一种BCR-ABL基因融合检测的校准品和参考品的制备方法及其应用与流程

一种bcr
‑
abl基因融合检测的校准品和参考品的制备方法及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种bcr
‑
abl基因融合检测的校准品和参考品的制备方法及其应用。


背景技术：

2.慢性髓系白血病(cml)是一种以中晚幼粒细胞恶性增殖为特征的疾病，约90％～95％的cml患者中可检测到bcr
‑
abl融合基因(即9号染色体上的abl基因易位到22号染色体上的bcr基因上形成融合基因)，可用于cml的分型诊断、疗效评价，以及作为微小残留病的检测和预后评估的可靠指标。
3.目前，临床常用检测方法包括常规染色体分析、荧光原位杂交(fish)和荧光定量pcr。nccn指南推荐cml患者达到ccyr(完全细胞学缓解)后应该每三个月进行一次bcr
‑
abl荧光定量pcr检测，用来监测残留白血病细胞有否上升、下降或处于稳定状态。
4.目前，bcr
‑
abl荧光定量pcr检测已国际标准化，考虑到实验的不同条件(如不同的参考基因、pcr引物、提取方法及荧光定量pcr体系、反转录体系等)的差异，各实验室的检测结果需和who一级标准品进行比对，并建立转换系数(cf)，从而将bcr
‑
abl的定量结果转换成国际标准值(is)。
5.然而，who一级标准品货期漫长，手续繁多，且经过提取后获得的rna量很少，不能满足企业的研发、验证及质检的需求。此外，现有技术往往不能与who一级参考品进行溯源，定量结果缺乏可靠性；或即使能溯源，但和理论值差异较大；或不同的参考品制备批次间存在较大的批间差异，不能保持良好的一致性。
6.因此，如何提供一种容易获取的校准品及参考品，可以用于试剂的研发、验证及质检中，已成为亟待解决的问题。


技术实现要素：

7.针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种bcr
‑
abl基因融合检测的校准品和参考品的制备方法及其应用，制备得到的校准品和参考品具有良好的扩增效率，批间差异小，可以与who一级标准品进行很好的溯源，校正系数十分接近1.0(即检测值等同于理论值)，应用价值极高。
8.为达此目的，本发明采用如下技术方案：
9.第一方面，本发明提供了一种bcr
‑
abl基因融合检测的校准品和参考品的制备方法，所述制备方法包括：
10.分别制备abl野生型装甲rna和bcr
‑
abl融合型装甲rna；
11.使用保护稀释液分别对所述abl野生型装甲rna和bcr
‑
abl融合型装甲rna进行溶解；
12.通过数字pcr对所述abl野生型装甲rna和bcr
‑
abl融合型装甲rna的浓度进行检
测；
13.使用保护稀释液对所述abl野生型装甲rna和bcr
‑
abl融合型装甲rna进行梯度稀释，得到校准品；将abl野生型装甲rna校准品和bcr
‑
abl融合型装甲rna校准品按比例混合，得到参考品。
14.本发明中，选用装甲rna用于制备校准品及参考品，可以与who一级标准品在核酸层面保持一致；加入保护稀释液，可以提高并稳定反应的扩增效率，减少或消除批间差异；选用数字pcr进行检测，对于装甲rna的定量检测更准确；制备得到的校准品和参考品能够与who一级标准品进行很好的溯源，校正系数十分接近1.0。
15.优选地，编码所述abl野生型装甲rna的核苷酸序列如seq id no.1所示。
16.seq id no.1：
17.caaaccaaaaatggccaaggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgctgagcagcgggatcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctggccagaggtccatctcgctgagatacgaagggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcctccgagagccgcttcaacaccctggccgagttggttcatcatcattcaacggtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaagcccactgtctatggtgtgtcccctaactacgacaagt。
18.优选地，编码所述bcr
‑
abl融合型装甲rna的核苷酸序列如seq id no.2所示。
19.seq id no.2：
20.tacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcagagtggagggagaacatccgggagcagcagaagaagtgtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgcagatgctgaccaactcgtgtgtgaaactccagactgtccacagcattccgctgaccatcaataaggaagatgatgagtctccggggctctatgggtttctgaatgtcatcgtccactcagccactggatttaagcagagttcaaaagcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaagctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcc。
