冠状动脉疾病的诊断标志物组合的制作方法

1.本发明涉及生物技术、生物医药领域，具体涉及包括冠状动脉疾病的诊断标志物组合。


背景技术：

2.心肌不断的需要富氧血液。冠状动脉(从与心脏连接的主动脉冠状窦处发出)负责运送这种血液。冠状动脉疾病可使一个或多个冠状动脉分支狭窄，从而阻塞血流，导致胸痛(心绞痛)或心脏病发作(也称为心肌梗死或mi)。冠状动脉疾病曾被广泛的认为是男性的疾病。男性平均较女性早10年左右发病，因为女性在绝经前受到高水平雌激素的保护。绝经后，冠状动脉疾病在女性中变得更为常见。因为女性的寿命更长，所以在75岁及以上人群中，女性的患病比例反而更高。因此，适当的治疗和改变生活方式，可以有效缓解冠状动脉疾病，并能预防未来可能发生的问题。
3.心绞痛是胸部不适、沉重、压力、疼痛、烧灼、饱涨、挤压或痛苦的感觉。心绞痛容易被误诊为消化不良或胃灼热。这种绞痛可能还会出现在肩膀、手臂、颈部、咽喉、颌部或背部。当压力或炎症导致主动脉阻塞，大大减少血流量时，冠状动脉疾病会突然恶化，还会出现突然疼痛和其他症状。冠心病的其他症状包括：呼吸短促(气短)、心悸(心律不齐)、心跳加快、无力或眩晕、恶心、出汗、头晕、虚弱、乏力、有时首发症状会出现突发性心脏骤停。
4.目前诊断冠心病的方法很多，如心电图检查、超声心动图、ct等都可以间接反映冠状动脉有没有病变。冠状动脉造影术是目前能直接观察到冠状动脉病变部位、狭窄程度和远端血流通畅情况等，并测定左心室功能的诊断方法。因此，冠状动脉造影术被认为是诊断冠心病最主要和最可靠的方法，是相对的“金标准”。
5.除了做到健康饮食、经常运动、保持健康的体重、还有管理情绪之外，易感人群还可以有规律的体检，尽早发现、尽早治疗，所以本发明所提供的诊断标志物组合具有实际应用价值。


