小分子抗体及其编码基因和制备方法及应用和药物组合物与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种小分子抗体及其编码基因和制 备方法及应用和药物组合物。


背景技术：

2.严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,sars)又称为
ꢀ“
非典型肺炎”，是由sars冠状病毒(sars
‑
cov)引起的急性呼吸道传染 病，开发抗sars冠状病毒产品对于sars的预防和治疗具有十分重要的意 义。
3.一般而言，疫苗是对于病毒性传染病而言最有效的预防手段之一，然而， 迄今为止仍然没有sars冠状病毒疫苗上市推广，这使得目前针对sars的 防治手段十分匮乏。研究表明，sars疫苗研发进展困难不仅是因为自2003 年后再未出现sars疫情导致对该疫苗的需求和研发必要性的下降造成的， 更是由于sars冠状病毒本身的一些特性导致了疫苗开发困难造成的。因此， 研发其他类型的抗病毒产品用于sars防治就显得尤为迫切。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺少针对sars冠状病毒的抗 病毒产品，从而使得对sars的防治手段匮乏的问题，提供一种小分子抗体 及其编码基因和制备方法及应用和药物组合物。本发明提供的小分子抗体能 够特异性结合sars冠状病毒受体结合区，对sars冠状病毒具有良好的中 和性，可以在sars预防和治疗工作中发挥重要作用。
5.为了实现上述目的，本发明一方面提供一种小分子抗体，所述抗体包括：
6.(1)氨基酸序列如seq id no:1所示的蛋白质；
7.(2)氨基酸序列如seq id no:1所示的蛋白质经改造获得的与改造前 具有相同活性的衍生蛋白质。
8.本发明第二方面提供编码前述小分子抗体的基因。
9.本发明第三方面提供一种制备如前所述的小分子抗体的方法，所述方法 包括：将含有前述基因的重组载体导入宿主细胞，表达获得所述小分子抗体。
10.本发明第四方面提供含有如前所述的基因的重组载体、表达盒和表达载 体。
11.本发明第五方面提供扩增如前所述的基因或其片段的引物。
12.本发明第六方面提供如前所述的小分子抗体、基因、重组载体、表达盒 和表达载体或引物在制备针对严重急性呼吸综合征冠状病毒的抗病毒产品 中的应用。
13.本发明第七方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包括如前所述的 小分子抗体、基因或重组载体、表达盒和表达载体。
14.本发明提供的小分子抗体通过分子生物学方法构建获得，经实验验证， 其与sars冠状病毒的受体结合区(receptor
‑
binding domain,rbd)具有很 强的反应性，且对sars冠状病毒具有良好的中和活性。这表明该小分子抗 体能够(单独或与其他抗体配合)作为活性组分，发挥对sars冠状病毒的 防治作用。
附图说明
15.图1为本发明实施例1中获得的表达载体pcold i
‑
nano
‑
anti
‑
srbd的测 序结果。
16.图2为本发明实施例1中获得的纯化样品的sds
‑
page结果。
17.图3为本发明实施例1中获得的浓缩nano
‑
anti
‑
srbd蛋白样品的 sds
‑
page结果。
18.图4为本发明实施例2中获得的elisa检测结果示意图。
19.图5为本发明实施例3中获得的对sars冠状病毒假病毒的中和活性检 测结果示意图。
具体实施方式
20.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这 些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各 个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点 值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视 为在本文中具体公开。
21.本发明中，“sars”为“严重急性呼吸综合征”的简写形式，其二者含义 相同，可以互换使用。
22.单域重链抗体(the variable domain of the heavy
‑
chain of heavy
‑
