凝结芽孢杆菌BC66作为抗氧化剂的应用的制作方法

凝结芽孢杆菌bc66作为抗氧化剂的应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，尤其是涉及凝结芽孢杆菌bc66作为抗氧化剂的应用。


背景技术：

2.氧化应激是指生物体内源性和外源性活性氧自由基(ros：是指那些独立存在的有一个或几个不配对电子的原子或基团；
·
o2
‑
、
·
ho
‑
和h2o2等，是研究生物体内氧化损伤最重要的考察对象)水平超出机体自身抗氧化系统的平衡能力，从而导致过量ros攻击细胞组分，修饰细胞蛋白质、脂质和dna，并引发一系列病变反应。故当动物体处于应激状态，便会诱导各种疾病发生，使动物生长发育减缓，免疫力减弱，生产性能下降，加速生物体的衰老或死亡。大量研究表明，在动物体中摄入抗氧化剂，能够有效提高机体的抗氧化能力，改善生产性能。
3.目前，动物饲料中常用的抗氧化剂有抗氧喹、叔丁基对苯二酚等化学物质和vc、ve等，这些抗氧化剂存在着安全性差或添加成本高等问题。
4.益生菌是用来促进人和动物肠道微生物区系平衡的微生物制剂，能够调节肠道功能紊乱，维持肠道内菌群平衡并提高机体免疫水平，被广泛地应用于兽药、食品、畜牧和水产等行业。目前国内外广泛应用的益生菌有芽孢杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌和酵母菌等，但大多数乳酸菌耐胃酸、耐胆盐和抗高温能力差，而芽孢杆菌具有良好的抗逆性，对增强机体抗氧化能力、提高机体免疫能力，改善生产性能有良好的效果，是一种理想的微生物源抗氧化剂。其中凝结芽孢杆菌作为一种能够形成芽孢的乳酸菌更具应用前景。因此筛选具有抗氧化效果的凝结芽孢杆菌，可以更好的应用于饲料添加剂，以代替抗生素的使用。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供凝结芽孢杆菌bc66作为抗氧化剂的应用，其能广泛应用于畜牧、水产等行业。
6.本发明涉及一株具有抗氧化能力的菌株凝结芽孢杆菌bc66，其微生物保藏号为cgmcc21879，分类命名为：bacillus coagulans；保藏时间：2021年03月08日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
7.该菌株经体外抗氧化指标筛选评价，具备较强的体外自由基清除能力。其dpph(1,1
‑
二苯基
‑2‑
三硝基苯肼)清除能力高达66.79％。
8.因而本发明提供凝结芽孢杆菌bc66作为抗氧化剂的应用。
9.本发明还提供凝结芽孢杆菌bc66在制备抗氧化剂中的应用，所述凝结芽孢杆菌bc66作为全部或者部分原料。
10.所述凝结芽孢杆菌bc66耐高温性能优异，120℃高温处理10min后芽孢存活率98％，其菌粉在饲料高温造粒工艺中存活率高达90％以上。
11.特别地，所述凝结芽孢杆菌bc66能够很好的应用于兽药和饲料中，优选地可以应用于猪、鸡、鸭等动物饲料中。
12.本发明还提供所述凝结芽孢杆菌bc66作为抗氧化的饲料添加剂的应用。
13.所述的凝结芽孢杆菌bc66能够有效提高黄羽肉鸡血清中sod酶及过氧化氢酶活性，降低血清中mda含量，增强其抗氧化能力，提高机体免疫水平，改善动物生产性能，能够广泛应用于兽药、饲料、畜牧及水产等行业。
附图说明
14.图1，不同菌株ic的dpph清除率。
15.图2，凝结芽孢杆菌bc66在体外不同处理条件下的耐受情况。
具体实施方式
16.下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1：具抗氧化功能凝结芽孢杆菌的筛选
17.从猪、鸡、鱼等样品的肠道内容物中分离、筛选到32株乳酸菌和11株芽孢杆菌，分别为嗜热链球菌st1
‑
st3，保加利亚乳杆菌lb4
‑
lb7，发酵乳杆菌lf8
‑
lf11，植物乳杆菌lp12
‑
lp14，嗜酸乳杆菌la15
‑
la19，鼠李糖乳杆菌lgg20
‑
lgg24，干酪乳杆菌lc25，副干酪乳杆菌lp26
‑
lp28，罗伊氏乳杆菌lr29
‑
32，凝结芽孢杆菌bc33
‑
37，地衣芽孢杆菌bl38
‑
40，枯草芽孢杆菌bs41
‑
43，以下均使用简称。
18.(1)乳酸菌完整细胞(ic)及无细胞提取物(cfe)的制备
19.将实验室
‑
80℃保存的菌液接入已灭菌的mrs培养基中37℃培养活化2代，2代菌液培养10h后，培养液经1000r/min离心收集菌体，pbs洗涤2次后重悬，调整菌数至109浓度，即为乳酸菌完整细胞(ic)悬浮液；将菌液经超声破碎后，离心所得的上清液即为cfe。