21.优选地，所述溶解前还包括将所述abl野生型装甲rna和bcr
‑
abl融合型装甲rna在85～95℃下水浴裂解4～8min的步骤，温度例如可以是85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃或95℃等，时间例如可以是4min、4.5min、5min、5.5min、6min、6.5min、7min、7.5min或8min等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
22.优选地，所述保护稀释液包括tris
‑
edta缓冲液、保护核酸和保护剂。
23.优选地，所述tris
‑
edta缓冲液的ph为7.0～8.5，例如可以是7.0、7.5、8.0或8.5等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
24.优选地，所述保护核酸包括载体rna(carrier rna)和/或鲑鱼精dna。
25.优选地，所述保护核酸的终浓度为10～60ng/μl，例如可以是10ng/μl、15ng/μl、20ng/μl、25ng/μl、30ng/μl、35ng/μl、40ng/μl、45ng/μl、50ng/μl、55ng/μl或60ng/μl等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
26.优选地，所述保护剂包括triton x
‑
100和/或tween20。
27.优选地，所述triton x
‑
100的终浓度为0.005％～0.05％，例如可以是0.005％、
0.01％、0.02％、0.03％、0.04％或0.05％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
28.优选地，所述tween20的终浓度为0.05％～0.5％，例如可以是0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
29.本发明中，通过向缓冲液中添加保护核酸和保护剂，可以增强靶序列的稳定性，确保靶序列可以有效检出，减少批间差异，检测结果更加准确。
30.优选地，所述数字pcr的反应体系包括引物对、荧光探针和预混液。
31.优选地，所述引物对在所述反应体系中的终浓度为600～1200nm，例如可以是600nm、650nm、700nm、750nm、800nm、850nm、900nm、950nm、1000nm、1050nm、1100nm、1150nm或1200nm等，所述荧光探针在所述反应体系中的终浓度为80～400nm，例如可以是80nm、100nm、150nm、200nm、250nm、300nm、350nm或400nm等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
32.优选地，扩增所述abl野生型装甲rna的引物对的序列如seq id no.3～4所示，检测所述abl野生型装甲rna的荧光探针的序列如seq id no.5所示。
33.优选地，扩增所述bcr
‑
abl融合型装甲rna的引物对的序列如seq id no.6～7所示，检测所述bcr
‑
abl融合型装甲rna的荧光探针的序列如seq id no.8所示。
34.seq id no.3：ctacgtctcctccgagagccgcttcaaca；
35.seq id no.4：cccgtcggccaccgttgaatgatgatg；
36.seq id no.5：ccctggccgagttggtt；
37.seq id no.6：acgagcggcttcactcagaccctgaggctc；
38.seq id no.7：tccacagcattccgctgaccatcaataaggaag；
39.seq id no.8：aagcccttcagcggccagtagcatctgacttt。
40.优选地，所述荧光探针的5’端标记有荧光发生基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
41.优选地，所述荧光发生基团包括fam、hex、vic、tamra、rox、cy3或cy5中的任意一种。
42.优选地，所述荧光淬灭基团包括mgb、bhq1、bhq2或bhq3中的任意一种。
43.优选地，所述预混液包括缓冲液、反转录酶、dna聚合酶和dntps。
44.优选地，所述数字pcr的反应程序包括：
45.反转录：
46.40～60℃，13～16min，温度例如可以是40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或60℃等，时间例如可以是13min、13.5min、14min、14.5min、15min、15.5min或16min等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
47.预变性：
48.94～98℃，8～12min，温度例如可以是94℃、94.5℃、95℃、95.5℃、96℃、96.5℃、97℃、97.5℃或98℃等，时间例如可以是8min、8.5min、9min、9.5min、10min、10.5min、11min、11.5min或12min等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