chainantibody,vhh)是由重链可变区结合抗原的单一结构域构成的小分子抗体， 是具有完整的抗原结合活性的单一折叠单元。单域重链抗体的制备方法简单， 能够采用大肠杆菌等工程菌进行表达生产，而且与具有轻链和重链的完整结 构的抗体相比，单域重链抗体的分子(量)小，更易通过血管壁，更利于发 挥治疗作用，而且能与分布于病毒表面凹槽的抗原结合，更利于病毒性疾病 的防治。
23.本发明的发明人在研究的过程中巧妙地通过分子生物学方法构建了一 种针对sars冠状病毒的单域重链抗体(氨基酸序列如seq id no:1所示)， 该抗体能够与sars冠状病毒的受体结合域特异性结合，并且具有良好的sars冠状病毒中和性，从而具有应用于sars冠状病毒防治相关产品研发 的潜力。
24.本发明一方面提供一种小分子抗体，所述抗体包括：
25.(1)氨基酸序列如seq id no:1所示的蛋白质；
26.(2)氨基酸序列如seq id no:1所示的蛋白质经改造获得的与改造前 具有相同活性的衍生蛋白质。
27.本发明提供的小分子抗体可以是在活性相同的情况下，将上述蛋白质(1) 进行任意本领域现有方式的改造获得的衍生蛋白质，对于其改造方法和改造 后的衍生蛋白质的具体序列和特性没有特别限定。
28.根据本发明的优选实施方式，其中，所述改造可以包括：
29.i、将seq id no:1所示的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸残基进行 取代、缺失和添加中的至少一种；和/或
30.ii、在seq id no:1所示的氨基酸序列的n末端和/或c末端连接便于 纯化的标签和/或利于蛋白分泌表达的信号肽序列；和/或
31.iii、将seq id no:1所示的氨基酸序列进行人源化改造。
32.本发明中，改造方式iii可以采用任意本领域现有的对蛋白质(尤其是 单域重链
抗体)进行人源化改造的方式。优选地，可以通过将seq id no:1 所示的氨基酸序列的编码基因进行人源化改造实现。
33.本发明提供的小分子抗体可以通过将seq id no:1所示的氨基酸序列 经过上述改造方式i、ii和iii中的任意一种或几种的组合处理获得，只要改 造后的衍生蛋白质具有与seq id no:1所示的氨基酸序列相同的活性即可。
34.任意本领域现有的能够方便蛋白质纯化的标签均可适用于本发明提供 的小分子抗体。优选地，所述便于纯化的标签选自poly
‑
arg、poly
‑
his、flag、 strep
‑
tag ii和c
‑
myc中的至少一种。上述标签的具体氨基酸序列没有特别限 制，例如可以为如下表1中所示的序列。
35.表1便于纯化的标签序列
36.标签残基数/个序列poly
‑
arg5*rrrrr(seq id no:7)poly
‑
his6**hhhhhh(seq id no:8)flag8dykddddk(seq id no:9)strep
‑
tag ii8wshpqfek(seq id no:10)c
‑
myc10eqkliseedl(seq id no:11)
37.*poly
‑
arg可以由5
‑
6个精氨酸残基组成，表1中仅列出了通常采用的 5个精氨酸残基组成的poly
‑
arg标签，但是6个精氨酸残基组成的poly
‑
arg 标签也可适用于本发明。
38.**poly
‑
his可以由2
‑
10个组氨酸残基组成，表1中仅列出了通常采用 的6个组氨酸残基组成的poly
‑
his标签，但是2
‑
10个组氨酸组成的poly
‑
his 标签均可适用于本发明。
39.任意本领域现有的能够利于蛋白分泌表达的信号肽序列均可适用于本 发明提供的小分子抗体。优选地，所述信号肽序列选自人il
‑
2sp、cd5 sp、 人igg2 h sp、人胰凝乳蛋白酶原sp、人胰蛋白酶原
‑
2sp、人胰岛素sp。
40.本发明第二方面提供编码如上所述的小分子抗体的基因。
41.任意能够编码如上所述的小分子抗体的基因均属于本发明的内容。根据 本发明的优选实施方式，其中，所述基因包括：
42.a、编码区核苷酸序列如seq id no:2所示的dna分子；和/或
43.b、编码区核苷酸序列如seq id no:3所示的dna分子；和/或
44.c、与dna分子a或b具有至少70％同源性，并编码具有相同功能的蛋 白质的dna分子；和/或
45.d、dna分子a或b经突变或改造获得的编码具有相同功能的蛋白质的 dna分子。
46.本发明中，上述dna分子a可以仅包含seq id no:2所示的序列，也 可以是以seq id no:2所示的序列为编码区，并额外添加其他组件的dna 分子。所述其他组件可以包括任意本领域用于人工合成基因序列并通过表达 载体进行表达时所需的组件，例如启动子、增强子、kozak序列等。
