一种检测霜霉威的试纸条及其应用的制作方法

1.本发明涉及一种检测霜霉威的试纸条及其应用，具体涉及一种用于检测霜霉威的胶体金试纸条，其特别适用于烟叶(采后待烤烟叶、初烤烟叶)中霜霉威残留的检测。


背景技术：

2.霜霉威是一种具有局部内吸作用的低毒杀菌剂，属氨基甲酸酯类。对卵菌纲真菌有特效，可抑制病菌细胞膜的形成，减少孢子囊形成和游动孢子数量，从而达到防治病害的目的。果树的霜霉病、疫病、猝倒病有优异的效果，适用于叶面喷雾和土壤处理，霜霉威还具有促进作物生长的作用。霜霉威对高等动物低毒，对家兔眼睛和皮肤无刺激性。虽然霜霉威是高效低毒低残留产品，我国对于农作物中霜霉威的残留限量尚无明确标准可循，但是，美国出台的新规定要求霜霉威在果蔬上的残留量为2mg/kg。日本也对霜霉威规定了残留限量。这对我过农产品出口产生一定的影响，因此，检测霜霉威药物残留具有必要性。
3.检测霜霉威的方法有气相色谱法、高效液相色谱
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质谱/质谱法、液相色谱
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质谱/质谱法等。与上述方法相比，免疫化学检测法对药物检测具有快速、特异、灵敏、准确、可以批量监测、样品处理简单、能实现自动化操作等优点。而免疫化学法检测霜霉威的前提是需要具备针对霜霉威的抗体，本技术发明了霜霉威人工抗原制备方法，并将其应用于快速检测试纸条中，用时短，操作简单，成本较低，适用于基层单位大批量地检测样品。
4.鉴于上述情况，有必要研究一种检测霜霉威的试纸条及其应用以解决上述技术问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种检测霜霉威的试纸条及其应用，本发明的霜霉威残留检测试纸条灵敏度高、特异性强、操作简单、成本低、检测时间短。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.本发明的第一个方面提出了一种检测霜霉威的试纸条，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板，所述反应膜上包被有霜霉威半抗原
‑
载体蛋白偶联物的检测线和羊抗鼠抗抗体的质控线，所述结合物释放垫喷涂有霜霉威单克隆抗体
‑
胶体金标记物；
8.所述霜霉威半抗原的制备方法如下：
9.取霜霉威1.88g，加吡啶20ml溶解，加1，4
‑
环已烷二异氰酸酯2.49g，加三乙胺1.3ml，加热80℃反应3h，停止反应，旋蒸，除去吡啶和三乙胺，得到红色油状物，加乙醚/正己烷(v/v，1/15)35ml重结晶，得到环己烷异氰酸酯
‑
霜霉威半抗原产物1.13g，收率31.9％。
10.优选地，所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次粘贴在底板上。
11.优选地，所述结合物释放垫1/3～1/2被覆盖于样品吸收垫下。
12.优选地，所述霜霉威半抗原
‑
载体蛋白偶联物由霜霉威半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。
13.优选地，所述霜霉威单克隆抗体是以霜霉威半抗原
‑
载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到。
14.本发明的第二个方面在于提出了一种制备上述试纸条的方法，其包括以下步骤：
15.(1)制备喷涂有霜霉威单克隆抗体
‑
胶体金标记物的结合物释放垫；
16.(2)制备包被有霜霉威半抗原
‑
载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；
17.(3)将步骤(1)和步骤(2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。
18.具体地说，步骤包括：
19.s1、半抗原制备：将霜霉威与氯甲基甲基醚等物质经过一系列化学反应得到霜霉威半抗原；
20.s2、将霜霉威半抗原与载体蛋白偶联，得到霜霉威半抗原
‑
载体蛋白偶联物；
21.s3、用霜霉威半抗原
‑
载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到霜霉威单克隆杂交瘤细胞株；
22.s4、提取小鼠igg免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；
23.s5、用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；
24.s6、将步骤s3制备的霜霉威单克隆抗体加入步骤s5制备的胶体金中，得到霜霉威单克隆抗体
‑
胶体金标记物；
25.s7、将霜霉威单克隆抗体
‑
胶体金标记物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘1h后取出，置于干燥环境中保存备用；
26.s8、将霜霉威半抗原
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载体蛋白偶联物包被在反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线；
27.s9、将样品吸收垫用含0.5％牛血清白蛋白(体积分数)、ph为7.2、0.1mol/l磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；
28.s10、在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，样品吸收垫盖住结合物释放垫，最后切成3mm宽的小条，加塑料盒，真空包装，4～30℃条件下可保存12个月。
29.本发明的第三个方面是提供一种应用上述试纸条检测烟叶(采后待烤烟叶、初烤烟叶)中霜霉威残留的方法，包括步骤：
30.步骤a、用试纸条进行检测；
31.步骤b、分析检测结果。
32.本发明的霜霉威快速检测试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及竞争抑制免疫层析分析技术，将霜霉威单克隆抗体
‑
胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的霜霉威在流动过程中，与结合物释放垫上的霜霉威单克隆抗体
‑
胶体金标记物结合，形成药物
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抗体
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胶体金标记物。样本中的药物与反应膜检测线上的霜霉威半抗原