49.循环扩增：
50.94～98℃，10～30s，温度例如可以是94℃、94.5℃、95℃、95.5℃、96℃、96.5℃、97℃、97.5℃或98℃等，时间例如可以是10s、11s、12s、13s、14s、15s、16s、17s、18s、19s、20s、21s、22s、23s、24s、25s、26s、27s、28s、29s或30s等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
51.50～60℃，20～60s，温度例如可以是50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或60℃等，时间例如可以是20s、25s、30s、35s、40s、45s、50s、55s或60s等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
52.循环40～50次，例如可以是40次、41次、42次、43次、44次、45次、46次、47次、48次、49次或50次。
53.优选地，所述梯度稀释后，abl野生型装甲rna校准品和bcr
‑
abl融合型装甲rna校准品的终浓度依次为(1～5)
×
105拷贝/μl，例如可以是1
×
105拷贝/μl、2
×
105拷贝/μl、3
×
105拷贝/μl、4
×
105拷贝/μl或5
×
105拷贝/μl等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述；
54.(1～5)
×
104拷贝/μl，例如可以是1
×
104拷贝/μl、2
×
104拷贝/μl、3
×
104拷贝/μl、4
×
104拷贝/μl或5
×
104拷贝/μl等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述；
55.(1～5)
×
103拷贝/μl，例如可以是1
×
103拷贝/μl、2
×
103拷贝/μl、3
×
103拷贝/μl、4
×
103拷贝/μl或5
×
103拷贝/μl等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述；
56.(1～5)
×
102拷贝/μl，例如可以是1
×
102拷贝/μl、2
×
102拷贝/μl、3
×
102拷贝/μl、4
×
102拷贝/μl或5
×
102拷贝/μl等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述；
57.(1～5)
×
101拷贝/μl，例如可以是1
×
101拷贝/μl、2
×
101拷贝/μl、3
×
101拷贝/μl、4
×
101拷贝/μl或5
×
101拷贝/μl等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述；
58.1～5拷贝/μl，例如可以是1拷贝/μl、2拷贝/μl、3拷贝/μl、4拷贝/μl或5拷贝/μl等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
59.优选地，所述参考品中，abl野生型装甲rna校准品和bcr
‑
abl融合型装甲rna校准品的浓度比例依次为10:1、100:1、1000:1和10000:1。
60.作为优选技术方案，本发明所述bcr
‑
abl基因融合检测的校准品和参考品的制备方法，包括以下步骤：
61.(1)装甲rna的制备：
62.分别制备abl野生型装甲rna和bcr
‑
abl融合型装甲rna，其中，编码所述abl野生型装甲rna的核苷酸序列如seq id no.1所示，编码所述bcr
‑
abl融合型装甲rna的核苷酸序列如seq id no.2所示；
63.(2)溶解：
64.将所述abl野生型装甲rna和bcr
‑
abl融合型装甲rna在85～95℃下水浴裂解4～8min，随后使用保护稀释液分别进行溶解；
65.其中，保护稀释液包括ph为7～8.5的tris
‑
edta缓冲液、终浓度为10～60ng/μl的
载体rna和/或鲑鱼精dna以及0.005％～0.05％的triton x
‑
100和/或0.05％～0.5％的tween20；
66.(3)浓度检测：
67.通过数字pcr对所述abl野生型装甲rna和bcr
‑
abl融合型装甲rna的浓度进行检测：
68.所述数字pcr的反应体系包括终浓度为600～1200nm的引物对、80～400nm的荧光探针和预混液；
69.扩增所述abl野生型装甲rna的引物对的序列如seq id no.3～4所示，检测所述abl野生型装甲rna的荧光探针的序列如seq id no.5所示；
70.扩增所述bcr
‑
abl融合型装甲rna的引物对的序列如seq id no.6～7所示，检测所述bcr
‑
abl融合型装甲rna的荧光探针的序列如seq id no.8所示；
71.所述预混液包括缓冲液、反转录酶、dna聚合酶和dntps；
72.所述数字pcr的反应程序包括：
73.反转录：40～60℃，13～16min；
74.预变性：94～98℃，8～12min；
75.循环扩增：94～98℃，10～30s；50～60℃，20～60s；循环40～50次；
