用于大分子的连续诊断的设备和方法与流程

用于大分子的连续诊断的设备和方法
1.本技术是基于中国专利申请第201880011980.1号的分案申请。
2.本技术根据美国法典第35章第119条(e)款要求于2017年2月14日提交的美国临时申请第62/458,840号的权益，其通过引用以其整体并入本文。
技术领域
3.本发明涉及用于对大分子测序的装置、设备和方法。该装置和设备包括双向联接至测量模块的可独立控制的流体通道。


背景技术：

4.固态纳米孔和生物纳米孔正日益成为开发低成本高通量大分子测序系统的关注重点。基于纳米孔的感测的方法采用测量通过纳米孔的离子流流动，所述纳米孔被掺入在膜的任一侧提供的电极之间的高电阻两亲性膜内。由于引起大分子诸如脱氧核糖核酸(dna)多核苷酸移动通过纳米孔，通过纳米孔的离子流流动受到dna链的不同核苷酸碱基的调节。可以对离子流流动的变化进行测量以确定聚合物链的序列特征。
5.尽管有显著的进步，提供可制造的大型阵列集成纳米孔感测装置仍然是具有挑战性的。模块中装置质量的变化会导致较差的信号噪声比，而含有纳米孔的膜的任一侧的溶液的重量渗透克分子浓度差异会导致可靠性问题。此外，用于控制大分子跨纳米孔的移动速率的方法可能会小于理想值，从而导致高误差率。
6.发明概述
7.本技术公开了用于对大分子测序的装置、设备和方法。该装置和设备包括双向联接至测量模块的可独立控制的流体通道。
8.如本发明所述，大分子测序装置包括测量模块，所述测量模块包括第一模块入口和第二模块入口；流体联接至第一模块入口的第一通道，其中第一通道包括第一通道入口和第二通道入口；流体联接至第二模块入口的第二通道，其中第二通道包括第三通道入口和第四通道入口；第一阀组件，其被配置为控制第一通道中的第一溶液的双向流动；以及第二阀组件，其被配置为控制第二通道中的第二溶液的双向流动。
9.如本发明所述，组装大分子测序模块的方法包括提供如本发明所述的大分子测序装置；使第一溶液流动通过测量模块；使第一含脂溶液流动通过第二通道；使第二溶液流动通过第二通道；以及使第三溶液流动通过第二通道。
10.如本发明所述，对大分子测序的方法包括提供如本发明所述的大分子测序装置，其中测序装置包括放置在测量模块内并分隔开第一体积与第二体积的含纳米孔的双层膜；将大分子引入至第二体积；使大分子通过纳米孔从第二体积移动至第一体积；以及检测与大分子移动通过纳米孔相关的性质。
11.如本发明所述，大分子测序设备包括如本发明所述的多个大分子测序装置。
12.如本发明所述，对大分子测序的方法包括在第一模块中形成纳米孔膜，其中纳米孔膜分隔开第一体积与第二体积；将大分子引入至第一体积中；当大分子通过纳米孔从第
一体积移动至第二体积时，读取大分子的单链的序列；在中间储存器中收集单链大分子；在第二模块中形成纳米孔膜，其中纳米孔膜分隔开第一体积与第二体积；制备用于边合成边测序(sequencing
‑
by
‑
synthesis)的单链大分子；以及当sbs制备的单链大分子从第一体积移动至第二模块的第二体积时进行sbs测序。
13.作为非限制性实例，本技术提供了以下实施方案：
14.实施方案1.大分子测序装置，其包括：
15.测量模块，其包括第一模块入口和第二模块入口；
16.第一通道，其流体联接至所述第一模块入口，其中所述第一通道包括第一通道入口和第二通道入口；
17.第二通道，其流体联接至所述第二模块入口，其中所述第二通道包括第三通道入口和第四通道入口；
18.第一阀组件，其被配置为控制所述第一通道中第一溶液的双向流动；以及
19.第二阀组件，其被配置为控制所述第二通道中第二溶液的双向流动。
20.实施方案2.如实施方案1所述的大分子测序装置，其包括放置在所述测量模块内且分隔开第一体积与第二体积的含纳米孔的双层膜，其中所述第一通道流体联接至所述第一体积并且所述第二通道流体联接至所述第二体积。
21.实施方案3.如实施方案2所述的大分子测序装置，其还包括：
22.第一电极，其可操作地联接至所述第一体积；和
23.第二电极，其可操作地联接至所述第二体积。
24.实施方案4.如实施方案1所述的大分子测序装置，其包括多个测量模块，其中，
25.所述多个测量模块中的每一个的第一入口流体联接至所述第一通道；和
26.所述多个测量模块中的每一个的第二入口流体联接至所述第二通道。
27.实施方案5.如实施方案1所述的大分子测序装置，其中所述测量模块的壁包括自组装的单层。
28.实施方案6.如实施方案1所述的大分子测序装置，其中所述第一通道可控制地流体联接至所述第二通道。
29.实施方案7.组装大分子测序模块的方法，其包括：
30.提供实施方案1所述的大分子测序装置；
31.使第一溶液流动通过所述测量模块；
32.使第一含脂溶液流动通过所述第二通道；
33.使第二溶液流动通过所述第二通道；和
34.使第三溶液流动通过所述第二通道。
35.实施方案8.如实施方案7所述的方法，其中使第一溶液流动通过所述测量模块包括使第一溶液从所述第一通道的第一通道入口和第二通道入口流动通过所述第二通道的第三入口和第四入口。
36.实施方案9.如实施方案7所述的方法，其中使第一含脂溶液流动通过所述第二通道包括使所述第一含脂溶液从所述第二通道的第三入口流动通过所述第二通道的第四入口，其中所述第一通道的第一入口和第二入口是关闭的。
