一种BCR-ABL基因融合检测的校准品和参考品的制备方法及其应用与流程

技术特征：
1.一种bcr
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abl基因融合检测的校准品和参考品的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：分别制备abl野生型装甲rna和bcr
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abl融合型装甲rna；使用保护稀释液分别对所述abl野生型装甲rna和bcr
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abl融合型装甲rna进行溶解；通过数字pcr对所述abl野生型装甲rna和bcr
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abl融合型装甲rna的浓度进行检测；使用保护稀释液对所述abl野生型装甲rna和bcr
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abl融合型装甲rna进行梯度稀释，得到校准品；将abl野生型装甲rna校准品和bcr
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abl融合型装甲rna校准品按比例混合，得到参考品。2.根据权利要求1所述的bcr
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abl基因融合检测的校准品和参考品的制备方法，其特征在于，编码所述abl野生型装甲rna的核苷酸序列如seq id no.1所示；优选地，编码所述bcr
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abl融合型装甲rna的核苷酸序列如seq id no.2所示；优选地，所述溶解前还包括将所述abl野生型装甲rna和bcr
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abl融合型装甲rna在85～95℃下水浴裂解4～8min的步骤；优选地，所述保护稀释液包括tris
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edta缓冲液、保护核酸和保护剂；优选地，所述tris
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edta缓冲液的ph为7.0～8.5；优选地，所述保护核酸包括载体rna和/或鲑鱼精dna；优选地，所述保护核酸的终浓度为10～60ng/μl；优选地，所述保护剂包括triton x
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100和/或tween20；优选地，所述triton x
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100的终浓度为0.005％～0.05％；优选地，所述tween20的终浓度为0.05％～0.5％。3.根据权利要求1或2所述的bcr
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abl基因融合检测的校准品和参考品的制备方法，其特征在于，所述数字pcr的反应体系包括引物对、荧光探针和预混液；优选地，所述引物对在所述反应体系中的终浓度为600～1200nm，所述荧光探针在所述反应体系中的终浓度为80～400nm；优选地，扩增所述abl野生型装甲rna的引物对的序列如seq id no.3～4所示，检测所述abl野生型装甲rna的荧光探针的序列如seq id no.5所示；优选地，扩增所述bcr
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abl融合型装甲rna的引物对的序列如seq id no.6～7所示，检测所述bcr
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abl融合型装甲rna的荧光探针的序列如seq id no.8所示；优选地，所述荧光探针的5’端标记有荧光发生基团，3’端标记有荧光淬灭基团；优选地，所述荧光发生基团包括fam、hex、vic、tamra、rox、cy3或cy5中的任意一种；优选地，所述荧光淬灭基团包括mgb、bhq1、bhq2或bhq3中的任意一种；优选地，所述预混液包括缓冲液、反转录酶、dna聚合酶和dntps；优选地，所述数字pcr的反应程序包括：反转录：40～60℃，13～16min；预变性：94～98℃，8～12min；循环扩增：94～98℃，10～30s；50～60℃，20～60s；循环40～50次。4.根据权利要求1～3任一项所述的bcr
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abl基因融合检测的校准品和参考品的制备方法，其特征在于，所述梯度稀释后，abl野生型装甲rna校准品和bcr
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abl融合型装甲rna校准品的终浓度依次为(1～5)
×
105拷贝/μl、(1～5)
×
104拷贝/μl、(1～5)
×
103拷贝/μl、(1～
5)
×
102拷贝/μl、(1～5)
×
101拷贝/μl和1～5拷贝/μl；优选地，所述参考品中，abl野生型装甲rna校准品和bcr
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abl融合型装甲rna校准品的浓度比例依次为10:1、100:1、1000:1和10000:1。5.根据权利要求1～4任一项所述的bcr
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abl基因融合检测的校准品和参考品的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：(1)装甲rna的制备：分别制备abl野生型装甲rna和bcr
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abl融合型装甲rna，其中，编码所述abl野生型装甲rna的核苷酸序列如seq id no.1所示，编码所述bcr