76.(4)制备校准品和参考品：
77.使用保护稀释液对所述abl野生型装甲rna和bcr
‑
abl融合型装甲rna进行梯度稀释，至终浓度依次为(1～5)
×
105拷贝/μl、(1～5)
×
104拷贝/μl、(1～5)
×
103拷贝/μl、(1～5)
×
102拷贝/μl、(1～5)
×
101拷贝/μl和1～5拷贝/μl，得到校准品；
78.将abl野生型装甲rna校准品和bcr
‑
abl融合型装甲rna校准品按浓度比例依次为10:1、100:1、1000:1和10000:1混合，得到参考品。
79.第二方面，本发明提供了一种bcr
‑
abl基因融合检测的校准品和参考品，所述校准品和参考品通过第一方面所述的bcr
‑
abl基因融合检测的校准品和参考品的制备方法制备得到。
80.本发明中，通过上述方法制备得到的校准品和参考品与who一级标准品具有良好的溯源性，更容易制备与获取，可应用于相关的检测中，具有实际应用的价值。
81.第三方面，本发明提供了一种检测第二方面所述的bcr
‑
abl基因融合检测的校准品和参考品准确性的方法，包括：
82.对校准品、参考品和who一级标准品进行扩增，构建校准品的循环数与拷贝数的标准曲线，再建立who一级标准品的实际检测值与理论值的线性关系曲线，再建立参考品的实际检测值与理论值的线性关系曲线，根据曲线参数对准确性进行判断。
83.本发明中，根据校准品的标准曲线，以及who一级标准品的实际检测值与理论值的线性关系曲线的曲线参数，即可对校准品的准确性进行判断。若标准曲线的r2接近于1，扩增效率接近于100％；且线性关系曲线近似于y＝x，r2接近于1，则表明校准品准确性良好，可用于产品的相关检测中。
84.本发明中，根据参考品的实际检测值与理论值的线性关系曲线的曲线参数，即可对校准品的准确性进行判断。若线性关系曲线近似于y＝x，r2接近于1，则表明参考品准确性良好，可用于产品的相关检测中。
85.本发明中，所述实际检测值为bcr
‑
abl/abl百分比的对数值，理论值为bcr
‑
abl/abl百分比的对数值。
86.优选地，所述扩增的反应体系包括引物对、荧光探针、pcr缓冲液、反转录缓冲液、反转录酶、dna聚合酶、rna酶抑制剂和dntps。
87.优选地，所述引物对的终浓度为200～1000nm，例如可以是200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm或1000nm等，所述荧光探针的终浓度为100～500nm，例如可以是100nm、150nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、450nm或500nm等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
88.优选地，所述反转录酶的终浓度为0.1～3u/μl，例如可以是0.1u/μl、0.5u/μl、1u/μl、1.5u/μl、2u/μl、2.5u/μl或3u/μl等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
89.优选地，所述dna聚合酶的终浓度为0.05～0.2u/μl，例如可以是0.05u/μl、0.1u/μl、0.15u/μl或0.2u/μl等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
90.优选地，所述rna酶抑制剂的终浓度为0.1～1u/μl，例如可以是0.1u/μl、0.2u/μl、0.3u/μl、0.4u/μl、0.5u/μl、0.6u/μl、0.7u/μl、0.8u/μl、0.9u/μl或1u/μl等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
91.优选地，所述dntps的终浓度为100～500μm，例如可以是100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm或500μm等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
92.优选地，所述扩增的反应程序与数字pcr的反应程序相同。
93.作为优选技术方案，本发明所述检测所述bcr
‑
abl基因融合检测的校准品和参考品准确性的方法，包括以下步骤：
94.(1)对校准品、参考品和who一级标准品进行扩增，所述扩增的反应体系包括终浓度为200～1000nm的引物对、100～500nm的荧光探针、pcr缓冲液、反转录缓冲液、0.1～3u/μl的反转录酶、0.05～0.2u/μl的dna聚合酶、0.1～1u/μl的rna酶抑制剂和100～500μm的dntps，所述扩增的反应程序与数字pcr的反应程序相同；
95.(2)构建校准品的循环数与拷贝数的标准曲线，再建立who一级标准品的实际检测值与理论值的线性关系曲线，再建立参考品的实际检测值与理论值的线性关系曲线，根据曲线参数对准确性进行判断。
96.第四方面，本发明提供了第一方面所述的bcr
‑
abl基因融合检测的校准品和参考品的制备方法和/或第三方面所述的检测所述bcr
‑
abl基因融合检测的校准品和参考品准确性的方法在制备bcr
‑
abl基因融合检测的校准品和参考品中的应用。
