黑皮质素-4受体激动剂的制作方法

1.本发明涉及一种对黑皮质素受体表现出优异激动剂活性的化合物。更具体地说，本发明涉及下式1的化合物、包含该化合物作为活性成分的药物组合物及其用途，并且本发明化合物表现出针对黑皮质素-4受体的优异激动剂活性，并且在预防或治疗肥胖、糖尿病、炎症和勃起功能障碍方面可能特别有用：
2.[式1]
[0003][0004]
其中r1为c
2-c5烷基。


背景技术：

[0005]
瘦素蛋白是一种由体脂细胞(脂肪细胞)分泌的激素，其分泌量随着体脂含量的增加而增加。瘦素蛋白调节下丘脑中产生的各种神经肽的功能，从而调节食欲、体脂含量和包括能量代谢的各种体内功能，(schwartz等人，《自然》404，661-671(2000))。瘦素蛋白控制食欲和体重的信号转导是通过调节许多下游因子实现的，其中最具代表性的是黑皮质素、刺鼠相关肽(agrp)和神经肽y(npy)激素。
[0006]
当体内热量过多导致血液中瘦素浓度增加时，脑下垂体中前阿片黑皮素(pomc)蛋白激素的分泌增加，agrp和npy的产生减少。α-msh(黑素细胞刺激激素)是一种由pomc神经元产生的小肽激素，该激素是第二神经元的黑皮质素-4受体(mc4r)的激动剂，最终引起食欲下降。另一方面，当瘦素浓度因热量不足而降低时，作为mc4r拮抗剂的agrp的表达增加，npy的表达也增加，这最终会增强食欲。也就是说，根据瘦素的变化，α-msh激素和agrp激素作为mc4r的激动剂和拮抗剂参与食欲调节。
[0007]
除mc4r外，α-msh激素还通过与3种mcr亚型结合引起各种生理反应。到目前为止，已经确定了五种mcr亚型。在这些亚型中，已知mc1r主要在皮肤细胞中表达并参与黑色素沉着，mc2r主要在肾上腺中表达并参与糖皮质激素的产生，只有来源于pomc的acth(促肾上腺皮质激素)是其配体。主要在中枢神经系统表达的mc3r和mc4r参与调节食欲、能量代谢和体内脂肪储存效率，而已知在各种组织中表达的mc5r可调节外分泌功能(wikberg等人，pharm res 42(5)393-420(2000))。具体而言，mc4r受体的激活具有通过引起食欲下降和能量代谢增加而有效减轻体重的效果，因此被证明是肥胖药物开发的主要作用点(综述：wikberg，eur.j.pharmacol 375，295-310(1999))；wikberg等人，pharm res 42(5)393-420(2000)；
douglas等人，eur.j.pharm 450，93-109(2002)；和o'rahilly等人，nature med 10，351-352(2004)。
[0008]
mc4r在食欲和体重控制中的作用已通过在刺鼠蛋白异常表达动物模型(agouti小鼠)上的实验得到初步证明。在agouti小鼠的情况下，发现刺鼠蛋白在中枢神经系统中高浓度表达，并由于基因突变在下丘脑中作为mc4r的拮抗剂，从而引起肥胖(yen，tt等人，faseb j.8，479-488(1994)；以及lu d等人，nature 371，799-802(1994))。在随后的研究结果中，观察到类似于实际刺鼠蛋白的agrp(刺鼠相关肽)在下丘脑神经中表达，并且已知agrp作为mc4r拮抗剂参与食欲调节(shutter等人，genes dev.，11，593-602(1997)；以及ollman等人，science 278，135-138(1997))。
[0009]
对动物脑内给药作为mc4r体内激动剂的α-msh显示出降低食欲的效果，并且如果用作为mc4r拮抗剂的shu9119(肽)或hs014(肽)处理上述动物，则再次观察到增加食欲的效果(kask等人，biochem.biophys.res.comm.245，90-93(1998))。此外，在使用黑素ii(mtii，ac-nle-c[asp-his-dphe-arg-trp-lys]-nh2)和hp228(其为类似的激动剂)的动物试验中，在脑、腹腔或皮下给药后，证实食欲抑制、体重减轻和能量代谢增加功效等。(thiele t.e.等人，am j physiol 274(1pt 2)，r248-54(1998)；lee m.d.等人，faseb j 12，a552(1998)；murphy b.等人，j appl physiol 89，273-82(2000))。与之相比，当向动物给药代表性shu9119时，表现出显著且持续的采食量和体重增加，提供了mcr激动剂可用于治疗肥胖的药理学证据。mtii给药期间明显表现出的食欲降低效应在mc4r ko(敲除)小鼠中未表现出来，该实验结果再次证明食欲降低效应主要通过激活mc4r实现(marsh等人，nat genet 21119-122(1999))。
[0010]
作用于中枢神经系统的食欲抑制剂是迄今为止发展起来的肥胖治疗的主要药物，大多数抑制剂是调节神经递质作用的药物。其实施例包括去甲肾上腺素剂(芬特明和马吲哚)及氟西汀和西布曲明，均为血清素能剂。然而，神经递质调节剂通过许多亚型受体除了抑制食欲外，还对各种生理作用产生广泛的影响。因此，调节剂缺乏对每种亚型的选择性，并且有一个很大的缺点，即长期给药会伴随各种副作用。
[0011]
另一方面，黑素皮质素是神经肽，而不是神经递质，考虑到mc4r基因ko小鼠除能量代谢外的所有其它功能都是正常的，黑素皮质素激动剂作为作用点的优势在于可以仅诱导通过抑制食欲来减轻体重，而不会影响其它生理功能。具体而言，该受体是g蛋白偶联受体(gpcr)，其属于迄今为止开发的新药作用点中最成功的类别，并且与相关领域中的作用点有很大区别，因为它相对容易确保对亚型受体的选择性。
[0012]
作为利用黑皮质素受体作为作用点的实例，国际出版物wo 2008/007930和wo 2010/056022公开了作为黑皮质素受体激动剂的化合物。


技术实现要素：

[0013]
技术问题
[0014]
本发明的目的是提供一种由式1表示的新化合物或其药学上可接受的盐或异构体，其具有针对黑皮质素受体，特别是黑皮质素-4受体(mc4r)的优异选择性激动剂活性。
[0015]
本发明的另一个目的是提供一种制备由式1表示的化合物的方法。
[0016]
本发明的另一个目的是提供一种黑皮质素受体激动剂药物组合物，其包含由式1
表示的化合物或其药学上可接受的盐或异构体作为活性成分。
[0017]
本发明的另一个目的是提供由式1表示的化合物或其药学上可接受的盐或异构体在预防或治疗肥胖、糖尿病、炎症和勃起功能障碍中的用途。
[0018]
本发明的另一个目的是提供一种预防或治疗肥胖、糖尿病、炎症和勃起功能障碍的方法，所述方法包括向需要的对象给药由式1表示的化合物或其药学上可接受的盐或异构体。
[0019]
技术解决方案
[0020]
为了实现上述目的，本发明提供下式1的化合物或其药学上可接受的盐或异构体：
[0021]
[式1]
[0022][0023]
其中r1为c
2-c5烷基。
[0024]
根据本发明的式1化合物可形成药学上可接受的盐。
[0025]