47.本发明中，上述dna分子b可以仅包含seq id no:3所示的序列，也 可以是以seq id no:3所示的序列为编码区，并额外添加其他组件的dna 分子。所述其他组件可以包括任意本领域用于人工合成基因序列并通过表达 载体进行表达时所需的组件，例如启动子、增强子、kozak序列等。
48.优选地，上述dna分子c与dna分子a或b具有至少75％、至少80％、 至少85、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％ 同源性，并且编码具有相同功能的蛋白质。所述“具有相同功能的蛋白质”的 氨基酸序列与dna分子a或b所编码的蛋白质的氨基酸序列可以相同，也 可以不同。
49.本发明中，上述dna分子d可以经过任意本领域现有的基因突变或改 造方式获得，只要最终获得的dna分子d所表达的蛋白质与dna分子a 或b所表达的蛋白质的功能相同即可。
50.根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述dna分子d可以通过将 其他dna分子在严格杂交条件下与dna分子a或b杂交获得。
51.优选地，所述其他dna分子可以为任意不影响dna分子a或b功能， 且杂交获得的dna分子d的表达产物仅为与dna分子a或b表达产物具有 相同功能的蛋白质的dna分子。
52.优选地，所述严格杂交条件可以为在60
‑
70℃(最优选65℃)的温度下， 于杂交溶液中进行杂交，然后用洗膜溶液进行洗膜。
53.更优选地，所述杂交溶液为含有0.1
‑
1重量％十二烷基硫酸钠(sds)的 柠檬酸钠缓冲液(ssc缓冲液)，优选所述scc缓冲液为氯化钠和柠檬酸 钠的水溶液，其中氯化钠浓度为0.8
‑
1m，柠檬酸钠浓度为0.08
‑
0.1m。
54.优选地，所述洗膜采用分步操作的方式进行，且每步采用不同的洗膜溶 液。优选采用如下方式进行分步洗膜：
55.第一洗膜：采用含有0.01
‑
0.2重量％sds的scc缓冲液作为第一洗膜溶 液洗膜一次，所述scc缓冲液中氯化钠浓度为0.2
‑
0.4m，柠檬酸钠的浓度 为0.02
‑
0.04m。
56.第二洗膜：采用含有0.01
‑
0.2重量％sds的scc缓冲液作为第二洗膜溶 液洗膜一次，所述scc缓冲液中氯化钠浓度为0.1
‑
0.2m，柠檬酸钠的浓度 为0.01
‑
0.02m。
57.更优选地，第一洗膜溶液和第二洗膜溶液中的sds含量相同。
58.更优选地，第一洗膜溶液采用的scc缓冲液浓度高于第二洗膜溶液， 优选第一洗膜溶液采用的scc缓冲液的浓度是第二洗膜溶液采用的scc缓 冲液浓度的1.5
‑
2.5倍。
59.本发明第三方面提供一种制备如前所述的小分子抗体的方法，其特征在 于，所述方法包括：将含有如上所述的基因的重组载体导入宿主细胞，表达 获得所述小分子抗体。
60.任意本领域中能够插入上述基因，并在宿主细胞中表达所述小分子抗体 的重组载体均可适用于本发明。根据本发明的优选实施方式，其中，所述重 组载体选自pcold i载体、pqe30载体、pet32a载体、pcdna3.1载体和ppicz 载体中的至少一种。优选为pcold i载体。
61.任意本领域用于表达外源性基因的宿主细胞均可适用于本发明。根据本 发明的优选实施方式，其中，所述宿主细胞选自大肠杆菌、293t细胞和酵 母菌中的至少一种。
62.根据本发明的优选实施方式，其中，所述方法还包括对表达获得的小分 子抗体进行纯化的方法。
63.任意本领域用于纯化宿主细胞表达的外源性蛋白的方法均可适用于本 发明。例如，可以利用载体中或所述小分子抗体中带有的便于纯化的标签(如 表1中的标签)进行纯化。
64.本发明第四方面提供含有如前所述的基因的重组载体、表达盒和表达载 体。
65.本发明中，任意含有如前所述的基因的重组载体或表达盒均属于本发明 的保护范围，本领域技术人员可以根据实际情况对其进行具体选择和调整。
66.本发明中，任意含有如前所述的基因的表达载体均属于本发明的保护范 围。优选地，所述表达载体包括(含有如前所述的基因的)转基因细胞系、 重组菌和重组酵母中的至少一种。
67.本发明第五方面提供扩增如前所述的基因或其片段的引物。
68.本发明中，所述引物用于扩增如前所述的基因(例如前述dna分子a、 dna分子b、dna分子c和dna分子d)的全长序列，或用于扩增如前所 述的基因中的任意长度的片段(例如扩增其中的编码区，即核苷酸序列如 seq id no:2或seq id no:3所示的dna分子，或扩增其中含有编码区和 部分非编码区的片段)。
