一种测定醋醅中黄曲霉毒素B1的拉曼增强光谱方法与流程

一种测定醋醅中黄曲霉毒素b1的拉曼增强光谱方法
技术领域
1.本发明属于食品快速检测技术领域，具体涉及一种基于表面增强拉曼光谱的测定食醋固态发酵醋醅中黄曲霉毒素b1(afb1)的检测方法。


背景技术：

2.食醋作为一种广泛使用的传统调味品，其生产过程采用多菌种固态发酵，开放式的酿造过程存在真菌毒素污染风险。因此，醋醅中真菌毒素的快速检测对于真菌毒素生产过程预警具有重要价值。
3.拉曼技术已被用于检测呕吐毒素(don)、黄曲霉毒素b1(afb1)、赭曲霉毒素(ota)等多种真菌毒素，但检测对象多为玉米、小麦等谷物。以谷物为检测对象时，通过前处理可以极大程度的减少基质对拉曼光谱的干扰，但醋醅中含有醇、酯、醛、酸等多种物质，会产生诸多干扰信号，掩盖黄曲霉毒素b1(afb1)特征拉曼峰。此外，醋醅中含有大量有机酸使拉曼检测纳米材料处于酸性环境，影响了修饰在纳米材料上的抗体/适配体，导致无法准确检测醋醅中的afb1。


技术实现要素：

4.针对以上技术问题，本发明的目的是建立一种抗干扰能力强、耐酸性条件的拉曼增强光谱检测方法，用于醋醅中黄曲霉毒素b1的检测，该方法解决了醋醅复杂成份和酸性环境制约afb1拉曼检测的问题。
5.为了实现上述目的，本发明的技术方案包括:聚乙烯亚胺(pei)修饰afb1适配体及其互补链；适配体桥接金(au)@4
‑
巯基甲基苯甲腈(mmbn)纳米双锥体与四氧化三铁(fe3o4)@au核壳纳米颗粒的复合检测材料的制备；afb1表面增强拉曼光谱检测体系的构建及标准曲线的建立；其中mmbn为4
‑
巯基甲基苯甲腈(4
‑
(mercaptomethyl)benzonitrile)。
6.本发明提供一种测定醋醅中黄曲霉毒素b1的拉曼增强光谱方法，具体包括以下步骤：
7.(1)绘制afb1标准曲线：
8.首先制备不同浓度的afb1标准溶液、afb1适配体互补链修饰的au@mmbn纳米双锥体胶体以及afb1适配体修饰的fe3o4@au核壳纳米颗粒胶体；
9.然后分别取不同浓度的afb1标准溶液，体积均相同，记为v1；分别与v2体积的afb1适配体互补链修饰的au@mmbn纳米双锥体胶体、v3体积的afb1适配体修饰的fe3o4@au核壳纳米颗粒胶体混合，得到不同浓度的混合胶体；并在室温下进行孵化，孵化后用磁铁分离得到结合物，用pbs溶液洗涤数次后，再用磁铁分离出结合物，最后复溶于pbs溶液中，其中复溶所用的pbs溶液的体积记为v4；最终得到不同浓度的结合物混合液；
10.最后取一定体积的结合物混合液滴加在硅片上，待干燥后利用拉曼光谱仪进行光谱扫描获得拉曼光谱图；以特征拉曼峰作为定量基准峰，测定定量基准峰位移处的拉曼峰强度值i，以afb1标准溶液浓度与其相对应的拉曼峰强度值i绘制标准曲线；
11.(2)待测样品溶液的制备：
12.称取醋醅，质量记为w，加入乙腈水溶液，常温条件下震荡提取，得到粗提液；将粗提液进行离心，收集上清液，作为待测液，记录体积v0，冷藏待用；
13.(3)待测液的拉曼检测：
14.取v1体积步骤(2)制备得到的待测液加入到v2体积afb1适配体互补链修饰的au@mmbn纳米双锥体胶体中，再加入v3体积afb1适配体修饰的fe3o4@au核壳纳米颗粒胶体，涡旋混合均匀并在室温下孵化后，用磁铁分离得到结合物，用pbs溶液洗涤数次后，再用磁铁分离出结合物复溶于pbs溶液中，得到结合物混合液，其中复溶所用的pbs溶液的体积记为v4；最后取结合物混合液滴加在硅片上，待干燥后利用拉曼光谱仪进行光谱扫描获得拉曼光谱图；
15.(4)定量测定：
16.根据步骤(3)得到的待测液的拉曼光谱图，以特征拉曼峰作为定量基准峰，测定定量基准峰位移处的拉曼峰强度值，并根据步骤(1)得到的afb1标准曲线得到的待测液中afb1的浓度，记为m，进一步根据公式计算出醋醅样品中afb1的含量x；
