基于标志物的经动脉化疗栓塞术疗效的预测产品及其应用的制作方法

1.本发明属于生物医学领域，具体涉及基于标志物的经动脉化疗栓塞术疗效的预测产品及其应用。


背景技术：

2.肝癌(hepatocellular carcinoma，hcc)是世界上死亡率和发病率最高的恶性肿瘤之一。早期肝癌以手术切除为主，但肝癌起病隐匿、恶性程度高，患者就诊时多已属中晚期，手术切除成功率低，多采用非手术治疗。并且，我国肝癌患者90％以上有乙肝感染背景和合并肝硬化、肝功能不全、肿瘤多中心发生以及早期扩散和转移，仅有20％
‑
30％左右的患者能够获得手术切除机会。
3.随着血管介入放射学的发展，经动脉化疗栓塞术(tace，transarterial chemoembolization)已经成为公认的肝癌非手术治疗的首选方法。常规的tace是将导管插管至肝脏肿瘤(liver tumor)的供血动脉内，先采用带有化疗药物的碘化油乳剂对肝癌供血动脉末梢进行栓塞，然后选择明胶海绵、空白微球和聚乙烯醇等颗粒栓塞剂加强栓塞效果。
4.由于肝癌的血液供应95％～99％来自肝动脉，正常肝组织的血供25％～30％来自肝动脉，而70％～75％来自门静脉，栓塞肝动脉可有效阻断肿瘤的血供，使其缩小坏死，而对肝组织血管影响较小；经动脉注入化疗药物可提高肿瘤局部的药物浓度，在提高治疗效果的同时减轻药物对全身的毒副作用。tace创伤小、副反应轻、可以反复多次治疗、提高生存质量，延长生命。tace联合其他治疗有可能成为外科手术的替代治疗，为不可通过手术切除肿瘤手术的患者带来新的希望。
5.一般认为有以下情况的患者不适合接受tace治疗：
①
严重的肝功能障碍：包括严重黄疸、肝性脑病、难治性腹水或肝肾综合征；
②
无法纠正的凝血功能严重减退；
③
癌栓塞门静脉主干，侧支血管形成少，难以恢复门静脉主干流向肝脏的血流；
④
合并活动性肝炎或严重感染且不能同时治疗；
⑤
肿瘤弥漫或远处广泛转移，预期生存期<3个月；
⑥
ecog评分>2分、恶液质或多脏器功能衰竭；
⑦
肾功能障碍，肌酐>176.8μmol/l或者肌酐清除率<30ml/min；
⑧
化疗引起的外周血白细胞和血小板减少，白细胞<3.0
×
109/l、血小板<50
×
109/l且不能纠正；
⑨
严重碘对比剂过敏。