37.实施方案10.如实施方案7所述的方法，其中使第二溶液流动通过所述第二通道包
括使所述第二溶液从所述第二通道的第三入口流动通过所述第二通道的第四入口，其中所述第一通道的第一入口和第二入口是关闭的。
38.实施方案11.如实施方案7所述的方法，其中使第三溶液流动通过所述第二通道包括使第三溶液从所述第二通道的第三入口流动通过所述第二通道的第四入口。
39.实施方案12.如实施方案7所述的方法，其中使所述第一溶液流动包括润湿溶剂。
40.实施方案13.如实施方案7所述的方法，其中使所述第三溶液流动导致脂
‑
溶剂
‑
脂结构在所述测量模块内形成。
41.实施方案14.如实施方案13所述的方法，其中，在使所述第三溶液流动之后，所述脂
‑
溶剂
‑
脂结构聚结以在所述测量模块内形成脂双层。
42.实施方案15.如实施方案14所述的方法，其还包括在形成脂双层之后，使第四溶液流动通过所述第一通道和所述第二通道，其中所述第四溶液包括醇性溶剂。
43.实施方案16.如实施方案14所述的方法，其还包括在形成脂双层之后，将纳米孔复合物引入至所述脂双层。
44.实施方案17.如实施方案16所述的方法，其中将纳米孔复合物引入包括使第五溶液流动通过所述第二通道，其中所述第五溶液包括纳米孔复合物。
45.实施方案18.如实施方案16所述的方法，其中将纳米孔复合物引入还包括使第六溶液同时流动通过所述第一通道，其中选择所述第六溶液以建立所需的重量渗透克分子浓度条件。
46.实施方案19.如实施方案7所述的方法，其中所述第一溶液、所述第二溶液和所述第三溶液中的每一个均是亲水性的。
47.实施方案20.如实施方案7所述的方法，其中所述第一脂溶液是疏水性的。
48.实施方案21.对大分子进行测序的方法，其包括：
49.提供实施方案1所述的大分子测序装置，其中所述测序装置包括放置在测量模块内且分隔开第一体积与第二体积的含纳米孔的双层膜；
50.将大分子引入至所述第二体积；
51.使所述大分子从所述第二体积通过所述纳米孔移动至所述第一体积；和
52.检测与所述大分子移动通过所述纳米孔相关的性质。
53.实施方案22.如实施方案21所述的方法，其中，
54.所述第一体积包括由第一重量渗透克分子浓度表征的溶液；
55.所述第二体积包括由第二重量渗透克分子浓度表征的第二溶液；和
56.其还包括控制所述第一重量渗透克分子浓度与所述第二重量渗透克分子浓度之间的差异。
57.实施方案23.如实施方案22所述的方法，其中控制所述第一重量渗透克分子浓度与所述第二重量渗透克分子浓度之间的差异包括将溶液引入至所述第一体积以建立在所述第一体积中的溶液与所述第二体积中的溶液之间的重量渗透克分子浓度的所需的差异。
58.实施方案24.如实施方案21所述的方法，其还包括将移动的大分子从所述第一体积重新引入至所述第二体积。
59.实施方案25.如实施方案24所述的方法，其还包括：
60.使重新引入的大分子从所述第二体积通过所述纳米孔移动至所述第一体积；和
61.检测与所述重新引入的大分子移动通过所述纳米孔相关的性质。
62.实施方案26.大分子测序设备，其包括多个实施方案1所述的大分子测序装置。
附图说明
63.本领域技术人员将理解，本说明书描述的附图仅用于说明目的。此类附图不旨在限制本发明的范围。
64.图1表示出本发明提供的大分子测序模块的横截面顶视图。
65.图2表示出图1所示的大分子测序模块的沿着截面a
‑
a’的垂直横截面侧视图。
66.图3表示出图1所示的大分子测序模块的沿着截面b
‑
b’的垂直横截面侧视图。
67.图4表示出包括多个大分子测序模块的大分子测序设备的俯视图。
68.图5表示出说明根据本发明的用于对大分子测序的部分方法的流程图。
69.发明详述
70.出于下述描述的目的，应当理解，除非明确地相反指出，否则由本发明提供的实施方式可以采取各种可替代的变型和步骤顺序。此外，除了在实施例中或在另外指出的情况之外，在说明书及权利要求书中使用的例如表示成分的量的所有数值应被理解为在所有情况下皆被术语“约”修饰。因此，除非相反指出，否则在下面的说明书及权利要求书中提及的数值参数是近似值，其可以根据要获得的期望性质而变化。至少并不是试图限制对权利要求范围应用等同原则，每个数值参数至少应该根据所报告的有效数字的数量及通过应用正常舍入技术来解释。
71.尽管列出本发明广泛范围的数值范围及参数是近似值，但特定实施例中列出的数值尽可能被精确地记载。然而，任何数值固有地包括由其各自在测试测量中发现的标准变化所必然产生的某些误差。
72.另外，应理解，本发明列举的任何数值范围旨在包括其中涵盖的所有子范围。例如，“1至10”的范围旨在包括介于约1的最小值以及约10的最大值之间(并且包括端值)的所有子范围，即具有等于或大于约1的最小值以及等于或小于约10的最大值。此外，在本发明中，除非另外特别声明，否则使用“或”意味着“和/或”，即使“和/或”能明确地用于某些情况。
73.现参考本发明的某些设备和方法。所公开的设备及方法并非旨在限制权利要求。相反，权利要求旨在涵盖所有的替代物、修改及等同物。
[0074]“纳米孔”是指形成或以其他方式提供在膜中的孔、通道或通路。膜可以是有机膜如两亲性双层或脂双层，或合成膜如由聚合物材料形成的膜，或由金属、金属氧化物和/或金属间化合物形成的固态膜。可将纳米孔放置在感测电路或联接到感测电路的电极附近或临近，例如互补金属