[0017][0018]
x：醋醅样品中afb1的含量，μg/kg；
[0019]
m：根据标准曲线得到的待测液中afb1的浓度，μg/l；
[0020]
v0：待测液体积，l；
[0021]
w：醋醅样品质量，kg。
[0022]
进一步地，步骤(1)中，afb1标准溶液浓度范围为0～5μg/l；所述v1、v2、v3和v4的体积比为1:1:1:1；所述结合物溶于pbs溶液中时，结合物与pbs溶液的用量比为0.1～0.5g：1ml。
[0023]
进一步地，步骤(1)中所述室温下孵化的时间为1～1.5h；所述结合物混合液滴加在硅片上的用量为2.5～5μl；所述特征拉曼峰为2227cm
‑1。
[0024]
进一步地，步骤(1)中，所述afb1适配体互补链修饰的au@mmbn纳米双锥体胶体和afb1适配体修饰的fe3o4@au核壳纳米颗粒胶体的具体制备过程如下：
[0025]
a、制备金种子液：将haucl4水溶液放入烘箱中加热干燥，然后加入二甘醇a(deg)，最后加入聚二烯丙基二甲基氯化铵(pdda,m
w
＝400000
‑
500000,20wt％)并搅拌，直至形成黄色的均匀溶液；然后加入二甘醇b(deg)，最后加入agno3，进行第二次搅拌，搅拌结束后放入油浴锅，加热后冷却至室温，然后加入水进行稀释，得到金种子液备用；
[0026]
进一步地，步骤(a)中，所述haucl4水溶液、二甘醇a、聚二烯丙基二甲基氯化铵、二甘醇b和agno3的用量比为5μl：10ml：0.25ml：3ml：6mg；所述haucl4水溶液的浓度为0.48m；
[0027]
进一步地，步骤(a)中，所述烘箱中加热的温度为125℃，时间为10～15min；所述第二次搅拌的时间为3～5min；所述油浴锅的温度为200～224℃，加热时间为30～40min；所述金种子液的浓度为0.000243mmol。
[0028]
其中二甘醇a和二甘醇b均为二甘醇，不同字母仅做名称上的区分。
[0029]
b、制备金纳米双锥体胶体：向步骤a制备的金种子液中加入水、deg、pdda、agno3和氨水，然后在搅拌条件下加入haucl4，得到混合溶液，放在烘箱中加热反应，反应后冷却到
室温，得到胶体；将胶体加入水中混合，得到混合液离心收集产物，然后再次加入水中进行离心洗涤数次；最后离心得到的产物分散到水中，得到金纳米双锥体胶体；
[0030]
进一步地，步骤(b)中，所述金种子液、水、deg、pdda、agno3、氨水和haucl4的用量比为1ml：0.5ml：0.5ml：8μl：0.00136mmol：10μl：0.001944～0.00243mmol；所述氨水的体积浓度为20％；
[0031]
所述烘箱中加热的温度为90℃，时间为2小时；所述胶体与水的体积比为1:9；所述离心的条件为10000r/min，时间为5～10min；所述最后离心得到的产物分散到水中，其产物与水的用量比为0.1～0.5g：10ml。
[0032]
c、pei修饰afb1适配体及其互补链：将afb1适配体和afb1适配体互补链分别溶解于pbs缓冲液中，得到afb1适配体混合溶液和afb1适配体互补链混合溶液，然后在两种混合溶液中均加入pei，超声分散均匀后放入水浴摇床进行振荡，振荡后得到pei修饰的afb1适配体溶液和pei修饰的afb1适配体互补链溶液，备用；
[0033]
进一步地，步骤(c)中，所述afb1适配体、afb1适配体互补链、pbs缓冲液的用量比为0.5g：0.5g：2ml；
[0034]
所述两种混合溶液与pei的用量关系均为1ml：1g；所述水浴摇床振荡的条件为：温度为25℃，转速为170r/min，振荡时间为24h。
[0035]