69.本发明第六方面提供如前所述的小分子抗体、基因、重组载体、表达盒 和表达载体或引物在制备针对sars冠状病毒的抗病毒产品中的应用。
70.本发明中，所述在制备针对sars冠状病毒的抗病毒产品中的应用可以 包括利用如前所述的小分子抗体、基因、重组载体、表达盒和表达载体或引 物进行所述抗病毒产品的研发和/或生产。
71.本发明第七方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包括如前所述的 小分子抗体、基因或重组载体、表达盒和表达载体。
72.优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。所述辅料可以为 任意本领域现有的用于药物组合物制备的辅料，只要该辅料不影响活性组分(即如前所述的小分子抗体、基因或重组载体、表达盒和表达载体)的功能 和作用即可。
73.本发明提供的药物组合物中，可以仅以如前所述的小分子抗体(或其编 码基因或重组载体、表达盒和表达载体)作为活性组分，也可以将其与其他 抗体(或药物)配合作为活性组分。所述其他抗体(或药物)可以是本领域 中任意抗sars冠状病毒的抗体(或药物)，也可以是本领域中任意能够调 节前述小分子抗体功能的抗体(或药物)，还可以是与sars相关的衍生疾 病防治有关的抗体(或药物)。
74.以下将通过实施例对本发明进行详细描述。应当能够理解的是，以下实 施例仅用于示例性地解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明的范围。
75.以下实施例中采用的基因片段均为委托金斯瑞公司合成。未经特殊说明 的情况下，采用的试剂均购自正规化学或生物试剂供应商，纯度为分析纯。
76.实施例1
77.本实施例用于说明小分子抗体nano
‑
anti
‑
srbd的表达和鉴定。
78.(一)表达载体构建
79.发明人设计了seq id no:2所示的核苷酸序列作为小分子抗体 nano
‑
anti
‑
srbd(氨基酸序列如seq id no:1所示)的编码基因，其中，5
’ꢀ
末端第1
‑
6位为bamh i的识别位点，第7
‑
375位(即seq id no:3所示的 核苷酸序列)为nano
‑
anti
‑
srbd编码序列，第376
‑
381位为xba i的识别位 点。
80.采用bamh i和xba i(均购自thermofisher公司，牌号分别为fd0055 和fd0685)分别对小分子抗体nano
‑
anti
‑
srbd的编码基因和pcold i载体 (购自takara公司，牌号为d3361，其表达蛋白带有poly
‑
his标签(该 标签的氨基酸序列如seq id no:8所示)进行双
酶切，并将酶切产物连接， 获得表达载体pcold i
‑
nano
‑
anti
‑
srbd。
81.利用表达载体pcold i
‑
nano
‑
anti
‑
srbd转化大肠杆菌bl21(de3)(购 自博迈德公司，牌号为bc201)感受态细胞，获得重组大肠杆菌pcoldi
‑
nano
‑
anti
‑
srbd/bl21(de3)，利用含100μg/ml氨苄青霉素的lb固体 培养基进行培养，挑选氨苄青霉素抗性克隆，提取质粒进行测序鉴定(委托 诺赛公司完成)。测序结果如图1所示，其中用方框圈出了bamh i和xba i 的酶切位点。
82.理论而言，表达载体pcold i
‑
nano
‑
anti
‑
srbd的序列应为将pcold i载 体中bamh i和xba i的酶切位点间的dna片段替换为nano
‑
anti
‑
srbd的 编码基因(seq id no:2)的核苷酸序列。经比对，该测序结果与理论序列 完全一致，说明表达载体构建成功。
83.(二)小分子抗体的表达和纯化
84.取含有正确重组质粒的重组大肠杆菌pcold i
‑
nano
‑
anti
‑
srbd/bl21 (de3)接种于5ml lb液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中，37℃ 震荡培养10h，获得种子液。
85.将上述种子液以1:100的体积比接种于新鲜的500ml lb液体培养基(含 100μg/ml氨苄青霉素)中，37℃振荡培养3h，至od
600
达到0.5
±
0.1。加入 异丙基
‑
β
‑
d
‑
硫代半乳糖苷(iptg)，加入量使得iptg的终浓度为0.4mm， 15℃诱导培养24h。