‑
氧化物半导体(cmos)或场效晶体管(fet)电路。纳米孔可具有0.1纳米(nm)至约1,000nm量级的特征宽度或直径。纳米孔可包括蛋白或蛋白复合物，例如α
‑
溶血素。
[0075]“大分子”是指生物聚合物，例如多核苷酸(包括dna和rna)或蛋白。大分子可以包括，例如dna、dna片段、rna、rna片段(包括mrna(信使核糖核酸)和rrna(核糖体核糖核酸)以及此类的片段)、pna、核苷酸、核苷、寡核苷酸、蛋白、多肽、氨基酸及聚合物。大分子可为单链。
[0076]“多核苷酸”是指包括一个或多个核苷酸的聚合物或寡聚物。多核苷酸可以包括dna多核苷酸或寡核苷酸、rna多核苷酸或寡核苷酸(包括mrna和rrna)、或者dna多核苷酸或寡核苷酸和/或rna多核苷酸或寡核苷酸的一个或多个区段。
[0077]“核苷酸”可以为主要的核苷酸或核苷酸类似物。主要的核苷酸可以为脱氧腺苷单磷酸(damp)、脱氧胞苷单磷酸(dcmp)、脱氧鸟苷单磷酸(dgmp)、脱氧胸苷单磷酸(dtmp)、腺苷单磷酸(amp)、胞苷单磷酸(cmp)、鸟苷单磷酸(gmp)或尿苷单磷酸(ump)。核苷酸类似物为主要的核苷酸的类似物或模拟物，其具有对主要的核碱基(a、c、g、t和u)的修饰、脱氧核糖/核糖结构、主要的核苷酸的磷酸根基团或它们的任意组合。例如，核苷酸类似物可以具有修饰的碱基，其可以是天然存在的也可以是人工的。修饰的碱基的实例包括甲基化的核碱基、修饰的嘌呤碱基(如次黄嘌呤、黄嘌呤、7
‑
甲基鸟嘌呤、isodg)、修饰的嘧啶碱基(如5,6
‑
二氢尿嘧啶和5
‑
甲基胞嘧啶、isodc)、通用碱基(如3
‑
硝基吡咯和5
‑
硝基吲哚)、非结合性碱基模拟物(如4
‑
甲基苯并咪唑(4
‑
methylbezimidazole)和2,4
‑
二氟甲苯或苯)以及无碱基(碱性核苷酸，其中核苷酸类似物不具有碱基)。具有修饰的脱氧核糖(如双脱氧核苷诸如双脱氧鸟苷、双脱氧腺苷、双脱氧胸苷及双脱氧胞苷)和/或磷酸酯结构(统称为主链结构)的核苷酸类似物的实例包括乙二醇核苷酸、吗啉基(morpholinos)及锁定核苷酸。
[0078]
用于对大分子诸如多核苷酸进行测序的设备可包括流体联接至纳米孔模块的可独立控制的通道。可以改变可独立控制的通道内的溶液以促进脂双层形成、在脂双层内引入纳米孔复合物和/或多核苷酸测序。可流体联接通道，使得可将一个通道中的溶液重新引入到另一个通道中。例如，可以将测序的大分子诸如多核苷酸重新引入到纳米孔模块或另一个测序模块中以进行另外的使用相同或不同的测序方法的测序。
[0079]
由本发明提供的设备提供对大分子测序模块中的溶液的独立控制。独立控制含纳米孔的脂双层的任一侧的溶液的能力可以提高大分子测序期间脂双层的稳定性，并且可以促进测序。重新引入先前测序的大分子到测序模块中以用于同一大分子的一个或多个另外的测序操作(多重读取)的能力可以提高测序的精确性、可靠性、保真度及完整性。
[0080]
大分子测序模块可包括延伸通过脂双层的纳米孔复合物。脂双层分隔开测量模块的第一体积与第二体积。按照惯例，测序模块包括可被称为顺式室的第一室以及可被称为反式室的第二室，其中顺式室和反式室可由含纳米孔的双层膜分隔开。可将经测序的大分子通过纳米孔从顺式室移动至反式室。在测序期间，可将包括大分子诸如多核苷酸的溶液引入到第一体积中。使多核苷酸通过纳米孔从第一体积移动到第二体积。当多核苷酸通过纳米孔时，可以测量穿过膜的电化学电位，并使其与在给定时间通过纳米孔的核苷酸序列相关联。累积的电化学测量及核苷酸序列相关性可以导致确定多核苷酸序列。
[0081]
理想的是脂双层的任一侧的溶液是可独立控制的。可独立控制是意指脂双层的任一侧的溶液可具有不同的组成以及不同的性质。在整个装置组装过程(其中，例如形成脂双层并将纳米孔复合物插入脂双层中)中，可期望在纳米孔模块的任一侧独立地引入和改变溶液。在脂双层形成期间，脂双层的任一侧的溶液可由例如不同的亲水性/疏水性来表征。在测序期间，脂双层的任一侧的溶液可由不同的重量渗透克分子浓度来表征。
[0082]
微流体大分子测序装置可以包括至少一个大分子测序模块，所述大分子测序模块流体联接至测量模块的任一侧的第一通道和第二通道。可使通道联接至一个或多个储存器。包括限定通道、模块以及储存器的壁的微流体装置可以由任何适合的材料形成，诸如有
机和/或无机材料，包括例如微电子材料(导电的、半导电的或电绝缘的)，包括材料诸如ii
‑
iv以及iii
‑
v材料，氧化物及氮化物诸如si3n4、al2o3和sio，有机及无机聚合物诸如聚酰胺、塑料(诸如teflon
tm
)或弹性体(诸如硅酮和玻璃)。固态支撑结构可以由单原子层形成，诸如石墨烯、二硫化钼或氮化硼。微流体装置的壁可以被官能化或用无机层或有机层处理以向侧壁提供某些性质，例如亲水性、疏水性和/或氢键合能力。
[0083]