技术实现要素：

6.本发明的发明人通过对数据集数据分析，筛选、验证、提供了可以高效准确诊断冠状动脉疾病的标志物、标志物组合。同时提供了检测冠状动脉疾病的试剂盒、系统及其应用。
7.一方面本发明提供了一种诊断冠状动脉疾病的标志物组合，所述标志物组合中包含mboat2、apba2和rfc2。
8.优选地，所述标志物组合还包括arrb2或znf33b。
9.优选地，所述mboat2在患者中高表达。
10.优选地，所述apba2在患者中低表达。
11.优选地，所述rfc2在患者中高表达。
12.优选地，所述arrb2在患者中高表达。
13.优选地，所述znf33b在患者中高表达。
14.本文中的“mboat2”，指编码所有或部分mboat2蛋白或与所有或部分的核酸序列或其类似物大致相同的核酸，其gene id为129642。
15.本文中的“apba2”，指编码所有或部分mboat2蛋白或与所有或部分的核酸序列或其类似物大致相同的核酸，其gene id为321。
16.本文中的“rfc2”，指编码所有或部分mboat2蛋白或与所有或部分的核酸序列或其类似物大致相同的核酸，其gene id为5982。
17.本文中的“arrb2”，指编码所有或部分mboat2蛋白或与所有或部分的核酸序列或其类似物大致相同的核酸，其gene id为409。
18.本文中的“znf33b”，指编码所有或部分mboat2蛋白或与所有或部分的核酸序列或其类似物大致相同的核酸，其gene id为7582。
19.优选地，所述高表达指所述标志物在患者体内的表达水平大于健康对照群体体内的表达水平，相对于对照表达水平高至少1.1倍，具体地，至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍或3.5倍或更多。
20.优选地，所述低表达指所述标志物在患者体内的表达水平小于健康对照群体体内的表达水平，例如是对照表达量的约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。
21.另一方面，本发明提供了检测前述标志物组合中至少任意一种标志物表达量的试剂盒。
22.优选地，所述至少任意一种包括两种、三种、四种或更多。
23.优选地，所述表达量包括mrna表达量和/或蛋白表达量。
24.优选地，所述试剂盒中包括检测mrna表达量和/或蛋白表达量的试剂。
25.优选地，所述检测mrna表达量的试剂包括以下方法中使用到的试剂：基于pcr的定量检测方法、southern杂交、northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(fish)、dna微阵列、aso法、高通量测序平台。
26.优选地，所述检测mrna表达量的试剂包括特异性引物和/或探针。
27.优选地，所述探针可以是dna、rna、dna
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rna嵌合体、pna或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15
‑
25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
28.优选地，所述检测蛋白表达量的试剂包括以下方法中使用到的试剂：蛋白质印迹(western blot法)、酶联免疫吸附测定(elisa)、放射性免疫测定(ria)、夹心测定、免疫组织化学染色、质谱法、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、流式细胞荧光分边技术和蛋白质芯片。
29.优选地，所述检测蛋白表达量的试剂包括特异性抗体。
30.优选地，所述抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。
31.优选地，所述抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或带有修饰的抗体，具体地，所述抗体包括嵌合抗体、scfv、fab、f(ab’)2、fv等。只要所述片段能够保留与蛋白的结合能力即可。用于检测蛋白质水平的抗体的制备是本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
32.优选地，所述试剂盒中还可以包括mrna表达量辅助检测试剂、蛋白表达量辅助检测试剂、mrna表达量辅助检测仪器、蛋白表达量辅助检测仪器。
33.优选地，所述mrna表达量辅助检测试剂包括但不限于：使所述引物对应的扩增子可视化的反应试剂，例如通过琼脂糖凝胶电泳法、酶联凝胶法、化学发光法、原位杂交法、荧光检测法等使扩增子可视化的试剂；rna提取试剂；逆转录试剂；cdna扩增试剂；制备标准曲线所用的标准品；阳性对照品；阴性对照品。
34.优选地，所述蛋白表达量辅助检测试剂包括但不限于：封闭液、抗体稀释液、洗涤缓冲液、显色终止液、制备标准曲线的标准品。
35.另一方面本发明提供了一种诊断冠状动脉疾病的系统，所述系统包括根据前述检测标志物组合中至少任意一种标志物表达量得出诊断结果的计算装置。
36.优选地，所述系统还可以包括检测标志物表达量的检测装置。
37.优选地，所述检测装置包括实时定量pcr仪、高通量测序平台、检测芯片和芯片信号读取器。
38.优选地，所述芯片包括检测标志物表达量的探针。
39.优选地，所述芯片上还包括内参探针。
40.优选地，所述内参包括gapdh或β
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actin。
41.优选地，所示芯片包括蛋白芯片和/或基因芯片。
42.优选地，所述系统还包括评估结果发送单元，所述评估结果发送单元可以将受试者的评估结果发送到患者或医护人员可以查阅的信息通信终端装置。