此外，由于根据本发明的化合物可能具有不对称碳中心和不对称轴或不对称平面，因此化合物可作为顺式或反式异构体、r或s异构体、外消旋体、非对映体混合物和单个非对映体存在，所有这些异构体和混合物都包括在本发明的范围内。
[0026]
在本说明书中，除非另有说明，否则式1化合物的使用应包括所有式1化合物、其药学上可接受的盐和异构体。
[0027]
在根据本发明的一个实施方式中，式1中的r1为c2至c4烷基。在根据本发明的另一实施方式中，式1中的r1为直链或支链c2至c4烷基，例如乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基。
[0028]
在根据本发明的另一实施方式中，式1中的r1为c2或c3烷基。在根据本发明的另一实施方式中，式1中的r1为直链或支链c2或c3烷基，例如乙基、正丙基或异丙基。
[0029]
在根据本发明的另一实施方式中，式1化合物为下式2的n-((3s,5s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-5-(吗啉-4-羰基)吡咯烷-3-基)-n-((1s,4r)-4-甲基环己基)异丁酰胺：
[0030]
[式2]
[0031][0032]
在本发明的另一实施方式中，式1的化合物为下式3的n-((3s,5s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-5-(吗啉-4-羰基)吡咯烷-3-基)-n-((1s,4r)-4-甲基环己基)丙酰胺：
[0033]
[式3]
[0034][0035]
在本发明的另一实施方式中，式1的化合物为下式4的n-((3s,5s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-5-(吗啉-4-羰基)吡咯烷-3-基)-n-((1s,4r)-4-甲基环己基)三甲基乙酰胺：
[0036]
[式4]
[0037][0038]
在根据本发明的另一实施方式中，药学上可接受的盐的实例包括由以下酸形成的酸加成盐，无机酸例如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢溴酸和氢碘酸；有机羧酸，例如酒石酸、甲酸、柠檬酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、葡萄糖酸、苯甲酸、乳酸、富马酸和马来酸；和磺酸，例如甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸和萘磺酸，但不限于此。
[0039]
在本发明的另一实施方式中，所述化合物为式1化合物的药用盐，其中r1为乙基，所述盐为无机酸，例如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢溴酸和氢碘酸；有机羧酸，例如酒石酸、甲酸、柠檬酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、葡萄糖酸、苯甲酸、乳酸、富马酸和马来酸；和磺酸，
例如甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸和萘磺酸。
[0040]
在本发明的另一实施方式中，该化合物为式1化合物的药用盐，其中r1为正丙基，所述盐为无机酸，例如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢溴酸和氢碘酸；有机羧酸，例如酒石酸、甲酸、柠檬酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、葡萄糖酸、苯甲酸、乳酸、富马酸和马来酸；和磺酸，例如甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸和萘磺酸。
[0041]
在本发明的另一实施方式中，该化合物为式1化合物的药用盐，其中r1为异丙基，所述盐为无机酸，例如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢溴酸和氢碘酸；有机羧酸，例如酒石酸、甲酸、柠檬酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、葡萄糖酸、苯甲酸、乳酸、富马酸和马来酸；和磺酸，例如甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸和萘磺酸。
[0042]
在本发明的另一实施方式中，该化合物为式1化合物的药用盐，其中r1为正丁基，所述盐为无机酸，例如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢溴酸和氢碘酸；有机羧酸，例如酒石酸、甲酸、柠檬酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、葡萄糖酸、苯甲酸、乳酸、富马酸和马来酸；和磺酸，例如甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸和萘磺酸。
[0043]
在本发明的另一实施方式中，该化合物为式1化合物的药用盐，其中r1为异丁基，所述盐为无机酸，例如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢溴酸和氢碘酸；有机羧酸，例如酒石酸、甲酸、柠檬酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、葡萄糖酸、苯甲酸、乳酸、富马酸和马来酸；和磺酸，例如甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸和萘磺酸。
[0044]
在本发明的另一实施方式中，该化合物为式1化合物的药用盐，其中r1为仲丁基，所述盐为无机酸，例如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢溴酸和氢碘酸；有机羧酸，例如酒石酸、甲酸、柠檬酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、葡萄糖酸、苯甲酸、乳酸、富马酸和马来酸；和磺酸，例如甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸和萘磺酸。
[0045]
在本发明的另一实施方式中，该化合物为式1化合物的药用盐，其中r1为叔丁基，所述盐为无机酸，例如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢溴酸和氢碘酸；有机羧酸，例如酒石酸、甲酸、柠檬酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、葡萄糖酸、苯甲酸、乳酸、富马酸和马来酸；和磺酸，例如甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸和萘磺酸。
[0046]
在根据本发明的另一实施方式中，药学上可接受的盐为盐酸盐。
[0047]