d、制备afb1适配体互补链修饰的au@mmbn纳米双锥体胶体：将步骤b制备的金纳米双锥体胶体和mmbn溶液混合，得到mmbn修饰的金纳米双锥体胶体；然后再加入步骤c中pei修饰的afb1适配体互补链溶液，进行孵育，孵育后通过离心收集沉淀，使用pbs溶液离心洗涤后，再次收集沉淀重新溶解于pbs溶液中，得到afb1适配体互补链修饰的au@mmbn纳米双锥体胶体；
[0036]
进一步地，步骤(d)中，所述金纳米双锥体胶体、mmbn溶液、afb1适配体互补链溶液的用量关系为1ml：10μl：20μl；所述mmbn溶液的浓度为1～10mmol，afb1适配体互补链溶液的浓度为50～400μm；
[0037]
所述孵育的温度为25℃，时间为12h；
[0038]
所述再次收集沉淀重新溶解于pbs溶液中，其沉淀与pbs溶液的用量关系为0.1～0.5g：10ml；
[0039]
所述离心的条件均为4℃、6000r/min，时间为5～10min。
[0040]
e、制备fe3o4@au核壳纳米颗粒胶体：将fecl3·
6h2o、fecl2·
4h2o和hcl溶解在双蒸水中，然后，在一定温度条件下进行搅拌，得到混合溶液a，滴加到naoh中，得到混合溶液b，使用永磁体分离混合溶液b中产物，即为fe3o4纳米颗粒，用双蒸水洗涤，洗涤后使用永磁体分离再次分离fe3o4纳米颗粒，重新悬浮在双蒸水中，得到fe3o4纳米颗粒胶体；
[0041]
将fe3o4纳米颗粒胶体和nh2oh
·
hcl溶解于tmaoh，经水浴加热至一定温度后加入haucl4，并且在一定时间内滴加柠檬酸三钠；之后进行加热搅拌，得到混合溶液c，使用永磁体分离混合溶液c中产物，得到的产物用双蒸水进行离心洗涤，洗涤后所得产物并重新溶解于双蒸水中，即得到fe3o4@au核壳纳米颗粒胶体；
[0042]
进一步地，步骤(e)中，所述fecl3·
6h2o、fecl2·
4h2o、hcl、双蒸水和naoh的用量比为5.2g：2g：0.84ml：25ml：250ml；所述hcl的浓度为12m；所述naoh的浓度为1.5m；所述一定温度条件为80℃；所述双蒸水使用前用氮气脱气，具体操作是：在双蒸水中通入氮气30～
60min；所述再次分离fe3o4纳米颗粒，重新悬浮在双蒸水中，其fe3o4纳米颗粒与双蒸水的用量关系为0.1～0.5g：100ml。
[0043]
所述fe3o4纳米颗粒胶体、nh2oh
·
hcl、tmaoh、haucl4和柠檬酸三钠的用量比为5ml：1.5ml：75ml：40ml：100ml；所述nh2oh
·
hcl的浓度为0.2m，所述tmaoh的浓度为0.01m，所述haucl4的质量浓度为0.1％，所述柠檬酸三钠的浓度为15mm；
[0044]
所述水浴加热至一定温度为80℃，所述在一定时间内滴加柠檬酸三钠的时间为2h；所述加热搅拌的温度为80℃，时间为3h；
[0045]
所述洗涤后所得产物并重新溶解于双蒸水中，其产物与双蒸水的用量关系为0.1～0.5g：50ml。
[0046]
f、制备afb1适配体修饰的fe3o4@au核壳纳米颗粒胶体：向步骤e制备的fe3o4@au核壳纳米胶体中加入步骤c修饰的afb1适配体溶液，并在室温下孵育，孵育后使用永磁体分离产物，并将收集的产物使用pbs溶液离心洗涤；洗涤后将收集底物重新溶解于pbs溶液中，得到afb1适配体修饰的fe3o4@au核壳纳米颗粒胶体。
[0047]
进一步地，步骤(f)中，所述fe3o4@au核壳纳米胶体、afb1适配体溶液的用量关系为1ml：20μl；所述afb1适配体的浓度为100～1000μm；所述室温下孵育的时间为4h；所述离心洗涤时底物与pbs溶液的用量关系为0.1～0.5g：10ml；
[0048]
所述最后将收集底物重新溶解于pbs溶液中，其底物与pbs溶液的用量关系为0.1～0.5g：1ml。
[0049]
进一步地，步骤(2)中，所述震荡条件为：150r/min，提取时间为5～30min；所述醋醅与乙腈水溶液的用量比为(1～25)g：(5～100)ml；所述乙腈水溶液中乙腈与水的体积比为84:16。