86.诱导培养结束后12000rpm离心10min收集菌体沉淀，使用25ml结合 缓冲液buffer a(50mm hepes，500mm nacl，ph 7.5)重悬菌体沉淀。 超声破碎重悬的菌体(超声破碎条件：240w，处理总时长60min，期间每 隔10s间歇超声处理5s)。
87.超声破碎后在4℃下13000rpm离心15min，将离心上清转入新的离心 管；再次在4℃下13000rpm离心15min，彻底去除沉淀。使用0.22μm滤器 (购自pall公司，牌号为pn4612)过滤离心上清于50ml细离心管中， 即获得了超声上清样品。
88.利用pcold i载体表达蛋白所带的poly
‑
his标签，采用ni亲和层析的方 法需超声上清样品进行纯化。所用的ni柱为histrap hp层析柱(购自gehealthcare公司，牌号为17524701)，其为5ml柱体积的预装柱，按照以下 方法进行纯化：使用结合缓冲液buffer a平衡镍柱5个柱体积，平衡流速为 5ml/min；将超声上清样品上样，上样流速为1ml/min；用结合缓冲液buffera再洗5个柱体积，流速为5ml/min；分别使用5％、10％、100％(对应 含25mm、50mm、500mm咪唑)浓度的洗脱缓冲液buffer b(50mm hepes， 500mm nacl，500mm咪唑，ph 7.5)洗脱蛋白，流速为2ml/min，分别 对应收集各洗脱峰1管(即为纯化样品)，最后用纯水洗5个柱体积，再用 20％的乙醇洗5个柱床体积，流速为5ml/min，柱子置于4℃环境中保存。
89.将收集获得的纯化样品进行sds电泳鉴定，结果如图2所示。图2中， m泳道为蛋白marker(购自全式金公司，牌号为dm101)，1
‑
3泳道分别为 25mm、50mm和500mm咪唑洗脱的纯化样品，由图2可看出，500mm咪 唑洗脱的纯化样品纯度最高。
90.使用3kda超滤管(购自merck millipore公司，牌号为ufc900396)对 nano
‑
anti
‑
srbd蛋白进行浓缩，具体步骤如下：取4ml 500mm咪唑洗脱 的纯化样品与8ml pbs缓冲液混合获得稀释液，将稀释液转入3kda超滤 管，在4℃下4000
×
g离心60min；将被截留的液体(约0.5ml)与12ml pbs 缓冲液混合，而后再于4℃下4000
×
g离心60min，获得的被截留的液体即为 浓缩nano
‑
anti
‑
srbd蛋白样品，体积约0.5ml。取少量浓缩nano
‑
anti
‑
srbd 蛋白样品进行浓度测定及sds电泳鉴定，其余分装后于
‑
70℃冻存。
91.蛋白浓度检测结果显示浓缩nano
‑
anti
‑
srbd蛋白样品的浓度为1.48 mg/ml。
92.sds电泳鉴定结果如图3所示，其中，m泳道为蛋白marker(购自thermo 公司，牌号为26616)，1泳道为浓缩nano
‑
anti
‑
srbd蛋白样品。
93.实施例2
94.本实施例用于说明小分子抗体nano
‑
anti
‑
srbd与sars冠状病毒的结 合特性。
95.采用间接elisa法检测nano
‑
anti
‑
srbd与sars冠状病毒rbd的反 应性，具体方法如下：
96.实验组：sars冠状病毒rbd
‑
fc蛋白(sars冠状病毒s蛋白rbd功 能区与人igg fc片段的融合蛋白，其氨基酸序列如seq id no:4所示)
97.对照组i：mers冠状病毒rbd
‑
fc蛋白(mers冠状病毒s蛋白rbd 功能区与人igg fc片段的融合蛋白，其氨基酸序列如seq id no:5所示)
98.对照组ii：新型冠状病毒rbd
‑
fc蛋白(新型冠状病毒s蛋白rbd功 能区与人igg fc片段的融合蛋白，其氨基酸序列如seq id no:6所示)
99.分别使用以上实验组、对照组i和对照组ii的蛋白包被96孔酶标板， 包被浓度为1μg/ml，每孔50μl。用封闭液(含3重量％bsa的pbs溶液) 将实施例1获得的浓缩nano
‑
anti
‑
srbd蛋白样品配制成不同浓度的蛋白溶 液作为一抗，使用hrp
‑
his鼠单克隆抗体(购自康为世纪公司，牌号为 cw0285m)作为二抗。
100.elisa检测结果如图4所示，图中sars
‑
cov rbd、mers
‑
cov rbd 和sars
‑
cov
‑
2rbd对应的曲线分别代表实验组、对照组i和对照组ii的 检测结果。由图中可以看出，小分子抗体nano
‑
anti
‑
srbd与sars冠状病 毒rbd
‑
fc蛋白反应性很好，说明其能够很好地结合，进一步的结果显示其 ec