在根据本发明的另一实施方式中，式1化合物为下式5的n-((3s,5s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-5-(吗啉-4-羰基)吡咯烷-3-基)-n-((1s,4r)-4-甲基环己基)异丁酰胺盐酸盐：
[0048]
[式5]
[0049]
[0050]
在根据本发明的另一实施方式中，式1化合物为下式6的n-((3s,5s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-5-(吗啉-4-羰基)吡咯烷-3-基)-n-((1s,4r)-4-甲基环己基)丙酰胺盐酸盐：
[0051]
[式6]
[0052][0053]
在根据本发明的另一实施例中，式1化合物为下式7的n-((3s,5s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-5-(吗啉-4-羰基)吡咯烷-3-基)-n-((1s,4r)-4-甲基环己基)三甲基乙酰胺盐酸盐：
[0054]
[式7]
[0055][0056]
在根据本发明的另一实施方式中，上述式5的n-((3s,5s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-5-(吗啉-4-羰基)吡咯烷-3-基)-n-((1s,4r)-4-甲基环己基)异丁酰胺盐酸盐，上述式6的n-((3s,5s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-5-(吗啉-4-羰基)吡咯烷-3-基)-n-((1s,4r)-4-甲基环己基)丙酰胺盐酸盐和上述式7的n-((3s,5s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-5-(吗啉-4-羰基)吡咯烷-3-基)-n-((1s,4r)-4-甲基环己基)三甲基乙酰胺盐酸盐可根据以下反应方案1制备。
[0057]
[反应方案1]
[0058][0059]
在反应方案1中，
[0060]
r2为c
1-c5烷基；
[0061]
r3为未取代或被1个或2个c
1-c5烷基取代的c
3-c8环烷基；并且
[0062]
r4和r5各自独立地为氢或卤素。
[0063]
根据本发明的式1化合物表现出针对黑皮质素受体，特别是黑皮质素-4受体(mc4r)的优异激动剂活性，因此本发明还提供黑皮质素受体激动剂药物组合物，所述药物组合物包含式1化合物或其药学上可接受的盐或异构体作为活性成分，以及药学上可接受的载体。具体而言，根据本发明的组合物在预防或治疗肥胖、糖尿病、炎症和勃起功能障碍方面表现出优异的效果，但不限于此。
[0064]
在本说明书中，“载体”是指有助于将化合物注射到细胞或组织中的化合物。
[0065]
当出于临床目的给药本发明的化合物时，作为单剂量或单独剂量给药于宿主的总日剂量优选在每1kg体重0.01mg至10mg的范围内，但个体患者的特定剂量水平可取决于所使用的特定化合物，患者的体重、性别、健康状况和饮食、给药时间、给药方法、药物的排泄率、药物混合物和疾病的严重程度。
[0066]
根据用途，本发明化合物可通过任何途径给药。例如，本发明的化合物可以通过注射或口服给药进行给药。
[0067]
根据已知技术，可通过使用合适的分散剂、润湿剂或悬浮剂来制备注射用制剂。
[0068]
用于口服给药的固体剂型的实施例包括胶囊、片剂、丸剂、粉末和颗粒，并且固体剂型可通过将根据本发明的式1的活性化合物与一种或多种载体(例如惰性稀释剂、润滑剂、崩解剂和粘合剂)混合来制备。
[0069]
有利效果
[0070]
根据本发明的式1化合物表现出针对黑皮质素受体，特别是黑皮质素-4受体(mc4r)的优异激动剂活性，因此可有效地用于预防或治疗肥胖、糖尿病、炎症和勃起功能障碍。
[0071]
根据本发明的式1化合物对黑皮质素-4受体表现出靶向效应，在表现出体重下降和饮食减少效应的同时不影响焦虑和抑郁，并且可以在不对人的ether-a-go-go相关基因(herg)产生抑制副作用并且不出现例如突变的安全问题的情况下给药所述式1化合物。此外，由于不存在细胞毒性和肝脏毒性，因此可安全给药根据本发明的式1化合物。
具体实施方式
[0072]
在下文中，将通过制备例和实施例更详细地描述本发明。然而，这些实例只是说明性的，并且本发明的范围不限于此。
[0073]
制备例1：制备(2s,4s)-4-(n-((1s,4r)-4-甲基环己基)异丁酰胺基)吡咯烷-2-甲酸甲酯盐酸盐
[0074][0075]
标题化合物通过以下步骤a、b、c、d和e获得。
[0076]
步骤a：制备(2s,4s)-4-叠氮吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁基)2-甲基酯
[0077]
将(2s,4r)-4-((甲磺酰基)氧基)吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁基)2-甲基酯(48.5g，150mmol)在氮气下溶解于n,n
’‑
二甲基甲酰胺(250ml)中，并向其中添加叠氮化钠(19.5g，300ml)。在80℃下搅拌16小时后，在减压下浓缩反应溶剂，添加水，并使用乙酸乙酯进行两次萃取。用氯化钠水溶液和水清洗有机层，在无水硫酸镁上干燥，然后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得粗产物(39.59g，98％)，该粗产物用于下一步，无需纯化。
[0078]
ms[m h]＝271(m 1)
[0079]1h nmr(400mhz,cd3od)δ4.43-4.37(m,1h),4.35-4.27(br,1h),3.77(s,1.8h),3.76(s,1.2h),3.73-3.66(m,1h),3.44-3.38(m,1h),2.63-2.49(m,1h),2.19-2.11(m,1h),1.50(s,4.5h),1.44(s,4.5h)
[0080]
步骤b：制备(2s,4s)-4-氨基吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁基)2-甲基酯
[0081]
将步骤a中获得的(2s,4s)-4-叠氮吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁基)2-甲基酯(24.59g，91.0mmol)溶解在四氢呋喃(180ml)中，然后在0℃下向其缓慢添加1m-三甲基膦的四氢呋喃溶液(109.2ml，109.2mmol)。在相同温度下搅拌1小时后，将混合物在室温下搅拌三小时。在减压下浓缩反应溶剂后，添加二氯甲烷(100ml)和水(150ml)并搅拌约30分钟。将各层分离并再次用二氯甲烷萃取后，将有机层在无水硫酸镁上干燥并过滤。在减压下浓缩滤液以获得粗产物(20.62g，93％)，该粗产物用于下一步，无需纯化。
[0082]
ms[m h]＝245(m 1)