‑
载体蛋白偶联物竞争结合霜霉威单克隆抗体
‑
胶体金标记物，根据检测线红色条带有无或颜色深浅来判断待测样品液中是否含有霜霉威残留。
33.本发明检测时，样品经处理后滴入试纸条孔内，当霜霉威在样品中的浓度低于检测限或为零时，单克隆抗体
‑
胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的霜霉威半
抗原
‑
载体蛋白偶联物结合，在检测线(t)和质控线(c)内各出现一条红色条带；如果霜霉威在样品中的浓度等于或高于检测限，单克隆抗体
‑
胶体金标记物会与霜霉威全部结合，从而在t线处因为竞争反应不会与霜霉威半抗原
‑
载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。
34.相比于现有技术，本发明的有益效果在于：
35.(1)本发明的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。
36.(2)用本发明试纸条检测霜霉威残留的方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。
附图说明
37.图1为本发明试纸条剖面结构示意图；
38.图2为本发明霜霉威半抗原合成图；
39.图中：1
‑
样品吸收垫；2
‑
结合物释放垫；3
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反应膜；4
‑
吸水垫；5
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检测线；6
‑
质控线；7
‑
底板。
具体实施方式
40.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
41.实施例1：如图1所示，本实施例提出了霜霉威检测试纸条的制备方法，该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：
42.(1)制备喷涂有霜霉威单克隆抗体
‑
胶体金标记物的结合物释放垫；
43.(2)制备具有包被有霜霉威半抗原
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载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；
44.(3)将步骤(1)和(2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和pvc底板组装成试纸条。
45.具体地，检测霜霉威的试纸条，包括样品吸收垫1、结合物释放垫2、反应膜3、吸水垫4和底板7；反应膜3上包被有霜霉威半抗原
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载体蛋白偶联物的检测线5和羊抗鼠抗抗体的质控线6，所述结合物释放垫2喷涂有霜霉威单克隆抗体
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胶体金标记物；样品吸收垫1、结合物释放垫2、反应膜3、吸水垫4依次粘贴在底板7上。
46.下面对其进行详细描述：
47.1、霜霉威半抗原的制备
48.取霜霉威1.88g，加吡啶20ml溶解，加1，4
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环已烷二异氰酸酯2.49g，加三乙胺1.3ml，加热80℃反应3h，停止反应，旋蒸，除去吡啶和三乙胺，得到红色油状物，加乙醚/正己烷(v/v，1/15)35ml重结晶，得到环己烷异氰酸酯
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霜霉威半抗原产物1.13g，收率31.9％；环己烷异氰酸酯
‑
霜霉威半抗原产物合成图如图2所示。
49.2、免疫原的制备
50.取环己烷异氰酸酯
‑
霜霉威半抗原产物13mg，加1mldmso溶解澄清，得到半抗原溶液，记为a液；取牛血清白蛋白(bsa)50mg，加0.1m cb9.5 6ml溶解，得到b液，将a液逐滴滴加
到b液中，室温反应4h，停止反应，0.02m pbs透析纯化3天，每天换液3次，离心分装，得到霜霉威
‑
bsa偶联物，即为免疫原。
51.3、包被原的制备
52.取环己烷异氰酸酯
‑
霜霉威半抗原产物7.8mg，加1mldmso溶解澄清，得到半抗原溶液，记为a液；取卵清白蛋白(ova)50mg，加0.1m cb9.5 6ml溶解，得到b液，将a液逐滴滴加到b液中，室温反应4h，停止反应，0.02m pbs透析纯化3天，每天换液3次，离心分装，得到霜霉威
‑
ova偶联物，即为包被原。
53.以霜霉威为原料，活泼型较高的1，4
‑
环已烷二异氰酸酯在吡啶与三乙胺的环境中，加热，经酰基化反应，在亚胺处引入环己烷异氰酸酯，偶联蛋白进行免疫，制备针对霜霉威的特异性抗体。
54.4、霜霉威单克隆抗体的制备
55.(1)动物免疫
56.将步骤2得到的免疫原注入balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。
57.(2)细胞融合和克隆化
58.取免疫balb/c小鼠脾细胞，按8:1(数量配比)比例与sp2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争elisa法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
59.(3)细胞冻存和复苏
60.将杂交瘤细胞用冻存液制成1
×
106个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
61.(4)单克隆抗体的制备与纯化
62.增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸
‑
饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，
‑
20℃保存。
63.所述细胞培养基为向rpmi1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(质量分数)，碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％(质量分数)；所述细胞培养基的ph为7.4。
64.5、羊抗鼠抗抗体的制备
65.以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。
66.6、霜霉威单克隆抗体
‑
胶体金标记物的制备
67.(1)胶体金的制备