[0050]
进一步地，所述步骤(2)中，所述离心条件均为：转速4000～8000r/min，时间为3～10min。
[0051]
进一步地，步骤(3)中所述室温下孵化的时间为1～1.5h；所述结合物混合液滴加在硅片上的用量为2.5～5μl。
[0052]
进一步地，步骤(3)中所述v1、v2、v3和v4的体积比为1:1:1:1；所述结合物复溶于pbs溶液中时，结合物与pbs溶液的用量比为0.1～0.5g：1ml。
[0053]
进一步地，步骤(3)中，所述仪器参数条件如下：拉曼光谱仪发射激光波长为532nm，固定激光功率为5mw，扫描范围为500～2500cm
‑1，积分时间为1～10s，每个样扫描6次取平均值。
[0054]
与现有的技术相比，本发明的优点在于:
[0055]
(1)现有研究的afb1特征拉曼峰经常选取在1600cm
‑1处，而醋醅中复杂的成份会产生诸多杂质峰，导致afb1特征拉曼峰被掩盖。本发明利用mmbn对金纳米双锥体进行修饰，使其在2227cm
‑1处产生明显特征峰，避免了待测样品中其他物质的干扰。
[0056]
(2)醋醅中含有大量的有机酸，使修饰在纳米材料上的抗体/适配体失活，导致常规检测方法失效，无法有效进行检测。本发明通过利用pei对afb1适配体及其互补链进行修饰，使其在酸性环境下仍保持一定活性，实现了醋醅中afb1的有效检测；本发明将拉曼技术应用于醋醅中afb1的检测，检测速度快，结果准确(与hplc结果误差率小于10％)。
附图说明
[0057]
图1为afb1的标准品检测的拉曼光谱。
[0058]
图2为afb1的标准曲线图。
[0059]
图3为待测液中afb1的拉曼光谱图示例。
具体实施方式
[0060]
为了更清楚地说明本发明的内容，下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明。
[0061]
实施例1
[0062]
1、实验样品、主要试剂和仪器
[0063]
样品：采用6种不同发酵池中的醋醅作为检测对象。
[0064]
试剂：afb1标准品购置于北京百灵威科技有限公司，纯度大于98％。实验过程所使用的水均为去离子水，实验试剂均为分析纯。afb1适配体及其互补链购置于上海生工生物有限公司；afb1适配体:5
′‑6‑
fam
‑
gttgggcacgt
‑
gttgtctctctgtgtctcgtgcccttcgctaggcccac
‑3′
biotin；afb1适配体互补链:5
′‑
g acaacacgtgcccaac
‑3′‑
bhq1；
[0065]
仪器：便携式拉曼光谱仪(sr
‑
510pro，上海蔚海光学仪器公司)。
[0066]
2、绘制afb1标准曲线
[0067]
afb1适配体互补链修饰的au@mmbn纳米双锥体胶体和afb1适配体修饰的fe3o4@au核壳纳米颗粒胶体的具体制备过程如下：
[0068]
a、制备金种子液：将haucl4水溶液(0.48m，5μl)放入125℃烘箱中加热10min除去其中的水分，然后加入二甘醇(deg，10ml)，最后加入聚二烯丙基二甲基氯化铵(pdda,m
w
＝400000
‑
500000,20wt％,0.25ml)并剧烈搅拌，直至形成黄色的均匀溶液；然后加入deg(3ml)然后加入agno3(6mg)，并二次搅拌3min；搅拌结束后放入油浴锅，在200℃条件下加热30min后冷却至室温，然后加入水进行稀释，得到金种子液(0.000243mmol)备用；
[0069]
b、制备金纳米双锥体胶体：向步骤a制备的1ml金种子液中加入水(0.5ml)，deg(0.5ml)，pdda(8μl)，agno3(0.00136mmol)，氨水(10μl，体积浓度为20％)，然后在剧烈搅拌下加入haucl4(0.00243mmol)；将经过搅拌的混合液体密封在10ml的小瓶中，放在90℃的烘箱中加热，反应2小时后停止加热，冷却到室温，得到胶体；将1ml制备好的胶体与9ml水混合，用离心机(10000r/min)收集产物，然后再次分散到10ml水中，离心洗涤三次；最后离心的产物分散到10ml水中，得到金纳米双锥体胶体；
