基亚砜中，再加入10 mg 1
‑
乙基
‑
(3二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和30 mg n
‑
羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐，最后加入0.04 ml溶有核酸适配体的pbs缓冲液，得到混合分散液；
②ꢀ
将步骤
ꢀ①ꢀ
的混合分散液在30 ℃下孵育24 h，产物经离心、pbs缓冲液洗涤后，在室温下超声分散于4 ml pbs缓冲液中，制备核酸适配体荧光分子探针。
45.所述pbs缓冲液是先将8 g氯化钠、0.24 g磷酸二氢钾、1.44 g磷酸氢二钠和0.2 g氯化钾溶于800 ml去离子水，再用0.1 mol/l盐酸调节ph值至7.4，最后再加入200 ml去离子水，经过超声作用配制而成。
46.所述核酸适配体的序列为：5
’‑
cytosine
‑
cy5
‑
ttgtttgtcccctctttctta
‑
(ch2)6‑
nh2‑3’
；所述pbs缓冲液中的核酸适配体的浓度为0.1 mmol/l。
47.s3：“荧光强度
‑
汞离子浓度”标准工作曲线的绘制，线性工作方程的建立
①ꢀ
将0.1 ml不同浓度的汞离子水溶液分别加入到0.1 ml核酸适配体荧光分子探针中，于室温下孵育40 min，制备检测溶液；
②ꢀ
在980 nm激光作用下，测试步骤
ꢀ①ꢀ
制备的检测溶液在654 nm处的荧光强度，以汞离子浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制“荧光强度
‑
汞离子浓度”标准工作曲线，建立线性工作方程。
48.所述汞离子水溶液中的汞离子的浓度为0.1 nmol/l、0.5 nmol/l、1nmol/l、5 nmol/l、50 nmol/l、100 nmol/l和500 nmol/l。
49.本实施例制备的核酸适配体荧光分子探针的荧光发射峰的强度和汞离子浓度之间呈良好的线性关系，线性工作方程为y=
‑
45980.1ln(x) 205257.5，线性相关系数为0.9543，检测限为1.2839 nmol/l。
50.实施例3一种基于核酸适配体的荧光分子探针检测汞离子的方法，具体包括以下步骤：s1：聚丙烯酸修饰上转换纳米粒子的制备
①ꢀ
将1 mmol稀土氯化物加入到9 ml油酸和20 ml 1
‑
十八烯的混合液中，在氩气保护下，于130 ℃，磁力搅拌10 min，升温至180 ℃，继续磁力搅拌20 min，以制备稀土氯化物、油酸和1
‑
十八烯的混合液；在磁力搅拌下，将稀土氯化物、油酸和1
‑
十八烯的混合液自然冷却至室温，滴加15 ml溶有0.2 g氟化铵和0.2 g氢氧化钠的甲醇溶液，先升温至60 ℃磁力搅拌20 min，再升温至80 ℃磁力搅拌5 min，然后升温至120 ℃磁力搅拌5 min，最后升温至320 ℃磁力搅拌60 min；反应结束后，在磁力搅拌下，将反应混合液自然冷却至室温，经过离心、体积比为3:1的乙醇和环己烷混合液洗涤，制备油酸修饰上转换纳米粒子；
②ꢀ
将60 mg油酸修饰上转换纳米粒子加入到5 ml氯仿中，于室温下超声分散20 min，制备油酸修饰上转换纳米粒子氯仿分散液；将油酸修饰上转换纳米粒子氯仿分散液加入到20 ml溶有300 mg聚丙烯酸的乙醇分散液中，在室温下磁力搅拌20 h，经过离心、体积比为3:1的乙醇和去离子水混合液洗涤，制得聚丙烯酸修饰上转换纳米粒子。
51.所述稀土氯化物包含六水合氯化钇、六水合氯化镱和六水合氯化铒，其中钇、镱与铒元素的摩尔比为80:30:3。
52.s2：核酸适配体荧光分子探针的制备
①ꢀ
在超声作用下，先将10 mg聚丙烯酸修饰上转换纳米粒子分散在10 ml二甲基亚砜中，再加入20 mg 1
‑
乙基
‑
(3二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和40 mg n
‑
羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐，最后加入0.08 ml溶有核酸适配体的pbs缓冲液，得到混合分散液；
②ꢀ
将步骤
ꢀ①ꢀ
的混合分散液在40 ℃下孵育12 h，产物经离心、pbs缓冲液洗涤后，在室温下超声分散于4 ml pbs缓冲液中，制备核酸适配体荧光分子探针。
53.所述pbs缓冲液是先将8 g氯化钠、0.24 g磷酸二氢钾、1.44 g磷酸氢二钠和0.2 g氯化钾溶于800 ml去离子水，再用0.1 mol/l盐酸调节ph值至7.4，最后再加入200 ml去离子水，经过超声作用配制而成。
54.所述核酸适配体的完整序列为：5
’‑
cytosine
‑
cy5
‑
ttgtttgtcccctctttctta
‑
(ch2)6‑
nh2‑3’
；所述pbs缓冲液中的核酸适配体的浓度为0.1 mmol/l。
55.s3：“荧光强度
‑
汞离子浓度”标准工作曲线的绘制，线性工作方程的建立
①ꢀ
将0.1 ml不同浓度的汞离子水溶液分别加入到0.1 ml核酸适配体荧光分子探针中，于室温下孵育40 min，制备检测溶液；
②ꢀ
在980 nm激光作用下，测试步骤
ꢀ①ꢀ
制备的检测溶液在654 nm处的荧光强度，以汞离子浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制“荧光强度
‑
汞离子浓度”标准工作曲线，建立线性工作方程。
56.所述汞离子水溶液中的汞离子的浓度为0.1 nmol/l、0.5 nmol/l、1nmol/l、5 nmol/l、50 nmol/l、100 nmol/l和500 nmol/l。
57.本实施例制备的核酸适配体荧光分子探针的荧光发射峰的强度和汞离子浓度之间呈良好的线性关系，线性工作方程为y=
‑
45530.5ln(x) 201105.3，线性相关系数为0.9508，检测限为1.2965 nmol/l。
58.以上所述，仅为本发明的说明实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下，做出的若干改进和补充也应视为本发明的保护范围；凡熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明精神和范围的情况下，利用以上所揭示的技术内容做出的些许更改、修饰与演变的等同变化,均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所做的任何等同变化的更改、修饰与演变,均仍属于本发明的保护范围。