通道的直径可为例如10nm至约1,000nm，例如10nm至100nm或10nm至50nm。通道可以在两端包括开口或入口，并且溶解或悬浮在溶液中的大分子可以从一个入口通过第一通道到另一个入口。通道入口也可以用作出口，这取决于联接到通道入口的一个或多个流体阀的配置。为方便起见，术语入口意指用于流体流进通道的入口及用于流体流出通道的出口。可以从使用的上下文中确定入口用作入口或用作出口。入口可以在测序设备使用期间在不同时间起到入口或出口的作用。在特定时间，通道入口可以用作用于流体流动通过通道的入口，或者可以用作用于流体流动通过通道的出口。通道可以包括通道任一端的入口，或者可以包括多个入口。多个入口中的一些可以提供溶液通过通道的单向流动，并且多个入口中的一些可以提供通过通道的双向流动。可将大分子引入到大分子测序模块的第一体积。可将第一体积内的大分子通过放置在双层膜内的纳米孔并进入大分子测序模块的第二体积中。可将大分子溶解或悬浮于任何适合的溶液中作为溶液中的溶质。所述溶液可以为，例如水溶液、有机溶液或其组合。水溶液可具有一定的ph，例如，在ph 2至ph 12、ph 2至ph 7、或ph 7至ph 14。
[0084]
纳米孔传感器的储存器或其他组件可被配置为提供驱动力以将大分子朝着和/或通过纳米孔移动或通过所述纳米孔从一个储存器移动到另一个储存器。例如，可以在具有电压和电流的电路中提供电极以在储存器之间产生电泳力，以用于电泳驱动溶液中的大分子朝向纳米孔或通过纳米孔从一个储存器到另一个储存器。为了能够进行大分子的电泳驱动，可以将储存器内的溶液提供为具有适于溶液中大分子的ph以及其他特性的导电离子溶液。移动和控制大分子移动通过纳米孔的速率也可以使用替代技术，诸如使用酶分子马达来进行。
[0085]
除了施加的电压驱动力之外或者作为施加的电压驱动力的替代方案，穿过孔的压力梯度可以用于使分子朝向纳米孔和/或通过纳米孔。可通过使用物理压力或化学压力诸如渗透压产生压力梯度。可以从穿过顺式室及反式室的浓度差产生渗透压。渗透压可以通过具有渗透活性剂(例如盐、聚乙二醇(peg)或甘油)的浓度梯度来产生。此外，光镊或磁光陷阱可用于操作单核苷酸、大分子的部分或整个大分子。
[0086]
脂双层是由两层脂分子形成的薄的极性膜。用于形成脂双层的两亲性分子可以是能够在极性溶液和非极性溶液之间的界面处形成膜的任何合适的两亲性分子。两亲性分子可以包括脂，其可以具有单一组分或各个组分的混合物，如形成脂双层时常规的那样。可以使用任何能够形成脂双层的脂。可以选择脂以使得形成具有所需性质(诸如表面电荷、支撑膜蛋白诸如纳米孔的能力、堆积密度或机械性质)的脂双层。脂可以包括一种或多种不同的脂，例如，脂可含有至多100种脂。脂理想的是含有1种至10种的脂。脂可以包括天然存在的脂和/或人工脂。
[0087]
脂可以包括头部基团、界面部分以及两个可以相同或不同的疏水性尾部基团。适合的头部基团包括例如中性头部基团，诸如二酰甘油酯和神经酰胺；两性离子头部基团，诸
如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂；带负电荷的头部基团，诸如磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷酸和心磷脂；以及带正电荷的头部基团，诸如三甲基铵
‑
丙烷。适合的界面部分包括但不限于天然存在的界面部分，诸如基于甘油的部分或基于神经酰胺的部分。适合的疏水性尾部基团包括但不限于饱和烃链，诸如月桂酸(正十二烷酸)、肉豆蔻酸(正十四烷酸)、棕榈酸(正十六烷酸)、硬脂酸(正十八烷酸)和花生酸(正二十烷酸)；不饱和烃链，诸如油酸(顺式
‑9‑
十八烷酸)；以及支链烃链，诸如植烷酰基(phytanoyl)。链的长度与不饱和烃链中双键的位置和数量可以变化。支链烃链中的链的长度与分支(诸如甲基基团)的位置和数目可以变化。疏水性尾部基团可以连接至作为醚或酯的界面部分。
[0088]
脂也可以为经化学修饰的。脂的头部基团或尾部基团可经化学修饰。其中头部基团经化学修饰的合适的脂包括，例如peg修饰的脂，诸如1,2
‑
二酰基
‑
sn
‑
甘油基
‑3‑
磷酸乙醇胺
‑
n
‑
[甲氧基(聚乙二醇)
‑
2000]；官能化peg脂，诸如1,2
‑
二硬脂酰
‑
sn
‑
甘油基
‑
3磷酸乙醇胺
‑
n
‑
[生物素基(聚乙二醇)2000]；以及经修饰用于缀合的脂，诸如1,2
‑
二油酰基
‑
sn
‑
甘油基
‑3‑
磷酸乙醇胺
‑
n
‑
(琥珀酰基)和1,2
‑
二棕榈酰
‑
sn
‑
甘油基
‑3‑
磷酸乙醇胺
‑
n
‑
(生物素基)。其尾部基团经化学修饰的合适的脂包括，例如可聚合的酯，诸如1,2
‑
双(10,12
‑
二十三碳二炔酰基)
‑
sn
‑
甘油基
‑3‑
磷酸胆碱(1,2
‑
bis(10,12
‑
tricosadiynoyl)
‑
sn
‑
glycero
‑3‑
phosphocholine)；氟化脂，诸如1
‑
棕榈酰基
‑2‑
(16
‑
氟棕榈酰基)
‑
sn
‑
甘油基
‑3‑
磷酸胆碱；氘化脂，诸如1,2
‑
二棕榈酰基
‑
d
62
‑
sn
‑
甘油基
‑3‑
磷酸胆碱；以及醚连接的脂，诸如1,2
‑
二
‑
o
‑
植烷基
‑
sn
‑
甘油基
‑3‑
磷酸胆碱。合适的脂的实例包括植烷酰基脂，诸如1,2
‑
二植烷酰基
‑
sn
‑
甘油基
‑3‑
磷酸胆碱(dphpc)和1,2
‑
二植烷酰基
‑
sn
‑
甘油基
‑3‑
磷酸乙醇胺(dphpe)。可以使用两亲性聚合物膜。
[0089]
两亲性分子可包括两亲性化合物，所述两亲性化合物包括第一外亲水性基团、疏水性核基团和第二外亲水性基团，其中第一和第二外亲水性基团中的每一个连接至疏水性核基团。
[0090]