技术实现要素：

6.为了在进行tace治疗之前预测患者对于tace治疗的反应，本发明通过对比对tace治疗的反应组患者和非反应组患者的基因表达谱，筛选到差异表达基因，检测差异表达基因的表达量，可以尽早预测患者对tace治疗的反应；进一步的，将多个差异表达基因联合可以更为准确的预判患者对tace治疗的反应，从而决定是否要接受tace治疗。
7.标志物组合
8.一方面，本发明提供了一种预测患者对tace治疗的反应的标志物组合，所述标志
red等)、rox、alexafluor染料、atto染料、dylight染料、cyanine染料(如cy2，cy3，cy3.5，cy3b，cy5，cy5.5，cy7，cy7.5)、fluoprobes染料、sulfocy染料、seta染料、iris染料、setau染料、srfluor染料、square染料。
29.优选地，所述淬灭基团包括但不限于3'
‑
bbq
‑
650、bhq
‑
0、bhq
‑
1、bhq
‑
2、bhq
‑
3、bhq
‑
1、bhq
‑
2、bhq
‑
3、atto 540q、atto 575q、atto 612q。
30.优选地，所述产品中还包括收集和/或处理样品的试剂。
31.优选地，所述样品包括：血清、血浆、全血、尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊髓液、泪液、鼻上皮细胞、痰、组织、粘液、淋巴、胞液、腹水、胸膜积液、羊水、膀胱冲洗液和支气管肺泡灌洗液。
32.优选地，所述样品是组织。
33.优选地，所述样品是肿瘤组织。更优选地，肝癌肿瘤组织。
34.优选地，所述处理样品的试剂包括从样品中提取dna的试剂。
35.优选地，所述提取dna的提取试剂可包括裂解缓冲液、结合缓冲液、清洗缓冲液和洗脱缓冲液。裂解缓冲液通常由蛋白变性剂、去垢剂、ph缓冲剂和核酸酶抑制剂组成。结合缓冲液通常由蛋白变性剂和ph缓冲剂组成。清洗缓冲液分为清洗缓冲液a和清洗缓冲液b：清洗缓冲液a由蛋白质变性剂、核酸酶抑制剂、去垢剂、ph缓冲剂和乙醇组成；清洗缓冲液b由核酸酶抑制剂、ph缓冲剂和乙醇组成。洗脱缓冲液通常由核酸酶抑制剂和ph缓冲剂组成。所述蛋白变性剂选自异硫氰酸胍、盐酸胍和尿素中的一种或多种；去垢剂选自tween20、igepal ca
‑
630、triton x
‑
100、np
‑
40和sds中的一种或多种；ph缓冲剂选自tris、硼酸、磷酸盐、mes和hepes中的一种或多种；核酸酶抑制剂选自edta、egta和depc中的一种或多种。
36.术语“患者”、“生物受试者”、“受试者”、“个体”在本文中可互换使用来指动物受试者，特别是脊椎动物受试者，更特别是哺乳动物受试者。落在本发明的范围内的合适的脊椎动物包括但不限于脊索动物亚门的任何成员，包括灵长目动物、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠)、兔形目动物(例如，家兔、野兔)、牛科动物(例如，牛)、绵羊类动物(例如，绵羊)、山羊类动物(例如，山羊)、猪类动物(例如，猪)、马科动物(例如，马)、犬科动物(例如，狗)、猫科动物(例如，猫)、鸟类动物(例如，鸡；鸭；鹅；陪伴鸟类，诸如金丝雀、虎皮鹦鹉等)、海洋哺乳动物(例如，海豚、鲸鱼)、爬行动物(例如，蛇、青蛙、蜥蜴等)和鱼。优选的受试者是灵长目动物(例如，人、猿、猴、黑猩猩)。如本文所优选的，所述“患者”患有肝癌。
37.试剂盒
38.另一方面本发明提供了一种预测患者对tace治疗的反应的试剂盒，所述试剂盒包括前述检测hilpda、lin28b、slain1中任意一种或多种的表达量的试剂。
39.优选地，所述试剂盒中还可以包含以下任意一种或多种：mrna表达量辅助检测试剂、蛋白表达量辅助检测试剂、mrna表达量辅助检测仪器、蛋白表达量辅助检测仪器。
40.优选地，所述mrna表达量辅助检测试剂包括但不限于：使所述引物对应的扩增子可视化的反应试剂，例如通过琼脂糖凝胶电泳法、酶联凝胶法、化学发光法、原位杂交法、荧光检测法等使扩增子可视化的试剂，rna提取试剂，逆转录试剂，cdna扩增试剂，制备标准曲线所用的标准品，阳性对照品，阴性对照品。
41.优选地，所述蛋白表达量辅助检测试剂包括但不限于：封闭液，抗体稀释液，洗涤缓冲液，显色终止液，制备标准曲线的标准品。
42.系统
43.另一方面本发明提供了一种预测患者对tace治疗的反应的系统，所述系统包括根据受试者的前述hilpda、lin28b、slain1中任意一种或多种的表达量的检测结果预测患者对tace治疗的反应的计算装置。
44.优选地，所述系统包括用于输入前述hilpda、lin28b、slain1中任意一种或多种的表达量的输入装置。
45.优选地，所述系统还可以包括用于输出结果的输出装置。
46.优选地，所述系统还可以包括检测mrna表达量和/或蛋白表达量的检测装置。
47.优选地，所述检测装置包括实时定量pcr仪、高通量测序平台、检测芯片和芯片信号读取器。
48.优选地，所述系统还包括评估结果发送装置，所述评估结果发送装置可以将受试者的评估结果发送到患者或医护人员可以查阅的信息通信终端装置。
49.方法
50.另一方面，本发明提供了一种预测患者对tace治疗的反应的方法，所述方法包括通过前述hilpda、lin28b、slain1中任意一种或多种的表达量的检测结果预测患者对tace治疗的反应的步骤。
51.优选地，所述方法还包括检测受试者的基因表达量的步骤。
52.优选地，所述方法包括以下步骤：
53.1)收集患者的癌组织；
54.2)检测前述hilpda、lin28b、slain1中任意一种或多种的表达量；
55.3)根据2)的检测结果预测患者对tace是否会有反应，也就是是否会响应tace治疗。
附图说明
56.图1是差异分析结果图，a：hilpda，b：lin28b，c：slain1；纵坐标是基因表达量，nr是无反应组，r是反应组。
57.图2是hilpda、lin28b、slain1或其组合在预测患者对tace治疗反应的roc结果图，a：hilpda，b：lin28b，c：slain1，d：hilpda lin28b，e：lin28b slain1，f：hilpda slain1；纵坐标是灵敏性，横坐标是特异性。
58.图3是hilpda lin28b slain1在预测患者对tace治疗反应的roc结果图；纵坐标是灵敏性，横坐标是特异性。
具体实施方式
59.下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
60.实施例、筛选差异表达基因并验证其预测效果
61.在肝癌患者进行tace治疗之前，收集肿瘤活检样本，手术后，根据患者是否对tace
治疗有反应，将患者分为反应组(r，responder)或无反应组(nr，non
‑
responder)，对比反应组患者和无反应组患者的基因表达谱，即可获得潜在的可以预测对tace治疗的反应的标志物。本研究的数据来源是：gse104580，该数据集中non
‑
responder：responder＝66:81。
62.用r语言limma包进行差异分析，得到差异表达基因，筛选标准为：adj.p.val<0.05，|logfc|>1。差异表达基因如表1和图1所示。
63.表1.基因表达情况
[0064] logfc平均表达量adj.p.valhilpda
‑
1.4446601077.4909787078.00e
‑
07lin28b
‑
2.6737086774.4037848785.26e
‑
06slain1
‑
1.2990822956.2421935370.000382839
[0065]
使用r语言proc包绘制受试者工作曲线(roc)，计算auc值、敏感性和特异性，判断标志物的预测效能。roc曲线如图2所示，auc值如表2
‑
3所示(本发明中“ ”或“_”都表示联合，可以互换使用)。
[0066]
表2.标志物或标志物组合的auc值
[0067]
标志物/组合auchilpda0.800lin28b0.729slain10.706hilpda_lin28b0.834lin28b_slain10.769hilpda_slain10.835hilpda_lin28b_slain10.858
[0068]
以上结果说明，在临床中，以上标志物的检测结果可以为患者是否要接受tace治疗提供决定依据。