巴戟天中香豆素类化合物的萃取方法与流程

1.本发明属于化合物提取分析技术领域，具体涉及一种巴戟天中香豆素类化合物的萃取方法，是一种基于超声波辅助分散液液微萃取提取分析巴戟天中香豆素类化合物的方法。


背景技术：

2.巴戟天中含有香豆素类成分，且其不良反应多与口服有关，有研究发现香豆素灌胃小鼠ld
50
＝1.39g/kg，毒性较强，尽管这种毒性可能具有种属差异性，且香豆素是否引发中毒与cyp2a6酶在人群中多态性相关。
3.目前还没有针对巴戟天中香豆素类化合物的检测方法，而且对于香豆素类化合的检测，关键步骤是样品前处理。经过样品的前处理，一方面可以起到浓缩待测痕量组分的消除干扰的作用，从而提高方法的灵敏度，降低方法的检出限；另一方面可以去除对仪器或管道有害的物质，从而延长仪器的使用寿命。而分散液液微萃取(dllme)是一种新型的的微萃取技术。当样品溶液中加入萃取剂和分散剂，分散剂使萃取剂均匀分布于样品溶液中，增大了两者之间的接触面积，从而使待测物被萃取剂快速萃取，在离心之后留在离心管底部，形成一定体积的沉淀相。分散液液微萃取法较传统的液液萃取法来说，集采样、萃取和浓缩于一体，具有有机溶剂使用量少、萃取效率高、富集倍数大、操作方便简单、环境友好等特点，是一种绿色的样品前处理方法，在痕量分析领域具有广阔的前景。


技术实现要素：

4.本发明旨在提供一种巴戟天中香豆素类化合物的萃取方法，是一种操作简单、检测速度快、成本低廉的超声波辅助分散液-液微萃取方法，结合高效液相色谱法，能够同时检测香豆素、二氢香豆素、醋硝香豆素、6-甲基香豆素、7羟基-6-甲氧基香豆素5种香豆素类化合物。
5.按照本发明的技术方案，所述巴戟天中香豆素类化合物的萃取方法，包括以下步骤，
6.s1：调节巴戟天提取液的ph为1-7；
7.s2：加入三氯甲烷，得到混合液体；
8.s3：将所述混合液体在10-60℃条件下处理后，进行超声波辅助萃取；
9.s4：将超声处理后的混合液体进行离心，获得沉降物，完成萃取。
10.进一步的，所述巴戟天提取液的的制备方法如下：
11.ss1：将巴戟天样品研磨后，加入水煮沸提取，过滤，得到滤液i和滤渣；
12.ss2：向所述滤渣中加入水，保沸提取后过滤，得到滤液ii；
13.ss3：合并滤液i和滤液ii，冷冻干燥，得到冻干粉；
14.ss4：向所述冻干粉中加入水，超声提取后离心，所得上清液即为巴戟天提取液。
15.进一步的，所述步骤ss1中，提取的时间为1.5-4h；所述步骤ss2中，提取的时间为
1-3h；所述步骤ss4中，超声提取的时间为0.4-0.6h。
16.进一步的，所述步骤ss4中，冻干粉与水的质量体积比为1：30-50g/ml。
17.进一步的，所述巴戟天提取液与所述三氯甲烷的体积比为500：3-8。
18.进一步的，所述步骤s2中，三氯甲烷溶解于甲醇中，再加入调节ph后的巴戟天提取液。
19.进一步的，所述三氯甲烷与甲醇的体积比为1：8-20。
20.进一步的，所述步骤s3中，超声波辅助萃取的时间为1-12min，优选为7min。
21.进一步的，所述步骤s4中，离心的转速为3000-5000rpm，时间为6-12min。
22.本发明的另一方面提供了三氯甲烷在香豆素类化合物萃取中的应用。
23.本发明的技术方案相比现有技术具有以下优点：
24.1)基于本发明，结合高效液相色谱法，测定巴戟天中的5种香豆素类化合物灵敏度高，检出限在0.5-0.9ng/ml。
25.2)本发明所使用的萃取溶剂少(三氯甲烷50μl，甲醇分散剂0.8ml)，相比于传统的回流提取提取方法，节省了大量的对人体有害的有机溶剂。
26.3)本发明耗费时间短(《30min)，与传统方法相比，节省了分析时间，因此可以用于大批次的巴戟天样品中香豆素类化合物的测定。
附图说明
27.图1为不同有机溶剂充当萃取剂对香豆素类化合物萃取效果的影响图。
28.图2为不同体积三氯甲烷作为萃取剂对萃取结果的影响图。
29.图3为不同分散剂对萃取结果的影响图。
具体实施方式
30.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
31.实施例1巴戟天中香豆素类化合物的萃取方法中及控制参数的确定
32.1、巴戟天中香豆素类化合物的萃取方法，包括以下步骤，
33.s1：调节巴戟天提取液的ph为1-7；
34.s2：加入萃取剂(溶于分散剂中)，得到混合液体；
35.s3：将所述混合液体在10-60℃条件下处理后，进行超声波辅助萃取；
36.s4：将超声处理后的混合液体进行离心，获得沉降物，完成萃取。
37.2、控制参数的确定
38.影响超声波辅助萃取和分散液液微萃取效率的主要因素包括：萃取剂类型和用量、提取温度、分散剂类型和用量，以及离子强度和ph。
39.2.1、超声波辅助萃取剂种类的确定：选取密度大于水的有机溶剂作为萃取剂，由于不同的有机溶剂对目标分析物的萃取能力有不同的影响，因此萃取剂的选择对最终的萃取结果非常重要。本发明选择了三种有机溶剂用于巴戟天提取物中香豆素类化合物的富集和提取，分别为二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳，回收率如图1所示。结果显示三氯甲烷巴戟天中香豆素类化合物对于具有良好回收率，达到82％，因此最终选择三氯甲烷作为dllme过
程中的萃取剂。
40.2.2、三氯甲烷体积的确定：萃取剂的用量是影响萃取效率的关键因素，萃取剂的用量直接影响回收率的水平。本次发明选择30-80μl三氯甲烷(5ml巴戟天提取液)。实验结果表明(图2)，在实验中使用50μl三氯甲烷获得令人满意的富集因子和提取回收率。
41.2.3、提取温度的确定：在萃取过程中，一般提高温度可以加速分析物在两相之间的转移，也可以增加萃取剂和目标分析物在溶液中的溶解度。在本发明中，在5-60℃下研究了温度对提取效率的影响。其中在20℃范围内获得最佳回收率。
42.2.4、超声时间的确定：在20℃下进行超声辅助提取，在1-12min范围内评价超声处理时间的效果。最终实验选择超声辅助提取7min，此时提取效果最佳。
43.2.5、分散剂和体积的选择：本发明选择了三种有机溶剂，乙腈、甲醇和丙酮，它们在离子液体和水相中都具有适当的混溶性。四种目标分析物的回收率相似(如图3所示)，但考虑到hplc中使用甲醇作为流动相，因此选择甲醇作为分散剂。分散剂的体积会影响萃取剂在水样中的分散效果。本发明中固定萃取剂用量为50μl，优化了0.4-1.0ml不同体积的甲醇，其中甲醇体积为0.8ml提取效果最佳。
44.2.6、ph的选择：样品溶液的ph值决定了分析物的存在形式(离子或中性形式)，此后可能会影响提取效率。通过向样品中加入适当的磷酸或氢氧化钠用以调节ph，在1-7范围内评估样品ph值的影响。当样品ph等于5时，香豆素、二氢香豆素、醋硝香豆素、7羟基-6-甲氧基香豆素回收率最高。因此，在以下实施例中选择了ph为5。
45.2.7、离子强度选择：离子强度可以提高目标分析物在萃取剂中的溶解度，从而提高萃取效率。在本发明中，将不同量的nah2po4(从0％到20％)添加到样品中以评估离子强度的影响。加入nah2po4后，萃取回收率下降。因此，在本发明中不添加na