97.相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
98.(1)本发明选用装甲rna用于制备校准品和参考品，可以与who一级标准品(rna)在核酸层面保持一致；通过加入保护稀释液，可以提高并稳定扩增反应过程中的扩增效率，实验的平行性与重复性更好，减少了批间差异，结果更加准确；
99.(2)在制备过程中通过数字pcr进行定量，对于装甲rna的原始拷贝数定量更准确，制备得到的校准品和参考品能够与who一级标准品进行很好的溯源，校正系数十分接近1.0，且获取容易，操作简单，为相关的检测反应提供了条件，具有极高的应用价值。
附图说明
100.图1a为abl野生型装甲rna校准品的标准曲线；
101.图1b为bcr
‑
abl融合型装甲rna校准品的标准曲线；
102.图2为who一级标准品的实际检测值与理论值的线性关系曲线；
103.图3为参考品的实际检测值与理论值的线性关系曲线；
104.图4为参考品溯源流程的示意图。
具体实施方式
105.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
106.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
107.材料：
108.预混液购自北京新羿生物科技有限公司；
109.pcr缓冲液、反转录缓冲液、反转录酶、dna聚合酶、rna酶抑制剂和dntps购自菲鹏生物股份有限公司；
110.who一级标准品(09/138)购自英国国家生物制品检定所(nibsc),经由qiagen rneasy mini kit提取后得到。
111.实施例1
112.本实施例提供一种bcr
‑
abl基因融合检测的校准品和参考品，所述bcr
‑
abl基因融合检测的校准品和参考品通过如下方法进行制备：
113.(1)装甲rna的制备：
114.装甲rna委托厦门致善生物科技股份有限公司合成。分别制备abl野生型装甲rna和bcr
‑
abl融合型装甲rna，其中，编码所述abl野生型装甲rna的核苷酸序列如seq id no.1所示，编码所述bcr
‑
abl融合型装甲rna的核苷酸序列如seq id no.2所示。
115.seq id no.1：
116.caaaccaaaaatggccaaggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgctgagcagcgggatcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctggccagaggtccatctcgctgagatacgaagggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcctccgagagccgcttcaacaccctggccgagttggttcatcatcattcaacggtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaagcccactgtctatggtgtgtcccctaactacgacaagt。
117.seq id no.2：
118.tacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcagagtggagggagaacatccgggagcagcagaagaagtgtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgcagatgctgaccaactcgtgtgtgaaactccagactgtccacagcattccgctgaccatcaataaggaagatgatgagtctccggggctctatgggtttctgaatgtcatcgtccactcagccactggatttaagcagagttcaaaagcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcaggg
tctgagtgaagccgctcgttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaagctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcc。
119.(2)溶解：
120.将所述abl野生型装甲rna和bcr
‑
abl融合型装甲rna在90℃下水浴裂解5min，随后使用保护稀释液分别进行溶解，使浓度依次为10倍浓度梯度，至理论浓度为2
×
103拷贝/μl；
121.其中，保护稀释液包括ph为8.0的tris
‑
edta缓冲液、终浓度为20ng/μl的载体rna以及0.01％的triton x
‑
100。
122.(3)浓度检测：
123.通过数字pcr对所述abl野生型装甲rna和bcr
‑
abl融合型装甲rna的浓度进行检测：
124.所述数字pcr的反应体系包括终浓度为800nm的引物对、250nm的荧光探针和预混液；
125.扩增所述abl野生型装甲rna的引物对的序列如seq id no.3～4所示，检测所述abl野生型装甲rna的荧光探针的序列如seq id no.5所示，所述荧光探针的荧光发生基团为fam，荧光淬灭基团为mgb；
126.扩增所述bcr
‑
abl融合型装甲rna的引物对的序列如seq id no.6～7所示，检测所述bcr