两亲性分子可包括三嵌段共聚物。三嵌段共聚物可以承受高电压，其鲁棒性以及其能力可承受去污剂和蛋白的生物降解。可以使用的适合的硅酮三嵌段聚合物的实例为7
‑
22
‑
7pmoxa
‑
pdms
‑
pmoxa、6
‑
45
‑
6pmoxa
‑
pe
‑
pmoxa和6
‑
30
‑
6pmoxa
‑
pdms
‑
pmoxa。为了稳定脂双层，在形成和插入纳米孔后，可以将某些官能团插入脂链中以允许各个脂在双层内交联。交联可以采用任何适合的方法，诸如使用热、uv或金属离子催化方法进行。
[0091]
纳米孔可作为脂双层中的孔穴、间隙、通道、凹槽、孔或其他孔提供，并且在一定程度以(诸如直径)适合于移动和感测大分子的相应几何形状提供。为了感测分子移动通过纳米孔，纳米孔的特征可为，例如小于10nm、小于5nm、小于2nm或小于1nm。
[0092]
纳米孔可为跨膜蛋白孔。生物孔可以为天然存在的孔或可以为突变的孔。适合的纳米孔的实例描述于例如美国申请公布第2012/1007802号；stoddart等人，proc natl acad sci,12；106(19):7702
‑
7；stoddart等人，angew chem int ed engl.2010；49(3):556
‑
9；stoddart等人，nano lett.2010年9月8日；10(9):3633
‑
7；butler等人，proc natl acad sci 2008；105(52)；20647
‑
52；美国申请公布2014/186823以及pct国际申请公布第wo 2013/153359号。纳米孔可以为同源寡聚或可以为异源寡聚。纳米孔可为rna或dna折纸孔(origami pore)，诸如由langecker等人，science,2012；338:932
‑
936所记载。
[0093]
可以使用各种方法来检测和定量大分子通过纳米孔的移动。例如，可将电极分别
放置在顺式室和反式室内。也可将电极放置在双层膜内或者其上和/或在测量模块的壁内。
[0094]
电极可以对例如电流、电压、电阻、阻抗、电位或任何上述的组合的电学性质灵敏。
[0095]
光学检测器也可用于感测和定量大分子通过纳米孔的移动。光学检测器可对例如吸光度、透射、散射、荧光、荧光共振能量转移(fret)、表面等离子体共振、表面增强拉曼散射、尖端增强拉曼散射、衍射及其组合灵敏。
[0096]
检测器可以对黏合或附接至大分子的探针灵敏。
[0097]
纳米孔传感器不限于具有固态电压感测装置的固态纳米孔配置。也可以使用生物纳米孔以及潜在的感测排列，例如具有蛋白纳米孔或其他适合的配置。可以在脂双层中提供电压灵敏的染料，例如荧光直接染料，作为电转导组件。在此类排列下，当物质对象(species object)诸如分子移动通过蛋白质纳米孔时，跨两亲性层的电压降变化并且染料的荧光由电压变化而调节。染料荧光的光学检测或感测以及此荧光的变化提供纳米孔处电位的感测。可以使用光学显微术或其他常规排列来将此类电位测量作为来自纳米孔传感器的光学输出信号。此类两亲性层纳米孔传感器是生物纳米孔传感器的实例，其基于对纳米孔系统中某个位置处局部电位的感测。用于纳米孔移动检测的局部电位测量的方法不限于特定的固态或生物配置，并且可以应用于任何适合的纳米孔配置。
[0098]
通过维持顺式室和反式室中的溶液的重量渗透克分子浓度，使得两种溶液的重量渗透克分子浓度的差值减小或最小化，改善双层的完整性。这使得双层以及纳米孔模块具有更大的尺寸。在更大尺寸的顺式室和反式室的情况下，感测电极可以具有更大的尺寸。因电极在使用过程中被消耗，几何尺寸更大的电极可以导致更长的电极寿命，继而可延长测序装置的操作寿命。
[0099]
较大的室体积也可以促进在顺式室和/或反式室内使用多电极，这可以增加信号噪声比。
[0100]
由本发明提供的方法可以扩展为提供多个双层/纳米孔堆叠。例如，在形成第一含纳米孔的双层之后，可以重复用于组装第一含纳米孔的双层的工艺以形成一个或多个另外的含纳米孔的双层。
[0101]
本发明提供的纳米孔传感器配置的图解视图，其能够使得局部电位感测方法用于纳米孔感测。为了便于讨论，图中所示的装置特征未按比例表示。
[0102]
图1中示出测序模块的横截面俯视图。
[0103]
图1中所示的测序模块100包括第一通道101，在第一通道101的相对端具有第一入口102和第二入口103；以及第二通道104，在第二通道104的相对端具有第一入口105和第二入口106。入口102/103/105/106流体联接至一个或多个阀(未示出)，所述阀被配置为独立控制溶液流动通过第一通道并通过第二通道。所述阀可被配置为提供通过第一通道的双向流动117，及通过第二通道的双向流动118。所述阀也可被配置为在通道中容纳溶液，而不会使溶液流动通过通道。通道内的溶液可以与测量模块108的第一体积107和第二体积109内的流体交换。
[0104]
一个或多个阀(未示出)中的每一个都可以流体联接至一个或多个流体储存器(未示出)。一个或多个流体储存器可含有不同的溶液，所述溶液适用于组装测序模块100和/或用于对大分子诸如多核苷酸测序。适合的流体的实例包括缓冲液、溶剂、醇性溶剂、含脂的溶液、含有纳米孔复合物的溶液、含有大分子诸如多核苷酸的溶液。一个或多个储存器可流
体联接至通道102和104。
[0105]