43.另一方面本发明提供了诊断冠状动脉疾病的方法，所述方法包括检测检测检测前述标志物组合中至少任意一种标志物表达量。
44.优选地，所述方法还包括收集来着于受试者的步骤。
45.本文中的术语“受试者”意指任何动物，还指人类和非人类的动物。
46.本文中的术语“非人类的动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物，如非人灵长类动物(特别是高等灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿类动物(如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛、和任何家畜或宠物；以及非哺乳动物，如鸡，两栖类，爬行动物等。
47.在优选的实施方式中，所述受试者为人。
48.优选地，所述样品包括：组织、血液、尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊髓液、泪液、痰、粘液、淋巴、胞液、腹水、胸膜积液、羊水、膀胱冲洗液和支气管肺泡灌洗液。
49.优选地，所述血液包括：血清、血浆、全血。
50.优选地，所述血液是全血。
51.优选地，所述全血来源自外周血。
52.另一方面，本发明提供了检测前述mboat2、apba2、rfc2、arrb2、znf33b、标志物组合中至少任意一个的表达量的试剂、前述试剂盒、前述系统在制备诊断受试者是否患有冠状动脉疾病的产品中的应用。
53.本发明所述的“诊断冠状动脉疾病的方法、系统”的实施可包括手动地、自动地、或它们组合地来执行或完成所选任务。
54.而且，根据本发明方法、系统的实施方式的实际仪器和设备，可通过硬件、通过软件、或通过固件或通过它们的组合使用操作系统来实施多个所选任务。
附图说明
55.图1为差异基因在gse12288数据库中的差异箱线图，a是mboat2、b是apba2、c是rfc2、d是arrb2、e是znf33b、f是prkx、g是fn3krp、h是sult1b1。
56.图2为差异基因在gse20680数据库中的差异箱线图，a是mboat2、b是apba2、c是rfc2、d是arrb2、e是znf33b、f是prkx、g是fn3krp、h是sult1b1。
57.图3是mboat2 apba2 rfc2 arrb2在数据库gse12288中诊断的roc曲线；纵坐标是敏感度，横坐标是特异性。
58.图4是mboat2 apba2 rfc2 znf33b在数据库gse12288中诊断的roc曲线；纵坐标是敏感度，横坐标是特异性。
59.图5是mboat2 prkx fn3krp znf33b在数据库gse12288中诊断的roc曲线；纵坐标是敏感度，横坐标是特异性。
60.图6是apba2_rfc2在数据库gse12288中诊断的roc曲线；纵坐标是敏感度，横坐标是特异性。
61.图7是mboat2 apba2 rfc2在数据库gse12288中诊断的roc曲线；纵坐标是敏感度，横坐标是特异性。
62.图8是mboat2 prkx sult1b1在数据库gse12288中诊断的roc曲线；纵坐标是敏感度，横坐标是特异性。
具体实施方式
63.下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
64.实施例1、筛选并验证标志物组合的诊断效果
65.下载数据库gse12288(110患者 112对照)、gse20680(143患者 52对照)的数据，使用r包进行差异表达分析，筛选在患者和对照中差异表达(p<0.05)的基因。对比对两个数据库的筛选结果，筛选在两个数据库中表达量变化一致的标志物，分析结果表明mboat2、apba2、rfc2、arrb2、znf33b、prkx、fn3krp、sult1b1在两个数据库中的变化一致，差异分析如图1所示。
66.为提高诊断的准确性，对mboat2、apba2、rfc2、arrb2、znf33b、prkx、fn3krp、sult1b1进行组合，各组合的roc值及附图如下表1所示：
67.表1、标志物组合及其auc值
68.标志物、标志物组合auc附图最佳阈值(特异度，灵敏度)mboat20.632711039
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apba20.618506494
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rfc20.592288961
ꢀꢀ
arrb20.594034091
ꢀꢀ
znf33b0.578246753
ꢀꢀ
prkx0.589772727
ꢀꢀ
fn3krp0.581737013
ꢀꢀ
sult1b10.635308442
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mboat2 apba2 rfc2 arrb20.72240259730.566(0.818,0.545)mboat2 apba2 rfc2 znf33b0.72037337740.533(0.782,0.598)mboat2 prkx fn3krp znf33b0.64659090950.585(0.809,0.438)apba2_rfc20.65462662360.532(0.718,0.571)mboat2 apba2 rfc20.7062570.499(0.727,0.643)mboat2 prkx sult1b10.63530844280.499(0.455,0.759)
69.由表1的数据可知，单独的标志物或两个标志物的组合难以准确的诊断疾病，当三个标志物组合时，尤其是mboat2 apba2 rfc2组合时，auc值到达0.7，提供了准确的诊断标志物组合。进一步在mboat2 apba2 rfc2组合中增加标志物的数量可以继续提高诊断的准确率。