68.用双蒸去离子水将1％氯金酸稀释成0.01％(质量分数)，取100ml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.5ml1％柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。
69.(2)霜霉威单克隆抗体
‑
胶体金标记物的制备
70.在磁力搅拌下，用0.2mol/l碳酸钾溶液调胶体金的ph值至7.0，按每毫升胶体金溶液中加入20～50μg的标准向胶体金溶液中加入霜霉威单克隆抗体，继续搅拌混匀30min，加
入10％bsa，使其在胶体金溶液中的终浓度为1％(体积分数)，静置10min。12000r/min、4℃离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。
71.复溶缓冲液：含酪蛋白0.02％～0.1％(质量分数)、吐温
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80 0.05％～0.2％(质量分数)、ph7.2的0.02mol/l磷酸盐缓冲液。
72.7、结合物释放垫的制备
73.将结合物释放垫浸泡于含有牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在缓冲液中的浓度为0.5％)、ph为7.2、0.5mol/l的磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿1h，37℃烘3h备用。用isoflow喷膜仪将制备好的霜霉威单克隆抗体
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胶体金标记物均匀喷涂在结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫喷涂0.01ml霜霉威单克隆抗体
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胶体金标记物后，置于37℃环境中(湿度＜20％)60min后取出，置于干燥环境(湿度＜20％)中保存备用。
74.8、反应膜的制备
75.将霜霉威半抗原
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卵清蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线。
76.包被过程：用磷酸缓冲液将霜霉威半抗原
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卵清蛋白偶联物稀释到10mg/ml，用isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(t线)，包被量为0.8μl/cm；用0.01mol/l、ph7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/ml，用isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(c线)，包被量为1.0μl/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。
77.9、样品吸收垫的制备
78.将样品吸收垫置于含0.5％牛血清白蛋白(体积分数)、ph7.2、0.1mol/l磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37℃烘2h备用。
79.10、试纸条的组装
80.将样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次按顺序粘贴在pvc底板上；结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与反应膜的始端连接，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与pvc底板的始端对齐，吸水垫的末端与pvc底板的末端对齐；所述反应膜上有检测线和质控线，检测线(t线)和质控线(c线)均为与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测线位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控线位于远离结合物释放垫的末端的一侧；将试纸条用机器切成3mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，4～30℃条件下可保存12个月。
81.实施例2：本实施例提出了烟叶中霜霉威残留的检测方法，下面对其进行详细描述：
82.1、用试纸条进行检测
83.用吸管吸取待检样品溶液垂直滴加3滴于加样孔，液体流动时开始计时，反应5～10min，判定结果。
84.2、分析检测结果
85.通过胶体金分析仪(简称“分析仪”)读取结果：
86.阴性(
‑
)：表示样品中待测物质浓度低于检测限；
87.阳性( )：表示样品中待测物质浓度等于或高于检测限；
88.无效：表示需要重新测试。
89.实施例3：本实施例提出了样品检测实例，下面对其进行详细描述：
90.1、检测限试验
91.取空白烟叶(采后待烤烟叶、初烤烟叶)样本，在其中分别添加霜霉威至终浓度为5、10、20mg/kg，取试纸条进行检测，每个样本重复测定三次。
92.用试纸条检测烟叶(采后待烤烟叶、初烤烟叶)样本时，当其中霜霉威添加浓度为5mg/kg时，分析仪显示为阴性；当其中霜霉威添加浓度为10、20mg/kg时，分析仪显示为阳性。
93.2、假阳性率、假阴性率试验
94.取已知霜霉威含量为10mg/kg的烟叶(采后待烤烟叶、初烤烟叶)阳性样本各20份和含量小于5mg/kg的烟叶(采后待烤烟叶、初烤烟叶)阴性样本各20份，用三批试纸条进行检测，计算其阴阳性率。结果见表1。
95.表1烟叶(采后待烤烟叶、初烤烟叶)检测样本结果
[0096][0097]
结果表明：用3个批次生产的试纸条检测阳性烟叶(采后待烤烟叶、初烤烟叶)样本时，结果全为阳性，可知阳性样本符合率为100％，假阴性率为0；检测20份阴性烟叶(采后待烤烟叶、初烤烟叶)样本时，结果全为阴性，可知阴性符合率为100％，假阳性率为0。说明本发明的检测霜霉威的试纸条可以对烟叶(采后待烤烟叶、初烤烟叶)中霜霉威残留进行快速检测。
[0098]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0099]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。