第一通道101可以流体联接至测量模块108的第一体积107。测量模块108包括第一模块入口119、第一体积107、第二模块入口120和第二体积109。可将脂双层110放置在第一体积107与第二体积109之间的界面处。脂双层110可包括纳米孔复合物111，所述纳米孔复合物111位于脂双层110内并流体联接测量模块108的第一体积107和第二体积109。
[0106]
如图1所示，可将电极112放置在第一体积107内和第二体积109内。电极112可被配置为测量第一体积107与第二体积109之间的电位变化。
[0107]
第一通道101、第二通道104和测量室108可由侧壁113/114/115/116限定。侧壁113/114/115/116可以包括用于制造微流体装置的适合材料。
[0108]
第一和第二通道101/104可以具有任何适合的尺寸，例如小于100nm、小于50nm或小于20nm。
[0109]
测量模块108可以具有任何适合的尺寸，诸如，壁113与壁114之间的测量模块的宽度可以小于60nm、小于40nm或小于20nm。
[0110]
通道101/104可以流体联接至一个或多个测量模块。通道101可以流体联接至通道104。因通道101与104流体联接，通过纳米孔复合物111从第二体积109移动到第一体积107的大分子可以进入第一通道101，并被引导至第二通道104，并被重新引入到第二体积109中，其中所引入的大分子可以再次被测序。可将重新引入的大分子引入到相同的测量模块或不同的测量模块中。
[0111]
图2示出沿着图1中所示的测序模块的截面a
‑
a’的横截面视图。图2示出第一通道201、第二通道204和侧壁214/215/216。图2也示出顶板217和底板218，其与侧壁113/114/115/116一起限定测序模块。
[0112]
图3示出沿着图1中所示的测序模块的截面b
‑
b’的横截面视图。图3示出侧壁314/315/316、第一体积309和第二体积307、位于脂双层310内的纳米孔复合物311和电极312。
[0113]
测序装置可包括多个测序模块。
[0114]
多个测量模块可以排列成二维阵列、三维阵列或任何适合的配置。理想的是在小区域内包括多个测序模块以提高测序效率。测序设备可以包括，例如最多105个测序模块、最多106个测序模块或107个测序模块。
[0115]
例如，图4中示出包括多个测序模块401的测序装置400的横截面顶视图。图4示出以平行阵列排列的多个测序模块401。
[0116]
使多个测序模块401中的每一个的每个测量模块401的第一侧通过通道403流体联接至第一流体储存器402。使每个通道403流体联接至第二流体储存器404。
[0117]
使多个测序模块中的每一个的每个测量室的第二侧通过通道406流体联接至第三流体储存器405。使每个通道406流体联接至第四流体储存器407。
[0118]
其他配置也包括在本发明的范围内。例如，可使每个通道流体联接至多个储存器。每个储存器可以流体联接至一个或多个阀，所述阀被配置为控制储存器内溶液流动到一个或多个测量模块。阀或阀组件可被配置为控制溶液通过通道的双向流动。
[0119]
测序装置仅是一个实例，并且其也包括其他配置。例如，可使每个测量室流体联接至多个流体储存器，且可使不同的流体储存器流体联接至彼此。
[0120]
可例如使用下述步骤形成纳米孔脂双层。
[0121]
参考图1，可以允许适合的缓冲液从入口102和103流动进入通道102，通过测量模块108进入通道104，并且通过入口105和106流出通道104。缓冲液流可用于清洁、恢复或以其他方式准备装置以供使用。缓冲液流可以从系统包括从通道和测量模块中去除空气。缓冲液可以包括润湿溶剂，诸如醇，以便从系统中去除空气。此外，可以使用受控真空条件通过从溶液中排出溶解气体来去除气泡。使溶液流动通过通道包括将溶液引入通道中使得足以置换通道内的先前流体，使溶液连续地流动通过通道(从第一入口通过通道的第二入口)，并且引入溶液至通道中使得足以置换先前流体并保持溶液在通道内以允许通道内的溶液与测量模块内的溶液交换或混合。使溶液通过通道或在通道内流动包括连续流动和不连续流动。
[0122]
在清洗装置并从系统中去除空气后，可以将脂双层组装在测量模块内。可以通过将含有脂的溶液从入口105流动通过通道104并流出入口106，来实现脂双层的组装。在将脂引入至测量模块的此步骤期间，可以关闭第一通道的入口102和103。脂溶液流动进入测量模块的一部分。参考图1，脂单层将在缓冲液与脂溶液(在测量模块的右侧)之间的界面自发形成。
[0123]
在入口102和103仍然被阻塞的情况下，可以将缓冲溶液通过入口105引入到通道104中并且通过入口106。在此过程中，第二缓冲液溶液的层将存在于脂单层的右侧，并形成第二溶剂/缓冲液界面。
[0124]
脂将在邻接第一脂单层的溶剂与第二含脂溶液之间的界面处自发形成脂单层。所得的结构，从左到右，包括亲水性缓冲液、脂单层、疏水性溶液、脂单层和亲水性缓冲液。接着，脂单层聚结并置换界面疏水性溶液以形成双层膜。脂双层膜横跨测量模块的宽度并在脂双层的任一侧限定出第一体积和第二体积。
[0125]
可通过入口和两个通道冲洗醇性溶液以从装置中去除任何残留的疏水性溶液。
[0126]