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abl融合型装甲rna的核苷酸序列如seq id no.2所示；(2)溶解：将所述abl野生型装甲rna和bcr
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abl融合型装甲rna在85～95℃下水浴裂解4～8min，随后使用保护稀释液分别进行溶解；其中，保护稀释液包括ph为7～8.5的tris
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edta缓冲液、终浓度为10～60ng/μl的载体rna和/或鲑鱼精dna以及0.005％～0.05％的triton x
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100和/或0.05％～0.5％的tween20；(3)浓度检测：通过数字pcr对所述abl野生型装甲rna和bcr
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abl融合型装甲rna的浓度进行检测：所述数字pcr的反应体系包括终浓度为600～1200nm的引物对、80～400nm的荧光探针和预混液；扩增所述abl野生型装甲rna的引物对的序列如seq id no.3～4所示，检测所述abl野生型装甲rna的荧光探针的序列如seq id no.5所示；扩增所述bcr
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abl融合型装甲rna的引物对的序列如seq id no.6～7所示，检测所述bcr
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abl融合型装甲rna的荧光探针的序列如seq id no.8所示；所述预混液包括缓冲液、反转录酶、dna聚合酶和dntps；所述数字pcr的反应程序包括：反转录：40～60℃，13～16min；预变性：94～98℃，8～12min；循环扩增：94～98℃，10～30s；50～60℃，20～60s；循环40～50次；(4)制备校准品和参考品：使用保护稀释液对所述abl野生型装甲rna和bcr
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abl融合型装甲rna进行梯度稀释，至终浓度依次为(1～5)
×
105拷贝/μl、(1～5)
×
104拷贝/μl、(1～5)
×
103拷贝/μl、(1～5)
×
102拷贝/μl、(1～5)
×
101拷贝/μl和1～5拷贝/μl，得到校准品；将abl野生型装甲rna校准品和bcr
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abl融合型装甲rna校准品按浓度比例依次为10:1、100:1、1000:1和10000:1混合，得到参考品。6.一种bcr
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abl基因融合检测的校准品和参考品，其特征在于，所述校准品和参考品通过权利要求1～5任一项所述的bcr
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abl基因融合检测的校准品和参考品的制备方法制备得到。7.一种检测权利要求6所述的bcr
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abl基因融合检测的校准品和参考品准确性的方法，其特征在于，所述方法包括：
对校准品、参考品和who一级标准品进行扩增，构建校准品的循环数与拷贝数的标准曲线，再建立who一级标准品的实际检测值与理论值的线性关系曲线，再建立参考品的实际检测值与理论值的线性关系曲线，根据曲线参数对准确性进行判断。8.根据权利要求7所述的检测所述bcr
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abl基因融合检测的校准品和参考品准确性的方法，其特征在于，所述扩增的反应体系包括引物对、荧光探针、pcr缓冲液、反转录缓冲液、反转录酶、dna聚合酶、rna酶抑制剂和dntps；优选地，所述引物对的终浓度为200～1000nm，所述荧光探针的终浓度为100～500nm；优选地，所述反转录酶的终浓度为0.1～3u/μl；优选地，所述dna聚合酶的终浓度为0.05～0.2u/μl；优选地，所述rna酶抑制剂的终浓度为0.1～1u/μl；优选地，所述dntps的终浓度为100～500μm；优选地，所述扩增的反应程序与数字pcr的反应程序相同。9.根据权利要求7或8所述的检测所述bcr
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abl基因融合检测的校准品和参考品准确性的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)对校准品、参考品和who一级标准品进行扩增，所述扩增的反应体系包括终浓度为200～1000nm的引物对、100～500nm的荧光探针、pcr缓冲液、反转录缓冲液、0.1～3u/μl的反转录酶、0.05～0.2u/μl的dna聚合酶、0.1～1u/μl的rna酶抑制剂和100～500μm的dntps，所述扩增的反应程序与数字pcr的反应程序相同；(2)构建校准品的循环数与拷贝数的标准曲线，再建立who一级标准品的实际检测值与理论值的线性关系曲线，再建立参考品的实际检测值与理论值的线性关系曲线，根据曲线参数对准确性进行判断。10.权利要求1～5任一项所述的bcr
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abl基因融合检测的校准品和参考品的制备方法和/或权利要求7～9任一项所述的检测所述bcr
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abl基因融合检测的校准品和参考品准确性的方法在制备bcr
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abl基因融合检测的校准品和参考品中的应用。

技术总结
本发明提供了一种BCR


技术研发人员：程雪涛 王洁 张亚飞
受保护的技术使用者：迈杰转化医学研究（苏州）有限公司
技术研发日：2021.08.20
技术公布日：2021/11/21