20.(2)初筛(dpph清除实验)
21.将0.8ml的样品(活菌数控制为109浓度)加入到1ml 0.2mmol/l新鲜配制的dpph
‑
无水乙醇溶液中，混匀，在黑暗中避光室温反应30min，10000r/min离心2min，取上清液在517nm波长处测定吸光值，记为as。空白组以等体积无水乙醇替换dpph溶液测量吸光值，记为ab；对照组以等体积蒸馏水(或pbs)替换样品溶液测量吸光值，记为ac。
22.dpph自由基清除率(％)＝[1
‑
(as
‑
ab)/ac]
×
100
[0023]
其中，as为样品组吸光值；ac为对照组吸光值(蒸馏水替代样品)；ab为空白组吸光值(无水乙醇替代dpph)。
[0024]
图1所示的初筛结果表明，嗜酸乳杆菌la15，凝结芽孢杆菌bc34、bc36，地衣芽孢杆菌bl38，枯草芽孢杆菌bs42完整细胞的dpph清除率均在50％以上。其中bc36完整细胞dpph清除率高达66.79％，故此5株菌株选为后续复筛实验菌株。
[0025]
(3)复筛
[0026]
将初筛中的5株高dpph清除能力菌株全部用于复筛。
[0027]
a.清除羟自由基能力的测定
[0028]
将1ml 2.5mm 1,10
‑
邻菲罗啉(sigma，usa)、1ml pbs(ph 7.4)、1ml样品(分别为ic和cfe)和1ml 2.5mm feso4混匀。加入1ml 20mm的h2o2，37℃恒温水浴反应1.5h，在536nm波
长处测定其吸光度a
s
；用1ml蒸馏水代替1ml h2o2测定其吸光度a0；用1ml蒸馏水代替1ml样品测定其吸光度a1。
[0029]
羟自由基清除能力(％)＝(as
‑
a1)/(a0‑
a1)
×
100
[0030]
其中，a
s
是样品的吸光度；a1表示控制溶液的吸光度，含1,10
‑
邻菲罗琳、feso4和过氧化氢，不含样品；a0表示空白溶液的吸光度，不含样品和h2o2。
[0031]
b.超氧阴离子自由基清除能力的测定
[0032]
取1ml 150mmol/l tris
‑
hcl(ph 8.2)于试管中，依次加入1ml 3mmol/l二乙三胺五乙酸、1ml 1.2mmol/l邻苯三酚，再加入0.5ml样品，充分混匀，总反应体系体积是3.5ml。混合物于25℃恒温水浴反应10min后，在325nm波长处测吸光度。
[0033]
o2
‑
·
清除率(％)＝(1
‑
a
11
‑
a
10
/a
01
‑
a
00
)
×
100
[0034]
式中：a
00
为不含样品和邻苯三酚吸光度；a
01
为不含样品、含邻苯三酚吸光度；a
10
为含样品、不含邻苯三酚吸光度；a
11
为含样品和邻苯三酚吸光度(注：不含的部分用等体积150mmol/l tris
‑
hcl(ph 8.2)代替)。
[0035]
c.抑制脂质过氧化能力
[0036]
0.5ml pbs缓冲液(浓度为0.02mol/l，ph＝7.4)中加入1ml亚油酸乳化液、0.2ml feso4(质量分数0.01％)、0.2ml h2o2(0.56mmol)、0.4ml完整细胞或无细胞提取物混合，37℃水浴反应12h。取2ml反应溶液，加入0.2ml的三氯乙酸(tca，质量分数4％)、2ml硫代巴比妥酸(tba，质量分数0.8％)、0.2ml的丁基化羟基甲苯(bht，质量分数0.4％)，该混合物在100℃反应30min，冷却后加入2ml三氯甲烷(氯仿)抽提，离心收集上清液，在532nm下测定吸光度值，以pbs作为空白对照。
[0037]
抗脂质过氧化率(％)＝(1
‑
a
532(样品)
/a
532(空白)
)
×
100％。
[0038]
实验结果如下表所示，凝结芽孢杆菌bc36各抗氧化指标均表现出良好的实验效果，故将其定名为bc66，并确定作为后续应用实验的菌株。
[0039]
表1复筛菌株抗氧化指标测定结果
[0040][0041]
实施例2：体外模拟人工胃肠液及胆盐耐受性测试研究
[0042]
a.耐人工胃液试验
[0043]
模拟人工胃液的配制：nacl 0.5％、胃蛋白酶0.3％，用hcl溶液调整ph值为3.0，用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用。
[0044]
分别取凝结芽孢杆菌bc66的芽孢菌悬液1ml，离心、收集菌体，然后加入1ml的模拟胃液中，于37℃培养2.5h，用稀释平板法测定活菌总数(cfu/ml)，并以0h测定值作为空白对照，计算存活率。
[0045]
b.耐人工胆盐试验
[0046]
模拟人工胆盐培养基的配制：mrs培养基中添加0.2％(w/v)的巯基乙酸钠，并加入
0.30％胆盐(w/v)，118℃灭菌15min，冷却备用。