[0083]1h nmr(400mhz,cd3od)δ4.27(m,1h),3.77(s,1.8h),3.76(s,1.2h),3.75-3.67(m,1h),3.50-3.42(m,1h),3.22-3.17(m,1h),2.58-2.47(m,1h),1.82-1.71(m,1h),1.48(s,4.5h),1.42(s,4.5h)
[0084]
步骤c：制备(2s,4s)-4-((1s,4r)-4-甲基环己基)氨基)吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔
丁基)2-甲基酯
[0085]
将步骤b中获得的(2s,4s)-4-氨基吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁基)2-甲基酯(20.62g，84.4mmol)溶解于二氯乙烷(150ml)中，并向其中添加4-甲基环己酮(9.5ml，101.3mmol)。在0℃下添加三乙酰氧基硼氢化钠(26.8g，126.6mmol)，并在室温下搅拌16小时。减压浓缩反应溶剂，加水，用乙酸乙酯萃取两次。用氯化钠水溶液清洗有机层，在无水硫酸镁上干燥，然后过滤。滤液在减压下浓缩，并通过柱层析纯化，以获得标题化合物(22.9g，80％)。
[0086]
ms[m h]＝341(m 1)
[0087]1h nmr(400mhz,cd3od)δ4.26(m,1h),3.76(s,1.8h),3.75(s,1.2h),3.78-3.71(m,1h),3.49-3.40(m,1h),3.22-3.16(m,1h),2.69-2.60(br,1h),2.58-2.46(m,1h),1.87-1.77(m,1h),1.73-1.63(m,1h),1.62-1.35(m,8h),1.48(s,4.5h),1.42(s,4.5h),0.96(d,3h)
[0088]
步骤d：制备(2s,4s)-4-(n-((1s,4r)-4-甲基环己基)异丁酰胺基)吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁基)2-甲基酯
[0089]
将步骤c中获得的(2s,4s)-4-((1s,4r)-4-甲基环己基)氨基)吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁基)2-甲基酯(37.29g，109.5mmol)溶解在二氯甲烷(500ml)中，添加三乙胺(61.1ml，438.1mmol)，并在0℃下缓慢添加异丁酰氯(11.7ml，219mmol)。在室温下搅拌16小时后，减压浓缩反应溶剂，加入碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取两次。用氯化钠水溶液和水清洗有机层，在无水硫酸镁上干燥，然后过滤。滤液在减压下浓缩并通过柱层析纯化，以获得标题化合物(38.79g，86％)。
[0090]
ms[m h]＝411(m 1)
[0091]1h nmr(400mhz,cd3od)δ4.27(m,1h),3.76(s,1.8h),3.75(s,1.2h),3.78-3.72(m,1h),3.50-3.41(m,1h),3.33-3.14(m,1h),2.69-2.60(m,2h),2.57-2.43(m,1h),1.87-1.79(m,1h),1.70-1.61(m,1h),1.60-1.32(m,8h),1.47(s,4.5h),1.41(s,4.5h),1.10(dd,6h),0.99(d,3h)
[0092]
步骤e：制备(2s,4s)-4-(n-((1s,4r)-4-甲基环己基)异丁酰胺基)吡咯烷-2-甲酸甲酯盐酸盐
[0093]
将步骤d中获得的(2s,4s)-4-(n-((1s,4r)-4-甲基环己基)异丁胺基)吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁基)2-甲基酯(34.0g，82.8mmol)溶解在二氯甲烷(200ml)中，并在0℃下添加4n盐酸1,4-二氧六环溶液(82.8ml，331.3mmol)。在室温下搅拌6小时后，在减压下浓缩反应溶剂以获得粗产物(28.7g，99％)，该粗产物用于下一步，无需纯化。
[0094]
ms[m h]＝311(m 1)
[0095]
制备例2：制备(3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-甲酸
[0096]
[0097]
标题化合物通过国际公开号wo 2004/092126中所述的方法获得。
[0098]
ms[m h]＝282(m 1)
[0099]1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.43-7.33(m,4h),3.90-3.69(m,3h),3.59(dd,j＝11.2,10.0hz,1h),3.29(dd,j＝11.2,11.2hz,1h),3.18-3.09(m,1h),1.44(s,9h)
[0100]
制备例3：制备(2s,4s)-4-(n-((1s,4r)-4-甲基环己基)丙酰胺基)吡咯烷-2-甲酸甲酯盐酸盐
[0101][0102]
标题化合物通过步骤a和b获得。
[0103]
步骤a：(2s,4s)-4-(n-((1s,4r)-4-甲基环己基)丙酰胺基)吡咯烷-1,2-二甲酸制备1-(叔丁基)2-甲基酯
[0104][0105]
通过使用在制备例1的步骤c中获得的(2s,4s)-4-((1s,4r)-4-甲基环己基)氨基)吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁基)2-甲基酯(1.0g，2.9mmol)和丙酰氯(0.33g，3.5mmol)，以与制备例1的步骤d中相同的方式获得标题化合物(0.98g，84％)。
[0106]
ms[m na]＝419.5(m 23)
[0107]1h nmr(400mhz,cd3od)δ4.33(m,1h),4.00-3.80(m,2h),3.75(m,3h),3.58(m,1h),3.47(m,1h),2.85-2.68(m,1h),2.38(q,2h),2.31(m,1h),1.93(m,1h),1.80(m,2h),1.72-1.55(m,4h),1.45(m,2h),1.45-1.41(m,9h),1.07(m,6h)
[0108]
步骤b：制备(2s,4s)-4-(n-((1s,4r)-4-甲基环己基)丙酰胺基)吡咯烷-2-甲酸甲酯盐酸盐
[0109]
[0110]
通过使用在步骤a中获得的(2s,4s)-4-(n-((1s,4r)-4-甲基环己基)丙酰胺基)吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁基)2-甲基酯(0.98g，2.4mmol)，以与制备例1的步骤e中相同的方式获得标题化合物(0.76g，93％)。
[0111]
ms[m h]＝297.4(m 1)