为了将纳米孔复合物引入到双层膜中，图1中测量模块、体积107和109的左侧和右侧的渗透条件可以通过从入口104，通过通道102和通过入口103以使适合的溶液流动；以及从入口105，通过通道104和通过入口106以使适合的溶液流动来进行控制。流动通过入口103和进入通道105的溶液可包括纳米孔复合物。将纳米孔复合物引入至测量模块中后，纳米孔复合物将自发地插入双层膜中。
[0127]
将纳米孔复合物掺入双层膜中后，可对多核苷酸进行测序。例如，可将含有单链多核苷酸的溶液从p入口105引入到通道104中并引入到测量模块108的体积109中。
[0128]
可以选择包括长度、宽度和高度的测量室的尺寸以确定多核苷酸扩散通过纳米孔复合物的速率。例如，腔的尺寸可以决定多核苷酸的形状，此可影响多核苷酸扩散通过纳米孔复合物的速率。测量室的壁可以涂有一层分子以影响多核苷酸的形状和移动性。
[0129]
由本发明提供的设备提供了对大分子测序模块两侧的溶液的独立控制。独立控制大分子测序模块的顺式侧和反式侧的溶液的能力，可以通过降低跨含纳米孔的双层膜的渗透不平衡来改善纳米孔双层膜系统的可靠性。另一个优点是可以将反式室中的测序的大分子隔离并再循环至顺式室并重新测序。对大分子重新测序的能力可以改善测序的可靠性。通过降低跨含纳米孔的双层膜的渗透不平衡，可以控制移动速率，使得该速率受大分子的布朗运动(brownian motion)的一维空间限制的支配。减慢大分子通过纳米孔复合物移动可以改善序列测定的可靠性和精确性。
[0130]
本发明提供的设备可用于对大分子进行测序。图5是示出如本发明的用于对大分子测序的部分方法的流程图。第一测量模块可以通过在第一测量模块501中形成纳米孔膜来制备。将大分子引入到第一模块的顺式室中，并当单链大分子通过纳米孔移动到测量模块502的反式室时读取序列。将移动的单链大分子贮藏在中间储存器503中。可以在第二测量模块504中形成纳米孔膜。来自步骤503的单链大分子可经制备用于边合成边测序(sbs)505。接着，在第二模块506中对sbs制备的单链大分子进行sbs测序。
[0131]
发明方面
[0132]
第1方面：大分子测序装置，其包括：测量模块，所述测量模块包括第一模块入口和第二模块入口；流体联接至第一模块入口的第一通道，其中第一通道包括第一通道入口和第二通道入口；第二通道，其流体联接至第二模块入口，其中第二通道包括第三通道入口和第四通道入口；第一阀组件，其被配置为控制第一通道中的第一溶液的双向流动；和第二阀组件，其被配置为控制第二通道中的第二溶液的双向流动。
[0133]
第2方面：如第1方面所述的大分子测序装置，其包括放置在测量模块内且分隔开第一体积与第二体积的含纳米孔的双层膜，所述第一通道流体联接至所述第一体积且所述第二通道流体联接至所述第二体积。
[0134]
第3方面：如第2方面所述的大分子测序装置，其还包括：可操作地联接至所述第一体积的第一电极；以及可操作地联接至所述第二体积的第二电极。
[0135]
第4方面：如第1方面至第3方面中任一项所述的大分子测序装置，其包括多个测量模块，其中，所述多个测量模块中的每一个的所述第一入口流体联接至所述第一通道；以及所述多个测量模块中的每一个的所述第二入口流体联接至所述第二通道。
[0136]
第5方面：如第1方面至第4方面中任一项所述的大分子测序装置，其中，所述第一溶液的特征在于第一组合物；所述第二溶液的特征在于第二组合物；且所述第一组合物不同于所述第二组合物。
[0137]
第6方面：如第1方面至第5方面中任一项所述的大分子测序装置，其中，所述第一溶液的特征在于第一重量渗透克分子浓度；所述第二溶液的特征在于第二重量渗透克分子浓度；以及选择所述第一溶液和所述第二溶液以控制所述第一重量渗透克分子浓度与所述第二重量渗透克分子浓度之间的差值。
[0138]
第7方面：如第1方面至第6方面中任一项所述的大分子测序装置，其中，所述第一溶液的特征在于第一重量渗透克分子浓度；所述第二溶液的特征在于第二重量渗透克分子浓度；并且所述第一重量渗透克分子浓度与所述第二重量渗透克分子浓度基本上相同。
[0139]
第8方面：如第1方面至第7方面中任一项所述的大分子测序装置，其中测量模块的壁包括自组装的单层。
[0140]
第9方面：如第8方面所述的大分子测序装置，其中，选择所述自组装的单层以延伸大分子以及控制大分子的流动性。
[0141]
第10方面：如第9方面所述的大分子测序装置，其中，所述自组装的单层可形成至多核苷酸的氢键。
[0142]
第11方面：如第9方面所述的大分子测序装置，其中，所述自组装的单层包括硅氧烷。
[0143]
第12方面：如第1方面至第11方面中任一项所述的大分子测序装置，其中，所述第
一通道可控地流体联接至所述第二通道。
[0144]
第13方面：组装大分子测序模块的方法，其包括：提供第1方面至第12方面中任一项所述的大分子测序装置；使第一溶液流动通过所述测量模块；使第一含脂溶液流动通过所述第二通道；使第二溶液流动通过所述第二通道；以及使第三溶液流动通过所述第二通道。
[0145]
第14方面：如第13方面所述的方法，其中使第一溶液流动通过所述测量模块包括使第一溶液从所述第一通道的所述第一通道入口和所述第二通道入口流动通过所述第二通道的所述第三入口和所述第四入口。
[0146]
