去泛素化酶USP25在制备诊断乳腺癌的生物标记物中的用途的制作方法

去泛素化酶usp25在制备诊断乳腺癌的生物标记物中的用途
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，涉及去泛素化酶usp25，具体来说是去泛素化酶usp25在制备诊断乳腺癌的生物标记物中的用途。


背景技术：

2.1990年，研究发现了一种直接与遗传性乳腺癌有关的基因brca1，它位于人体细胞核的第17号染色体上。如果brca1基因的结构发生突变，它所具有的抑制肿瘤发生的功能就会受影响，使人罹患乳腺癌和卵巢癌的风险增加。研究显示，brca1基因突变者，患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50%-85%和15%-45%，而在普通人群中，约12.0％的女性可能患乳腺癌，brca1基因突变让乳腺癌风险升高的4-7倍。卵巢癌方面，只有1.4％的普通女性有卵巢癌风险，brca1基因突变使卵巢癌风险增加10倍以上。
3.brca1是一种具有抑制恶性肿瘤发生的基因，在调节人体细胞的复制、遗传物质dna损伤修复、细胞的正常生长方面有重要作用，dna损伤应答机制与癌症的发生发展密切相关。brca1或brca2的突变会显著削弱细胞的损伤应答的修复能力，引起基因组不稳定甚至癌变。
4.保持基因组稳定性对于维持人体各个器官的正常工作至关重要。机体有一套应答机制来应对dna损伤。dna损伤应答通路中的重要蛋白如atm、brca1、brca2以及chk2等的种系突变都与癌症的易感性相关。dna损伤应答信号通路中这些重要蛋白在应答通路中存在着许多反馈调控以及交叉应答，使得dna损伤应答通路成为一个复杂的网络系统。而这整个网络系统是通过蛋白翻译后修饰精确调控的。dna损伤蛋白翻译后修饰的调控将dna损伤关键蛋白有序连接，构建成网络，进而传递信号。
5.在真核生物中，非同源性末端接合（non-homologous end joining, nhej）及同源性重组（homologous recombination，hr）两种修复方式共同作用，修复双链断裂的dna，维持基因组稳定性。hr是利用同源的姐妹染色单体为模板进行新链的合成，从而精确的修复断裂的双链dna。乳腺癌易感基因brca1，brca2在hr修复中发挥着重要作用：brca1或brca2的突变会显著削弱细胞的hr修复能力，引起基因组不稳定甚至癌变。hr修复除了与肿瘤发生密切相关外，对于肿瘤治疗也有重要指导意义。例如，parp抑制剂是乳腺癌及卵巢癌的经典化疗药物，通过诱导dna双链断裂杀伤肿瘤，但是肿瘤对其极易产生耐药性。有研究显示，肿瘤细胞会通过一系列的进化而提高自身的dna损伤修复效率，以抵抗药物杀伤，从而产生耐药性。
6.usp25去泛素化酶是泛素系统的关键成员，包含一个泛素结合区域(ubiquitin-associated domain)、两个可与泛素相互作用基序(ubiquitin-interaction motif)和两个肽酶区域，肽酶区域具有泛素水解酶活性。usp25可以通过促进tankyrases的去泛素化作用和稳定作用，充当wnt/β-catenin信号转导的正向调节剂。在人结肠癌组织中，usp25的水平与socs3呈负相关，而与pstat3以及β-catenin呈正相关，表明usp25通过调控wnt信号通路以及socs3-pstat3轴进而促进小鼠肠道肿瘤的进展。另外，usp25参与神经炎症的发生发
展，在唐氏患者和唐氏模型小鼠dp16脑中表达水平均显著增加，且在小胶质细胞中高表达。usp25的小分子抑制剂表现出良好的血脑屏障透过性，可能作为阿尔茨海默病和唐氏综合征潜在的治疗靶点。以上usp25在治疗结肠癌和肠道疾病、阿尔茨海默病和唐氏综合征治疗方面的研究结果，发表在《nature cancer》，《science advances》，《science signaling》等国际顶级杂志上，但usp25在调节乳腺癌方面的功能还尚不清楚。
7.乳腺癌现有治疗方案，普遍采用parp抑制剂化疗的方案，但是由于不同个体具有不同基因背景，对化疗的反应也有很大差异，因此，深入了解乳腺癌的耐药性机制，开发针对不同个体的个性化化疗策略，提高乳腺癌治疗的有效率。