[0112]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.95(brs,1h),8.63(brs,1h),4.38(m,1h),4.21(m,1h),3.77(s,3h),3.53(m,1h),3.40(m,2h),2.53(m,1h),2.37(q,2h),2.24(m,1h),1.88(m,1h),1.68-1.55(m,4h),1.52(m,2h),1.40(m,2h),0.97(m,6h)
[0113]
制备例4：制备(2s,4s)-4-(n-((1s,4r)-4-甲基环己基)三甲基乙酰胺基)吡咯烷-2-甲酸甲酯盐酸盐
[0114][0115]
标题化合物通过步骤a和b获得。
[0116]
步骤a：制备(2s,4s)-4-(n-((1s,4r)-4-甲基环己基)三甲基乙酰胺基)吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁基)2-甲基酯
[0117][0118]
标题化合物通过国际公开号wo 2008/007930中公开的方法获得。
[0119]
ms[m na]＝447.5(m 23)
[0120]1h nmr(400mhz,cd3od)δ4.34(m,1h),3.90-3.75(m,2h),3.73(m,3h),3.45(m,2h),2.75-2.60(m,1h),2.30(m,1h),1.95(m,1h),1.85(m,2h),1.66(m,4h),1.50(m,2h),1.45-1.41(m,9h),1.25-1.20(m,9h),1.05(d,3h)
[0121]
步骤b：制备(2s,4s)-4-(n-((1s,4r)-4-甲基环己基)三甲基乙酰胺基)吡咯烷-2-甲酸甲酯盐酸盐
[0122][0123]
通过使用在步骤a中获得的(2s,4s)-4-(n-((1s,4r)-4-甲基环己基)三甲基乙酰胺基)吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁基)2-甲基酯(0.80g，1.88mmol)，以与制备例1的步骤e中相同的方式获得标题化合物(0.68g，99％)。
[0124]
ms[m h]＝325.4(m 1)
[0125]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ10.24(brs,1h),8.60(brs,1h),4.41(m,1h),4.22(m,1h),3.77(m,3h),3.40-3.28(m,3h),2.55(m,1h),2.20(m,1h),1.87(m,1h),1.70-1.50(m,6h),1.40(m,2h),1.21-1.10(m,9h),1.00(m,3h)
[0126]
实施例1：制备n-((3s,5s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-5-(吗啉-4-羰基)吡咯烷-3-基)-n-((1s,4r)-4-甲基环己基)异丁酰胺盐酸盐
[0127][0128]
标题化合物通过步骤a、b、c和d获得。
[0129]
步骤a：制备(2s,4s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-4-(n-((1s,4r)-4-甲基环己基)异丁酰胺基)吡咯烷-2-甲酸甲酯
[0130]
将在制备例1中获得的(2s,4s)-4-(n-((1s,4r)-4-甲基环己基)异丁酰胺基)吡咯烷-2-甲酸甲酯盐酸盐(28.7g，82.73mmol)，在制备例2中获得的(3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-甲酸(24.5g，86.87mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(22.2g，115.83mmol)和1-羟基苯并三唑水合物(15.7g，115.83mmol)溶解在n,n
’‑
二甲基甲酰胺(400ml)中，并缓慢添加n,n
’‑
二异丙基乙胺(72.0ml，413.66mmol)。在室温下搅拌16小时后，在减压下浓缩反应溶剂，然后添加0.5n氢氧化钠水溶液，并使用乙酸乙酯进行两次萃取。使用氯化钠水溶液和水清洗有机层两次，在无水硫酸镁上干燥并过滤。将滤液减压浓缩，并通过柱层析纯化，得到标题化合物(41.19g，87％)。
[0131]
ms[m h]＝575(m 1)
[0132]
步骤b：制备(2s,4s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-4-(n-((1s,4r)-4-甲基环己基)异丁酰胺基)吡咯烷-2-甲酸
[0133]
将步骤a中获得的(2s,4s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰
基)-4-(n-((1s,4r)-4-甲基环己基)异丁酰胺基)吡咯烷-2-甲酸甲酯(39.4g，68.62mmol)溶解在甲醇(450ml)中，并添加6n氢氧化钠水溶液(57.2ml，343.09mmol)。在室温下搅拌16小时并用6n盐酸水溶液将ph值调节至约5后，在减压下浓缩反应溶液。浓缩物溶解在二氯甲烷中，然后用纸过滤器过滤不溶性固体。滤液在减压下浓缩，得到粗产物(38.4g，99％)，该粗产物用于下一步，无需纯化。
[0134]
ms[m h]＝561(m 1)
[0135]
步骤c：制备n-((3s,5s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-5-(吗啉-4-羰基)吡咯烷-3-基)-n-((1s,4r)-4-甲基环己基)异丁酰胺
[0136]
步骤b中获得的(2s,4s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-4-(n-((1s,4r)-4-甲基环己基)异丁酰胺基)吡咯烷-2-甲酸(38.4g，68.60mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(18.4g，96.04mmol)和1-羟基苯并三唑水合物(13.0g，96.04mmol)溶解于n,n
’‑
二甲基甲酰胺(200ml)，然后缓慢顺序添加吗啉(5.9ml，68.80mmol)和n,n
’‑
二异丙基乙胺(59.7ml，343.02mmol)。在室温下搅拌16小时后，在减压下浓缩反应溶液，添加0.5n氢氧化钠水溶液，并用乙酸乙酯进行两次萃取。用氯化钠水溶液和水冲洗有机层两次，在无水硫酸镁上干燥并过滤。滤液在减压下浓缩，并通过柱层析纯化，以获得标题化合物(37.05g，86％)。
[0137]
ms[m h]＝630(m 1)
[0138]
步骤d：制备n-((3s,5s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-5-(吗啉-4-羰基)吡咯烷-3-基)-n-((1s,4r)-4-甲基环己基)异丁酰胺盐酸盐
[0139]