第15方面：如第13方面至第14方面中任一项所述的方法，其中使第一含脂溶液流动通过所述第二通道包括使所述第一含脂溶液从所述第二通道的所述第三入口流动通过所述第二通道的所述第四入口，其中所述第一通道的所述第一入口和所述第二入口是关闭的。
[0147]
第16方面：如第13方面至第15方面中任一项所述的方法，其中使第二溶液流动通过所述第二通道包括使所述第二溶液从所述第二通道的所述第三入口流动通过所述第二通道的所述第四入口，其中所述第一通道的所述第一入口和所述第二入口是关闭的。
[0148]
第17方面：如第13方面至第16方面中任一项所述的方法，其中使第三溶液流动通过所述第二通道包括使第三溶液从所述第二通道的所述第三入口流动通过所述第二通道的所述第四入口。
[0149]
第18方面：如第13方面至第17方面中任一项所述的方法，其中使所述第一溶液流动包括润湿溶剂。
[0150]
第19方面：如第13方面至第18方面中任一项所述的方法，其中使所述第三溶液流动导致脂
‑
溶剂
‑
脂结构在测量模块内形成。
[0151]
第20方面：如第19方面所述的方法，其中，在使所述第三溶液流动后，所述脂
‑
溶剂
‑
脂结构聚结以在测量模块内形成脂双层。
[0152]
第21方面：如第20方面所述的方法，其还包括在形成脂双层之后，使第四溶液流动通过所述第一通道以及通过所述第二通道，其中所述第四溶液包括醇性溶剂。
[0153]
第22方面：如第20方面所述的方法，其还包括，在形成脂双层之后，将纳米孔复合物引入至所述脂双层中。
[0154]
第23方面：如第22方面所述的方法，其中将纳米孔复合物引入包括使第五溶液流动通过所述第二通道，其中所述第五溶液包括纳米孔复合物。
[0155]
第24方面：如第22方面所述的方法，其中将纳米孔复合物引入还包括使第六溶液同时流动通过所述第一通道，其中选择所述第六溶液以建立所需的重量渗透克分子浓度条件。
[0156]
第25方面：如第13方面至第24方面中任一项所述的方法，其中所述第一溶液、所述第二溶液和所述第三溶液中的任一个是亲水性的。
[0157]
第26方面：如第13方面所述的方法，其中所述第一脂溶液是疏水性的。
[0158]
第27方面：对大分子测序的方法，其包括：提供第1方面至第12方面中任一项所述的大分子测序装置，其中所述测序装置包括放置在所述测量模块内且分隔开第一体积与第二体积的含纳米孔的双层膜；将大分子引入至所述第二体积中；使所述大分子从所述第二
体积通过所述纳米孔移动至所述第一体积中；以及检测与所述大分子移动通过所述纳米孔相关的性质。
[0159]
第28方面：如第27方面所述的方法，其中，所述第一体积包括由第一重量渗透克分子浓度表征的溶液；所述第二体积包括由第二重量渗透克分子浓度表征的第二溶液；以及还包括控制所述第一重量渗透克分子浓度与所述第二重量渗透克分子浓度之间的差异。
[0160]
第29方面：如第28方面所述的方法，其中控制所述第一重量渗透克分子浓度与所述第二重量渗透克分子浓度之间的差异包括使所述第一重量渗透克分子浓度与所述第二重量渗透克分子浓度之间的差异最小化。
[0161]
第30方面：如第28方面所述的方法，其中控制所述第一重量渗透克分子浓度与所述第二重量渗透克分子浓度之间的差异包括将由所选的重量渗透克分子浓度表征的溶液引入至所述第一体积中。
[0162]
第31方面：如第28方面所述的方法，其中控制所述第一重量渗透克分子浓度与所述第二重量渗透克分子浓度之间的差异包括将溶液引入至所述第一体积中以建立在所述第一体积中的溶液与所述第二体积中的溶液之间的重量渗透克分子浓度的所需的差异。
[0163]
第32方面：如第27方面至第31方面中任一项所述的方法，其还包括将所述移动的大分子从所述第一体积重新引入至所述第二体积中。
[0164]
第33方面：如第32方面所述的方法，其还包括：使重新引入的大分子从所述第二体积通过所述纳米孔移动到所述第一体积中；以及检测与所述重新引入的大分子移动通过所述纳米孔相关的性质。
[0165]
第34方面：大分子测序设备，其包括多个第1方面至第12方面中任一项所述的大分子测序装置。
[0166]
第35方面：如第34方面所述的大分子测序设备，其中多个大分子测序装置中的至少一些包括放置在所述测量模块内的含纳米孔的双层膜。
[0167]
第36方面：如第34方面至第35方面中任一项所述的大分子测序设备，其中，多个大分子测序装置中的至少一些包括共同的第一通道、共同的第二通道或者共同的第一通道和共同的第二通道两者。
[0168]
第37方面：如第34方面至第36方面中任一项所述的大分子测序设备，其中所述共同的第一通道可控地流体联接至所述共同的第二通道。
[0169]
第38方面：对大分子测序的方法，其包括：在第一模块中形成纳米孔膜，其中所述纳米孔膜分隔开第一体积与第二体积；将大分子引入至第一体积中；当大分子通过纳米孔从所述第一体积移动至所述第二体积时，读取大分子的单链的序列；将单链大分子收集于中间储存器中；在第二模块中形成纳米孔膜，其中所述纳米孔膜分隔开第一体积与第二体积；制备用于边合成边测序的所述单链大分子；以及当sbs制备的单链大分子从所述第一体积移动至所述第二模块的所述第二体积时进行sbs测序。
[0170]
应该注意，存在实施本发明公开的实施方式的替代方式。因此，本实施方式应被认为是说明性，而非限制性。此外，权利要求不限于本发明给出的细节，并且包括其全部范围和其等同物。