[0070]
c、pei修饰afb1适配体及其互补链：将afb1适配体和afb1适配体互补链分别溶解于pbs缓冲液中，得到afb1适配体混合溶液和afb1适配体互补链混合溶液，然后在两种混合溶液(均为2ml)中均加入pei(2g)，超声分散均匀后放入水浴摇床，于25℃、170r/min的条件下振荡24h；振荡后得到pei修饰的afb1适配体溶液和pei修饰的afb1适配体互补链溶液，4℃保存备用；
[0071]
d、制备afb1适配体互补链修饰的au@mmbn纳米双锥体胶体：将1ml步骤b制备的金纳米双锥体胶体和mmbn溶液(10μl，5mmol)混合，得到mmbn修饰的金纳米双锥体胶体。将步骤c修饰的afb1适配体互补链溶液(20μl，200μm)加入到上述au@mmbn纳米双锥体胶体中，在25
°
下孵育12h。接下来，通过离心(10000r/min，10分钟，4℃)除去过量的适配体。将所得沉
淀重新溶解于1ml，pbs溶液，得到afb1适配体互补链修饰的au@mmbn纳米双锥体胶体；
[0072]
e、制备fe3o4@au核壳纳米颗粒胶体：将fecl3·
6h2o(5.2g)、fecl2·
4h2o(2g)和hcl(0.84ml，12m)溶解在25ml双蒸水中(使用前用氮气脱气)。然后，在80℃下使用机械搅拌器剧烈搅拌下，得到混合溶液，将该溶液逐滴滴加到naoh(250ml,1.5m)中。所得的fe3o4纳米颗粒用永磁体分离，用400ml双蒸水洗涤，然后将清洗后的fe3o4纳米颗粒重新悬浮在100ml双蒸水中；得到fe3o4纳米颗粒胶体，将fe3o4纳米颗粒胶体(5ml)和nh2oh
·
hcl(1.5ml，0.2m)溶解于tmaoh(75ml，0.01m)，在水浴锅中加热到80℃。然后将haucl4(40ml，质量浓度0.1％)加入到混合液中，并且在2h内逐渐滴加柠檬酸三钠(100ml，15mm)；之后将混合物在80℃下搅拌3h，溶液颜色从黑色到深红棕色变化。使用永磁体分离孵育后底物，并将收集的底物用150ml双蒸水洗涤3次，并重新溶解在50ml双蒸水中，得到fe3o4@au核壳纳米胶体；
[0073]
f、制备afb1适配体修饰的fe3o4@au核壳纳米颗粒胶体：向步骤e制备的fe3o4@au核壳纳米颗粒胶体(1ml)中加入步骤c修饰的afb1适配体溶液(20μl，500μm)，并在室温下孵育4h。最后用磁铁分离、收集底物，并将收集的底物溶于pbs溶液离心洗涤三次；最后收集底物复溶于1ml的pbs溶液中，得到afb1适配体修饰的fe3o4@au核壳纳米颗粒胶体。
[0074]
(1)准确称取1mg，afb1标准品，用2ml乙腈溶解，制成标准母液，将标准母液分别用乙腈稀释，制备一系列不同浓度的afb1溶液(0.31、0.62、1.25、2.50、5.00μg/l)，置于4℃下避光保存。将1ml，afb1标准溶液、1ml，afb1适配体互补链修饰的au@mmbn纳米双锥体胶体和1ml，afb1适配体修饰的fe3o4@au核壳纳米颗粒胶体分别混合，并在室温下孵化1h，孵化结束后离心洗涤三次，将洗涤后的沉淀复溶于1ml的pbs溶液中，得到结合物混合液；最后结合物混合液滴加在硅片表面，待干燥后在500～2500cm
‑1范围内利用便携式拉曼光谱仪进行光谱扫描获得拉曼光谱图，并对谱图进行平滑和基线优化，图1为在532nm激发波长下afb1的标准曲线拉曼光谱图，横坐标是拉曼位移，纵坐标是拉曼信号。标准曲线如图2所示，得到在线性范围为0.31～5.00μg/l标准曲线的函数关系为：y＝
‑