盐。
46.实施例2巴戟天样品中香豆素类化合物的测定
47.1、标准溶液的配制：单一标准品储备液：精密称香豆素、二氢香豆素、醋硝香豆素、6-甲基香豆素、7羟基-6-甲氧基香豆素各2.15mg、1.25mg、1.30mg、1.40mg，1.30mg，加50％甲醇溶解，分别定容至10ml，配置成浓度分别为215μg/ml、125μg/ml、130μg/ml、140μg/ml、130μg/ml的单一标准品储备液。混合标准品溶液：精密吸取各单一标准品储备液适量，配置成相应浓度梯度的混合标准品溶液。
48.2、样品前处理：将巴戟天样品研磨成细粉，取巴戟天细粉100g置于3000ml不锈钢锅中，加入1200ml蒸馏水，煮沸提2h后，过滤后滤渣再次加入1000ml蒸馏水保沸提取1.5h后过滤，合并滤液，取300ml提取液冻干进行保存。将0.5g上述冻干粉加入20ml蒸馏水，超声提取30min后。将混合溶液离心5min以分离冻干粉末残留物和水溶液。
49.3、分散液液微萃取(dllme)：将5ml的上述提取液置于10ml锥形底离心管中。使用注射器将50μl三氯甲烷(已溶解在800μl甲醇中)快速注入样品溶液中。对于产生混浊样品溶液，涡旋3min，在20℃的条件下超声7min后冰浴10min，最后在3500rmp条件下离心8min。丢弃上层水相，量取在离心管底部il相，通常为26μl，小心地取出注入hplc系统。
50.4、hplc测定：色谱分析是在配有二极管阵列检测(dad)系统的chromaster型hplc系统上进行的。反相c18色谱柱(内径250mm
×
4.6mm，5μm)型号为agilent eclipse xdb-c
18
。流动相由水(a)添加0.05％磷酸和甲醇(b)(比例为20:80(v/v))组成，流速为1.0ml
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min-1
。进样量和检测波长分别为10μl和320nm。
51.5、方法性能评估：为了研究所提出的测定样品中香豆素类化合物的方法的方法性能，设计了一系列实验来评估优化条件下方法的线性、重现性、检测限和其他特性等参数，结果如表1所示。从表1中可以看出，在香豆素、二氢香豆素、醋硝香豆素、6-甲基香豆素、7羟基-6-甲氧基香豆素分析物均表现出良好的线性，相关系数(r2)范围为0.998至0.999。该方法的精密度是通过对加标样进行五次萃取和分析来确定的，相对标准偏差(rsd)范围为1.25％至5.28％。根据信噪比(s/n＝3)，检测限(lod)的计算范围为0.50-2.02μg
·
l-1
。这些参数表明，本方法具有高灵敏度和可靠性，可用于检测样品中香豆素类化合物的浓度。
52.表1方法性能评估
[0053][0054]
6、样品测定：为验证所提方法在实际样品分析中的适用性，对来自天方健药业有限公司三个不同地区(ⅰ、ⅱ、ⅲ)的巴戟天样品中的香豆素类化合物进行了测定。f检验(p＝0.95，n＝3)比较两种方法得到的结果，没有观察到显着差异，检验结果表明超声辅助功能化离体分散液液微萃取的方法用来测定此类样品。
[0055]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。