技术实现要素：

8.针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了去泛素化酶usp25在制备诊断乳腺癌的生物标记物中的用途，所述的这种用途要解决现有技术中的对于临床诊断乳腺癌的效果不佳的技术问题。
9.本发明提供了去泛素化酶usp25在制备诊断乳腺癌的生物标记物中的用途。
10.本发明还提供了检测去泛素化酶usp25的试剂在诊断乳腺癌的试剂盒中的用途。
11.本发明还提供了usp25和brca1作为联和标记物在制备诊断乳腺癌的生物标记物中的用途。
12.本发明利用同源重组修复机制调控乳腺癌耐药的作用原理，鉴定了去泛素化酶usp25与同源重组修复途径相关，敲除usp25可以显著提高细胞同源重组修复能力，并且显著增强乳腺癌细胞对parp抑制剂的抵抗能力。另外，ihc检测证明usp25在乳腺癌组织中高表达，并且数据库分析也进一步显示usp25和brca1同时低表达的乳腺癌病人，具有更好的hr修复能力，对化疗药物更耐受。因此，本发明发现了一个新的乳腺癌诊断和个性化治疗的分子标记物。
13.附图说明
14.图1a显示经过shrna系统敲除usp25的u2os细胞株经过筛选后，已稳定消减usp25。
15.图1b显示敲除usp25对dna损伤关键蛋白rad51和rpa32形成foci的能力。
16.图1c显示敲除usp25提高了细胞的同源重组修复能力。
17.图2a显示去泛素化酶usp25能被atm磷酸化。
18.图2b usp25 t523位突变后，抑制了usp25的磷酸化水平。
19.图3显示了在乳腺癌细胞中消减usp25，显著增强肿瘤细胞对parp抑制剂的抵抗能力，并且抵消了消减brca1后parp抑制剂对乳腺癌细胞的杀伤效果。
20.图4a显示通过ihc检测证明，去泛素化酶usp25在乳腺癌组织中高表达。
21.图4b与预后数据高度相关。
22.图4c-f tcga数据库分析乳腺癌病人usp25及brca1高低对hr修复的影响。
23.实施例1usp25编码的蛋白氨基酸序列如seq id no.1所示，及基因序列如seq id no.2所示。检测usp25使用abcam (ab187156) 单克隆抗体（购买自上海普飞生物技术有限公司）。
24.实施例2去泛素化酶usp25影响dna损伤修复能力dna损伤类型中最严重的是dna双链断裂（dsb），如果修复不及时，可引起细胞死亡。dsb产生后将会激活细胞的dna损伤应答（ddr）机制，ddr通过快速募集大量的蛋白质来感应、放大及转导dna损伤信号。这些募集的蛋白质在dsb处形成簇集点（foci），这是dsb形成的标志。
25.离子辐射是诱导dna双链断裂的最常用的方法。在u2os细胞中利用shrna敲除usp25，western结果显示，u2os细胞株经过筛选后，已稳定消减usp25(图1a)。将对照和敲除usp25的细胞进行离子辐射，免疫荧光实验显示，消减usp25之后，显著增加了rad51和rpa32形成foci的能力，与对照相比，更多的募集到dna损伤处(图1b)。进一步，消减usp25之后，与对照相比，细胞的同源重组修复能力（hr）显著提高(图1c)。
26.实施例3usp25受dna损伤应答调控磷酸化是dna损伤应答通路上重要的翻译后修饰类型，可以蛋白质的活性和稳定性，因此检测usp25磷酸化水平变化情况可以反映usp25是否受dna损伤应答调控。如图2所示，在离子辐射诱导下，将细胞中的usp25免疫沉淀，使用atm底物特异磷酸化抗体p-sq/tq检测发现usp25能被atm磷酸化(图2a)，但是将usp25的磷酸化位点s85,s258和t523突变之后，发现usp25的t523位突变后，磷酸化水平不再提高(图2b)。
27.实施例4敲减usp25的mda-mb-231乳腺癌细胞株对parp抑制剂的敏感性显著降低olaparib是一种常用的parp抑制剂，olaparib可以通过抑制肿瘤细胞dna损伤修复、促进肿瘤细胞发生凋亡。已有实验结果显示，敲减brca1可以显著增加乳腺癌细胞株对parp抑制剂的敏感性。在本实施例中，为了检测usp25是否能成为乳腺癌治疗的标志物，在mda-mb-231乳腺癌细胞株中构建了单独敲减usp25或者brca1以及共同敲减usp25和brca1的细胞系，通过克隆形成率实验比较shrna敲减实验组与对照组细胞对parp抑制剂的敏感性。
28.结果如图3所示，与对照相比，稳定消减brca1的乳腺癌细胞对olaparib敏感性显著增加。而稳定消减usp25显著降低了乳腺癌细胞对olaparib敏感性，相同olaparib浓度下，稳定消减usp25细胞株的存活率显著高于对照细胞株。但是共同敲减usp25和brca1的乳腺癌细胞恢复了对olaparib的抵抗能力。
29.实施例5usp25调控乳腺癌发生发展为了确定usp25调控乳腺癌发生发展的机制，选取乳腺癌和相应的正常组织进行ihc检测，结果也同样显示usp25在乳腺癌组织中高表达（图4a），并且与预后数据高度相关（图4b）。在对tcga数据库中乳腺癌病人样本的数据进行分析显示，在usp25高表达的样本中，brca1低表达显著增加了hrd,lst,tai和loh，但在usp25低表达可以显著降低brca1低表达样本的hrd,lst,tai和loh，说明usp25和brca1同时低表达的乳腺癌病人，具有更好的hr修复能力，对化疗药物更耐受（图4c-f）。