1609.47*x 1114.97，相关系数r2＝0.9906，线性关系良好，可用于醋醅中afb1的定量分析。所述便携式拉曼光谱仪检测工作条件为：激光功率：5mw；积分时间：5s；平均次数：3；平滑参数：2。
[0075]
(2)待测醋醅样品溶液的制备
[0076]
称取10g醋醅于具塞锥形瓶中，加入乙腈水溶液50ml，常温条件下震荡提取30min，得到粗提液；震荡后再次离心，5000r/min下离心5min，收集上清液，冷藏待用。
[0077]
(3)待测液的拉曼检测
[0078]
取100μl，afb1适配体互补链修饰的au@mmbn纳米双锥体胶体，加入100μl步骤(2)制得的待测液，再加入100μl，afb1适配体修饰的fe3o4@au核壳纳米颗粒胶体混匀，并在室温下孵化1h后用磁铁分离得到结合物，用pbs溶液离心洗涤两次后，再用磁铁分离出结合物复溶于100μl的pbs溶液中，得到结合物混合液；最后取2.5μl结合物混合液滴加在硅片表面，在500～2500cm
‑1范围内利用便携式拉曼光谱仪进行光谱扫描获得拉曼光谱图，并对谱图进行平滑和基线优化图3为待测液在532nm激发波长的拉曼光谱图，横坐标是拉曼位移，纵坐标是拉曼峰强度。
[0079]
(4)定量测定
[0080]
基于步骤(3)的检测结果，得到待测液的拉曼光谱图，以2227cm
‑1±
3cm
‑1处的特征拉曼峰作为定量基准峰，根据afb1标准曲线和2227cm
‑1±
3cm
‑1处光谱对应峰强度计算出醋
醅样品中afb1的含量x；
[0081][0082]
x：醋醅样品中afb1的含量，μg/kg；
[0083]
m：根据标准曲线得到的待测液中afb1的浓度，μg/l；
[0084]
v0：待测液体积，l；
[0085]
w：醋醅样品质量，kg。
[0086]
(6)验证实验
[0087]
分别对六种待测液采用hplc法测定并计算醋醅样品中的afb1含量，以验证本发明方法测定结果的准确性。hplc检测afb1标准品，绘制afb1标准曲线。分别取4ml待测液经过免疫亲和柱子净化、洗脱后，吸取1.5ml经0.22μm滤膜过滤后进行液相色谱检测；以保留时间在12.8～13.1min的峰为目标峰，根据计算所得的峰面积之和和标准曲线对应的线性回归方程，计算得出待测液中的afb1浓度；拉曼检测方法与hplc测定的afb1含量如表1所示。不同醋醅样品的hplc测定值与拉曼光谱法之间的相对误差范围在2.74％～8.04％，均低于10％。结果表明：利用拉曼光谱法能够很好地得到醋醅样品中的afb1含量，其结果与hplc的结果高度近似。
[0088]
表1hplc法与拉曼光谱法测定结果比较
[0089][0090]
(7)afb1回收率和精密度加标回收结果
[0091]
选取1、3、6号醋醅样品，按实施方式中的步骤(3)，在超声提取过程中加入不同量的afb1标准品，制备未加标待测液和含afb1标品的待测液，再按照实施方式中的步骤(3)、(4)和(5)的检测方法操作，并计算出未加标及加标待测液中的afb1浓度，结果如表2所示：
[0092]
表2加标回收实验结果
[0093][0094]
由表2结果可知，回收率为91.61％到107.18％之间，数据结果表明本发明建立的检测方法可靠。
[0095]
综上，利用mmbn特征拉曼峰抗干扰能力强，以及经过pei修饰的适配体及其互补链在酸性环境下仍有较高活性，建立了afb1定量检测的表面增强拉曼检测方法，实现了醋醅中afb1的定量检测。
[0096]
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，本领域的普通技术人员可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的实质内容的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。