50
值为4.76ng/ml；相比之下，小分子抗体nano
‑
anti
‑
srbd与mers冠 状病毒rbd
‑
fc蛋白和新型冠状病毒rbd
‑
fc蛋白基本没有反应，说明该小 分子抗体几乎不与这两个对照蛋白结合。由此说明了本发明提供的小分子抗 体nano
‑
anti
‑
srbd能够很好地特异性结合sars冠状病毒rbd。
101.实施例3
102.本实施例用于说明小分子抗体nano
‑
anti
‑
srbd对sars冠状病毒假病 毒的中和活性。
103.本实施例中采用的huh
‑
7细胞购自atcc，采用的sars冠状病毒假病 毒(含萤火虫荧光素酶报告基因)的制备方法参照：a safe and convenientpseudovirus
‑
based inhibition assay to detect neutralizing antibodies and screenfor viral entry inhibitors against the novel human coronavirus mers
‑
cov.zhaog,du l,ma c,et al.virol j.2013；10:266.doi:10.1186/1743
‑
422x
‑
10
‑
266。
104.实验抗体：实施例1获得的浓缩nano
‑
anti
‑
srbd蛋白样品
105.对照抗体：anti
‑
mers
‑
nbms10(抗mers冠状病毒中和抗体，制备方 法参照：a novel nanobody targeting middle east respiratory syndromecoronavirus(mers
‑
cov)receptor
‑
binding domain has potentcross
‑
neutralizing activity and protective efficacy against mers
‑
cov.zhao g, he l,sun s,et al.j virol.2018；92(18):e00837
‑
18.doi:10.1128/jvi.00837
‑
18。
106.实验组：采用不同浓度的抗体(利用dmem高糖培养基对实验抗体或 对照抗体进行
稀释获得)进行处理
107.对照组i：以等体积dmem高糖培养基替代抗体进行处理，其他操作与 实验组相同，即病毒对照组
108.对照组ii：以等体积dmem高糖培养基替代抗体和假病毒(溶液)， 其他操作与实验组相同，即细胞对照组
109.使用96孔板，分别将50μl/孔不同浓度的实验抗体和对照抗体与500 tcid50的sars冠状病毒假病毒(加入量为100μl/孔)混合，于37℃孵育1小时。向孵育后的混合液中加入100μl的huh
‑
7细胞(约4
×
104个细胞/ 孔)，即培养体系为250μl/孔，37℃培养48小时。
110.而后吸弃部分培养基(150μl/孔)，加入显色底物(购自perkin elmer， 牌号为6066761)，加入量为100μl/孔，反应2分钟，然后将反应混合物 (200μl/孔)转移至96孔白板中，测定其相对光单位(relative light unit， rlu)的强度，采用以下公式计算抗体对sars冠状病毒假病毒进入细胞的 抑制率：
111.抑制率＝(病毒对照孔rlu
‑
样品孔rlu)/(病毒对照孔rlu
‑
细胞对照 孔rlu)
×
100％
112.式中，样品孔rlu即为实验组rlu。
113.结果如图5所示，图中s14和nbms10对应的曲线分别代表实验抗体和 对照抗体的检测结果。从图中可以看出，小分子抗体nano
‑
anti
‑
srbd对 sars冠状病毒假病毒具有较好的中和活性，能够有效抑制sars冠状病毒 假病毒进入huh
‑
7细胞，进一步的结果显示其ic
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为4.93ng/ml。相比之下， 对照抗体则基本对sars冠状病毒假病毒不产生抑制作用。
114.以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在 本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包 括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样 应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。