[0047]
上述mrs培养基配方如下：葡萄糖2％、蛋白胨1％、牛肉粉1％、酵母粉0.5％、吐温
‑
80 0.1％、柠檬酸氢二氨0.2％、磷酸氢二钾0.2％、七水硫酸镁0.058％、一水硫酸锰0.019％，ph6.8。
[0048]
分别取凝结芽孢杆菌bc66的芽孢菌悬液1ml，离心、收集菌体，然后加入到1ml的人工胆盐培养基中，于37℃培养2.5h，用稀释平板法测定活菌总数(cfu/ml)，并以0h测定值作为空白对照，计算存活率。
[0049]
实验结果如图2所示，凝结芽孢杆菌bc66在体外模拟的人工胃液及胆盐的耐受性测试中，其存活率均较高，基本上不受耐受压力的影响。
[0050]
实施例3：耐高温实验
[0051]
以bc66菌粉为试验对象，称取菌粉(芽孢数在2.5
×
10
11
cfu/g)1g添加到1000ml无菌水中，充分混匀。各取凝结芽孢杆菌溶液1ml，分别进行90℃水浴处理5min、10min；120℃高温处理10min、30min。吸取处理液进行适度梯度稀释，测定活菌数，以未处理的凝结芽孢杆菌溶液作为空白对照，计算凝结芽孢杆菌的芽孢存活率，每次实验三次重复，结果见表2。
[0052]
表2 bc66耐热性评价
[0053][0054]
bc66菌粉的耐热性实验结果表明：90℃水浴处理5min，芽孢存活率不受影响，处理10min，仍有88％的芽孢存活率；120℃高温处理30min，芽孢存活率仍保持在80％。说明该凝结芽孢杆菌bc66耐热性非常好，能够很好的用于饲料高温造粒过程中。
[0055]
实施例4：bc66在饲料高温造粒中的应用
[0056]
以bc66菌粉为试验对象，现将高浓度的bc66菌粉用麸皮稀释至100亿cfu/g，然后再与粉碎后的原料(玉米、豆粕、麸皮、植物油等)混匀后经喂料器进入调质器，向调质器内通入饱和蒸汽与物料充分搅拌混合，使物料在调质器内温度90
‑
100℃的条件下保持90s，直接造粒；造粒出料口温度85
‑
90℃、含水量18％左右；采用冷却器进行冷却，使饲料颗粒10min内冷却至高于室温5℃左右，即得到含有凝结芽孢杆菌的饲料颗粒。对饲料颗粒称重；然后取样、粉碎、测定饲料颗粒中的凝结芽孢杆菌芽孢数，计算芽孢得率。
[0057]
进行3批次试验，bc66的芽孢得率分别为90％，92.3％，94.2％。由此可见bc66有着良好的加工性能，适应饲料加工的不良环境。
[0058]
实施例5：抗氧化功能应用试验
[0059]
(1)试验设计与分组
[0060]
选用300只1日龄黄羽肉鸡，随机分为2组，每组5个重复，每重复30只。ⅰ组为对照组，饲喂无bc66的基础饲料(基础饲料参照nrc(1994)肉鸡饲养标准并结合实际生产情况配料，按实施例4的工艺制备)；ⅱ组饲喂基础饲料 凝结芽孢杆菌制剂(按实施例4的工艺制
备，使凝结芽孢杆菌活菌数为3
×
108cfu/kg)；试验分为1
‑
28日龄和29
‑
70日龄两个阶段进行。
[0061]
(2)饲养管理
[0062]
鸡舍采用中央空调控制温度，第1
‑
7天饲养温度控制为34℃，第8
‑
14天为30℃，之后为27℃；饲养的环境相对湿度第1
‑
7天控制为70％，第8
‑
14天为60％，之后55％左右；光照强度为30lx。采用网上平养，自由饮水、自由采食，每天除粪1次。按照常规程序进行消毒、免疫。
[0063]
(3)样品采集与检测
[0064]
试验进行到第28天和第70天，鸡只禁食12h后，每个重复分别抽取试验鸡25只称重，颈静脉放血处死后；将接有颈静脉血的离心管静止10min后3000r/min离心，取血清放于
‑
20℃冰箱用于抗氧化功能测定。
[0065]
a.生长性能测定及养殖成本核算：试验当天及试验结束时以重量为单位称量仔鸡始重，末重(称重前12h禁食，自由饮水)，每天记录喂料量、淘汰及病死鸡只情况。
[0066]
b.血清抗氧化指标测定：选取总抗氧化能力(t
‑
aoc)，超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)活性和丙二醛(mda)含量作为测定血清抗氧化功能即非特异性免疫的指标。测定方法及步骤根据试剂盒操作说明进行测定(均购自南京建成生物工程研究所)。
[0067]
实验结果表明，黄羽肉鸡采食量提高13％，生病率降低15％，死亡率降低10％，增重率提高16％，养殖成本降低13％，提高了黄羽肉鸡的养殖效益。
[0068]
凝结芽孢杆菌bc66能够有效提高黄羽肉鸡血清中sod酶及过氧化氢酶活性，降低血清中mda含量，增强其抗氧化能力，改善动物生产性能。
[0069]
表3凝结芽孢杆菌对黄羽肉鸡血清抗氧化功能的影响
[0070][0071]