将步骤c中获得的n-((3s,5s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-5-(吗啉-4-羰基)吡咯烷-3-基)-n-((1s,4r)-4-甲基环己基)异丁酰胺(5.0g，7.95mmol)溶解在乙酸乙酯(50ml)中，并缓慢添加2n盐酸乙酸乙酯溶液(3.97ml，15.89mmol)。在室温下搅拌30分钟后，在减压下浓缩反应溶剂。所得粗固体通过使用己烷和乙醚研磨纯化，以获得标题化合物(5.23g，99％)。
[0140]
ms[m h]＝630(m 1)
[0141]1h nmr(500mhz,cd3od)δ7.49-7.44(m,4h),4.83(m,1h),4.23-4.20(m,1h),3.95-3.91(m,2h),3.79-3.47(m,14h),3.03-3.00(m,1h),2.86-2.82(m,1h),2.73-2.67(m,1h),2.20-2.14(m,1h),1.97(m,1h),1.80-1.62(m,5h),1.50(s,9h),1.44-1.27(m,3h),1.06-1.04(m,9h)
[0142]
实施例2：制备n-((3s,5s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-5-(吗啉-4-羰基)吡咯烷-3-基)-n-((1s,4r)-4-甲基环己基)丙酰胺盐酸盐
[0143]
[0144]
标题化合物通过步骤a、b、c和d获得。
[0145]
步骤a：制备(2s,4s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-4-(n-((1s,4r)-4-甲基环己基)丙酰胺基)吡咯烷-2-甲酸甲酯
[0146][0147]
通过使用在制备例3中获得的(2s,4s)-4-(n-((1s,4r)-4-甲基环己基)丙酰胺基)吡咯烷-2-甲酸甲酯盐酸盐(0.76g，2.28mmol)和在制备例2中获得的(3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-甲酸(0.64g，2.28mmol)，以与实施例1步骤a中相同的方式获得标题化合物(0.45g，35％)。
[0148]
ms[m h]＝560.4(m 1)
[0149]1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.39-7.30(m,4h),4.45(m,1h),4.04(m,1h),3.71(s,3h),3.65-3.35(m,6h),3.13(m,2h),2.99(m,1h),2.71(m,1h),2.34(q,2h),2.20(m,1h),1.92(m,1h),1.75-1.55(m,6h),1.42(m,2h),1.22(m,9h),1.03(m,6h)
[0150]
步骤b：制备(2s,4s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-4-(n-((1s,4r)-4-甲基环己基)丙酰胺基)吡咯烷-2-甲酸
[0151][0152]
通过使用在步骤a中获得的(2s,4s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-4-(n-((1s,4r)-4-甲基环己基)丙酰胺基)吡咯烷-2-甲酸甲酯(0.45g，0.80mmol)，以与实施例1的步骤b中相同的方式获得标题化合物(0.44g，99％)。
[0153]
ms[m h]＝546.4(m 1)
[0154]
步骤c：制备n-((3s,5s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-5-(吗啉-4-羰基)吡咯烷-3-基)-n-((1s,4r)-4-甲基环己基)丙酰胺
[0155][0156]
通过使用在步骤b中获得的(2s,4s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-4-(n-((1s,4r)-4-甲基环己基)丙酰胺基)吡咯烷-2-甲酸(0.44g，0.80mmol)，以与实施例1的步骤c中相同的方式获得标题化合物(0.28g，53％)。
[0157]
ms[m h]＝615.5(m 1)
[0158]1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.36(m,4h),4.79(m,1h),4.18(m,1h),3.80-3.40(m,15h),3.20(m,1h),3.03(m,1h),2.70(m,1h),2.33(q,2h),2.15(m,1h),1.93(m,1h),1.71-1.56(m,6h),1.40-1.20(m,11h),1.00(m,6h)
[0159]
步骤d：制备n-((3s,5s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-5-(吗啉-4-羰基)吡咯烷-3-基)-n-((1s,4r)-4-甲基环己基)丙酰胺盐酸盐
[0160][0161]
通过使用在步骤c中获得的n-((3s,5s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-5-(吗啉-4-羰基)吡咯烷-3-基)-n-((1s,4r)-4-甲基环己基)丙酰胺(0.08g，0.13mmol)，以与实施例1的步骤d中相同的方式获得标题化合物(0.08g，94％)。
[0162]
ms[m h]＝615.5(m 1)
[0163]1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.43(m,4h),4.82(t,1h),4.20(m,1h),4.06-3.40(m,15h),2.97(m,1h),2.69(m,1h),2.33(m,2h),2.15(m,1h),1.93(m,1h),1.80-1.53(m,5h),1.47(s,9h),1.50-1.25(m,4h),1.01(m,6h)
[0164]
实施例3：制备n-((3s,5s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-5-(吗啉-4-羰基)吡咯烷-3-基)-n-((1s,4r)-4-甲基环己基)三甲基乙酰胺盐酸盐
[0165][0166]
标题化合物通过步骤a、b、c和d获得。
[0167]
步骤a：制备(2s,4s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-4-(n-((1s,4r)-4-甲基环己基)三甲基乙酰胺基)吡咯烷-2-甲酸甲酯
[0168][0169]
使用制备例4中获得的(2s,4s)-4-(n-((1s,4r)-4-甲基环己基)三甲基乙酰胺基)吡咯烷-2-甲酸甲酯盐酸盐(0.65g，1.8mmol)和制备例2中获得的(3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-甲酸(0.50g，1.8mmol)，以与实施例1步骤a中相同的方式获得标题化合物(0.70g，66％)。