‑
abl融合型装甲rna的荧光探针的序列如seq id no.8所示，所述荧光探针的荧光发生基团为fam，荧光淬灭基团为bhq1；
127.seq id no.3：ctacgtctcctccgagagccgcttcaaca；
128.seq id no.4：cccgtcggccaccgttgaatgatgatg；
129.seq id no.5：ccctggccgagttggtt；
130.seq id no.6：acgagcggcttcactcagaccctgaggctc；
131.seq id no.7：tccacagcattccgctgaccatcaataaggaag；
132.seq id no.8：aagcccttcagcggccagtagcatctgacttt。
133.所述预混液包括缓冲液、反转录酶、dna聚合酶和dntps；
134.反应体系具体如下：
[0135][0136]
所述数字pcr的反应程序包括：
[0137]
反转录：55℃，15min；
[0138]
预变性：95℃，10min；
[0139]
循环扩增：94℃，30s；55℃，60s；循环40次；
[0140]
仪器冷却：12℃，5min。
[0141]
扩增完成后，使用芯片分析仪分析定量结果，得到两种装甲rna的实际浓度(拷贝/μl)。根据实际浓度与梯度溶解的倍数，计算得知原始装甲rna溶液的实际浓度。
[0142]
(4)制备校准品和参考品：
[0143]
使用保护稀释液对所述abl野生型装甲rna和bcr
‑
abl融合型装甲rna进行梯度稀释，至终浓度依次为2
×
105拷贝/μl、2
×
104拷贝/μl、2
×
103拷贝/μl、2
×
102拷贝/μl、2
×
101拷贝/μl和2拷贝/μl，得到校准品。
[0144]
将abl野生型装甲rna校准品和bcr
‑
abl融合型装甲rna校准品按浓度比例依次为10:1、100:1、1000:1和10000:1混合，得到参考品。
[0145]
混合时，取20μl浓度为2
×
105拷贝/μl的abl野生型装甲rna校准品，分别与20μl浓度依次为2
×
104拷贝/μl、2
×
103拷贝/μl、2
×
102拷贝/μl、2
×
101拷贝/μl的bcr
‑
abl融合型装甲rna校准品混合，补加160μl的保护稀释液，得到上述参考品。
[0146]
本发明使用装甲rna制备校准品和参考品，可以与who一级标准品保持一致；通过添加保护稀释液可以稳定扩增效率，降低批间差异；使用数字pcr进行定量，计算结果更加准确，可以与who一级标准品更好地溯源。
[0147]
实施例2
[0148]
本实施例对实施例1制备的bcr
‑
abl基因融合检测的校准品和参考品的准确性进行检测，包括以下步骤：
[0149]
(1)对校准品、参考品和who一级标准品进行扩增，所述扩增的反应体系包括终浓度为600nm的引物对、200nm的荧光探针、pcr缓冲液、反转录缓冲液、0.4u/μl的反转录酶、0.075u/μl的dna聚合酶、0.125u/μl的rna酶抑制剂和250μm的dntps。
[0150]
反应体系具体如下：
[0151][0152]
反应程序与实施例1中的相同。
[0153]
(2)构建校准品的循环数与拷贝数的标准曲线，再建立who一级标准品的实际检测值与理论值的线性关系曲线，再建立参考品的实际检测值与理论值的线性关系曲线，根据曲线参数对准确性进行判断。
[0154]
abl野生型装甲rna校准品的标准曲线如图1a所示，bcr
‑
abl融合型装甲rna校准品的标准曲线如图1b所示。由图可以看出，标准曲线的线性关系良好(r2分别为1.000和0.999)，扩增效率较高(eff％分别为97.636和101.84)，能够用于精准定量。
[0155]
who一级标准品的实际检测值(bcr
‑
abl/abl百分比的对数值)与理论值(bcr
‑
abl/abl百分比的对数值)的线性关系曲线如图2所示，由图可以看出r2＝0.995，斜率＝1.0776(接近1)，截距＝0.0213(接近0)，线性关系良好，线性公式近似于y＝x，校正系数(cf)＝0.9521，保留1位小数则等于1.0。(校正系数为截距逆对数的倒数)。
[0156]
参考品的实际检测值(bcr
‑
abl/abl百分比的对数值)与理论值(bcr
‑
abl/abl百分比的对数值)的线性关系曲线如图3所示，由图可以看出r2＝0.995，斜率＝1.0767(接近1)，截距＝
‑
0.0391(接近0)，线性关系良好，线性公式近似于y＝x，定量结果符合预期。
[0157]
上述结果说明制备的校准品在配套的检测体系下校正系数十分接近1.0；制备的参考品与理论值基本一致，可溯源至who一级标准品，可以直接用于产品的验证或质检，也
可以用于后续制备批次参考品的溯源，流程图如图4所示。
[0158]
综上所述，本发明制备的校准品与参考品可以与who一级标准品在核酸层面保持一致，结果更加准确；制备过程中经过数字pcr定量，对于装甲rna的原始拷贝数定量更加精准；使用保护稀释液对装甲rna进行稀释，可以稳定并提高反应的扩增效率，减少批间差异，实验的重复性更好；可以与who一级标准品进行很好的溯源，校正系数十分接近1.0，制备方法简单，使用方便，更容易获取。
[0159]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。