[0170]
ms[m h]＝588.5(m 1)
[0171]1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.40-7.30(m,4h),4.49(m,1h),4.00-3.50(m,4h),3.71(s,3h),3.40(m,3h),3.20-3.05(m,2h),3.00(m,1h),2.70(m,1h),2.27(m,1h),1.90(m,1h),1.73-1.60(m,6h),1.60-1.35(m,2h),1.25-1.17(m,18h),1.01(m,3h)
[0172]
步骤b：制备(2s,4s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-4-(n-((1s,4r)-4-甲基环己基)三甲基乙酰胺基)吡咯烷-2-甲酸
[0173][0174]
通过使用在步骤a中获得的(2s,4s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-4-(n-((1s,4r)-4-甲基环己基)三甲基乙酰胺基)吡咯烷-2-甲酸甲酯(0.10g，0.18mmol)，以与实施例1的步骤b中相同的方式获得标题化合物(0.10g，99％)。
[0175]
ms[m h]＝574.4(m 1)
[0176]
步骤c：制备n-((3s,5s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰
基)-5-(吗啉-4-羰基)吡咯烷-3-基)-n-((1s,4r)-4-甲基环己基)三甲基乙酰胺
[0177][0178]
通过使用在步骤b中获得的(2s,4s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-4-(n-((1s,4r)-4-甲基环己基)三甲基乙酰胺基)吡咯烷-2-甲酸(0.10g，0.18mmol)，以与实施例1的步骤c中相同的方式获得标题化合物(0.020g，17％)。
[0179]
ms[m h]＝643.5(m 1)
[0180]1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.40-7.30(m,4h),4.79(m,1h),4.17(m,1h),3.80-3.40(m,15h),3.10(m,1h),2.96(m,1h),2.71(m,1h),2.15(m,1h),1.90(m,1h),1.80-1.35(m,8h),1.21-1.15(m,18h),1.02(m,3h)
[0181]
步骤d：制备n-((3s,5s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-5-(吗啉-4-羰基)吡咯烷-3-基)-n-((1s,4r)-4-甲基环己基)三甲基乙酰胺盐酸盐
[0182][0183]
通过使用在步骤c中获得的n-((3s,5s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-5-(吗啉-4-羰基)吡咯烷-3-基)-n-((1s,4r)-4-甲基环己基)三甲基乙酰胺(0.33g，0.51mmol)，以与实施例1的步骤d中相同的方式获得标题化合物(0.29g，83％)。
[0184]
ms[m h]＝643.5(m 1)
[0185]1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.41(m,4h),4.80(m,1h),4.13(m,1h),3.90(m,2h),3.80-3.40(m,13h),2.94(m,1h),2.63(m,1h),2.11(m,1h),1.93(m,1h),1.75(m,2h),1.60(m,4h),1.46(s,9h),1.15(s,9h),1.45-1.30(m,3h),1.01(m,3h)
[0186]
比较例1：制备n-((3s,5s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(2,4-二氟苯基)吡咯烷-3-羰基)-5-(吗啉-4-羰基)吡咯烷-3-基)-n-(4,4-二甲基环己基)乙酰胺盐酸盐(a95)
[0187][0188]
国际公开号wo 2008/007930的a95化合物通过与其中公开的相同方法获得。
[0189]
比较例2：制备n-((3s,5s)-1-((3s,4r)-1-(叔丁基)-4-(4-氯苯基)吡咯烷-3-羰基)-5-(吗啉-4-羰基)吡咯烷-3-基)-n-(4,4-二甲基环己基)乙酰胺盐酸盐(a96)
[0190][0191]
国际公开号wo 2008/007930中a96化合物通过与其中公开的相同方法获得。
[0192]
实验例1：荧光素酶测定
[0193]
为了测定激动剂针对mc4r(黑皮质素-4受体)的能力，建立了在mc4r和cre(camp反应元件)控制下永久表达荧光素酶基因(cre-luc)的细胞系。在制备含有mc4r基因的哺乳动物细胞表达载体(pcdna3(neo))(invitrogen)后，使用lipofectamine 2000(invitrogen)和在camp反应元件(cre)的控制下表达荧光素酶基因(cre-luc)的载体(pcre-luc)(stratagen)转化人类胚胎肾(hek)细胞系。转化细胞系(hek mc4r-luc)在37℃培养箱中，在5％co2存在下，使用含有10％热灭活胎牛血清(gibco/brl)的dulbecco改良eagles培养基(dmem)培养24小时。细胞系在含有10毫升选择培养基(10％热灭活胎牛血清(gibco/brl)、100单位/ml青霉素(gibco/brl)、100单位/ml链霉素(gibco/brl)和800μg/ml遗传霉素(g418)(gibco/brl)的dulbecco改良eagles培养基(dmem)中培养四天。用10ml新选择培养基替换选择培养基以去除被选择培养基杀死的细胞的过程重复三次，每4天一次。在显微镜下将最终选择和繁殖的克隆形成的单个菌落转移到24孔细胞培养板上，每个孔含有1ml选择培养基，并培养4天。用最终浓度为10μm的forskolin(sigma)处理，然后在37℃培养箱中在5％co2存在下培养5小时。每个孔用50μl的bright-glo荧光素酶试剂(promega)处理，并在室温下放置15分钟，然后使用光度计(victor)测量每个孔的发光。选择通过forskolin处理显示出发光量100倍或更多倍于基本值的克隆，并用于测量每种化合物的mc4r激动剂能力。
[0194]
将hek mc4r-luc细胞添加到9 6孔光度计细胞培养板(costar)的每个孔中，规模为在100μl培养基中培养2.5
×
104个细胞，然后在37℃培养箱中在6％co2存在下培养18小时。使用上述培养基在每一步浓度下稀释mcr激动剂，使最终dmso浓度不超过1％，然后在37℃培养箱中在6％co2存在下培养5小时。每个孔用50μl的bright-glo荧光素酶试剂
(promega)处理，并在室温下放置5分钟，然后使用光度计(victor)测量每个孔的发光。在每一步浓度下稀释的激动剂诱导的发光量转换为相对于10μm ndp-α-msh处理显示的发光量的相对％值。ec
0.5 msh表示为诱导ndp-α-msh可诱导的最大发光量的50％的浓度，并且ec50表示为诱导每种激动剂可诱导的最大发光量的50％的浓度。使用统计软件(prizm)测量测量值。
[0195]
表1显示了通过上述实验获得的每种化合物的mc4r激动剂能力的测量结果，单位为ec
50
(nm)。
[0196]
[表1]
[0197][0198]
如表1所示，已证实，在众所周知的体内黑皮质素受体中，关于参与体内能量代谢和体重控制的黑皮质素-4受体(mc4r)，实施例化合物比比较例化合物(a95和a96)具有更优异的mc4r激动剂能力。
[0199]
实验例2：camp测定
[0200]
黑皮质素受体是一种g蛋白偶联受体(gpcr)，g蛋白的主要作用是通过信号转导激活二级传感器，调节细胞对多种生理刺激的反应。mc4r是一种gs偶联受体，众所周知，如果mc4r与激动剂相互作用，腺苷酸环化酶(ac)被激活以增加细胞中二级传感器之一环腺苷酸(camp)的浓度。因此，可以通过测量camp信号的产生来评估黑皮质素受体的活性。
[0201]
在建立mc1r、mc3r、mc4r和mc5r均过表达的camp-hunter gs偶联细胞系(cho-k1细胞系)后，可测量因激动剂反应导致的细胞内camp水平的增加，将细胞接种到白色细胞培养板的每个孔中，并在37℃培养箱中在5％co2存在下培养24小时。培养后，去除培养基，并添加15μl 2:1hbbs/10mm hepes:camp xs ab试剂。添加5μl用缓冲液稀释4次的样品后，将溶媒浓度设置为1％，并添加在每个步骤浓度下稀释的mc4r激动剂化合物，然后在37℃下反应30分钟。每种激动剂化合物的活性(％)表示为100％x(样品的平均rlu值-溶媒对照的平均rlu值)/(最大对照的平均rlu值-溶媒对照的平均rlu值)，该值由cbis数据分析套件(加利福尼亚州cheminnovation)进行分析。
[0202]
表2显示了通过上述实验获得的化合物的黑皮质素受体激动剂能力的测量结果，单位为ec
50
(nm)。
[0203]
[表2]
[0204][0205]
如表2所示，已证实，在众所周知的体内黑皮质素受体中，关于参与体内能量代谢和体重控制的黑皮质素-4受体(mc4r)，实施例化合物比比较例化合物(a95和a96)具有更优异的受体激动剂能力。
[0206]
实验例3：β-阻遏蛋白测定
[0207]
黑素皮质素受体是一种g蛋白偶联受体(gpcr)，通过传递多种神经递质的信号来调节各种生理反应。当gpcr被磷酸化时，β-阻遏蛋白与受体的磷酸化部分结合，并通过与其它蛋白质的相互作用在激活细胞中的各种信号通路中发挥重要作用。众所周知，当黑皮质素受体与激动剂相互作用时，β-阻遏蛋白被调动并参与β-阻遏蛋白介导的信号通路。因此，黑皮质素受体的活性可以通过测量β-阻遏蛋白来评估。
[0208]
建立了一种pathhunter expressβ-阻遏蛋白细胞系(u2os细胞系)，其中同时表达prolink(pk)标记的mc1r、mc3r、mc4r、mc5r和酶受体(ea)标记的β-阻遏蛋白。当该细胞系的mcr-pk部分被激活时，β-阻遏蛋白-ea被调动，并且作为β-半乳糖苷酶片段的酶受体(ea)和prolink(pk)相互作用。激活的酶通过β-半乳糖苷酶活性水解底物，产生化学发光信号，从而可以测量活性。培养pathhunterβ-阻遏蛋白细胞系(u2os细胞系)后，将细胞接种到细胞培养板的每个孔中，并在37℃培养箱中在5％co2存在下培养48小时。培养后，添加5μl用缓冲液稀释5次的样品，将溶媒浓度设置为1％，并添加在每一步浓度下稀释的mc4r激动剂化合物，然后在37℃下反应90分钟。每种激动剂化合物的活性(％)表示为100％x(样品的平均rlu值-溶媒对照的平均rlu值)/(对照配体的平均最大值-溶媒对照的平均rlu值)，该值由cbis数据分析套件(加利福尼亚州cheminnovation)分析。
[0209]
表3显示了通过上述实验获得的每种化合物的黑皮质素受体活性能力的测量结果，单位为ec
50
(nm)。
[0210]
[表3]
[0211]
[0212]
如表3所示，已经证实，在众所周知的体内黑皮质素受体中，关于参与体内能量代谢和体重控制的黑皮质素-4受体(mc4r)，实施例化合物比比较例化合物(a95和a96)具有更优异的受体激动剂能力。
[0213]
实验例4：结合亲和力
[0214]
已知五种体内黑皮质素受体(mcr)亚型，已知亚型4mc4r参与能量代谢和体重控制。由于其它mcr亚型参与各种体内功能的调节，如皮肤色素沉着、能量稳态和外分泌功能，因此确保mc4r激动剂化合物对mc4r的选择性对于预防未来可能的副作用非常重要。因此，测定了mc4r激动剂对每个mcr亚型的受体结合能力。
[0215]
在建立表达人重组mc1r的cho-k1细胞系和表达mc3r、mc4r和mc5r的hek-293细胞系后，从每个细胞系收集膜。在96孔细胞培养板中，每孔3μg mc1r膜和0.04nm 125
i-ndp-α-msh在37℃下反应2小时。3μg mc3r和mc5r膜与0.035nm 125
i-ndp-α-msh在37℃下反应1小时，3.12μg mc4r膜与0.02nm 125
i-ndp-α-msh在37℃下反应2小时。此时，将含有在每个步骤浓度下稀释的mcr激动剂的25mm hepes-koh吸附缓冲液(ph 7.0)添加到每个孔中并反应。将反应溶液转移到过滤器中，并用吸附缓冲液清洗，然后测量放射性。从每个总结合量中排除在1μm(mc1r)和3μm(mc3r、mc4r、mc5r)的ndp-α-msh存在下的非特异性结合量的值，用作
125
i-ndp-α-msh的特异性结合量。测量在每一步浓度下稀释的激动剂对
125
i-ndp-α-msh特异性结合的抑制程度。ic50表示为抑制50％的
125
i-ndp-α-msh特异性结合的每种激动剂的浓度。
[0216]
表4显示了通过上述实验获得的化合物的黑皮质素受体结合的测量结果，单位为ki(nm)。
[0217]
[表4]
[0218][0219]
如表4所示，已经证实，在已知的体内黑素皮质素受体中，关于参与体内能量代谢和体重控制的黑皮质素-4受体(mc4r)，实施例化合物比比较例(a95和a96)化合物具有更优异的受体结合能力。
[0220]
实验例5：药代动力学和药物代谢
[0221]
实验例5-1：药代动力学曲线
[0222]
为了研究实施例1化合物和比较例化合物的药代动力学(pk)特性，进行了以下实验。
[0223]
为了对实施例1的化合物和比较例化合物(a95和a96)进行pk试验，准备约7周龄的c57bl6小鼠，每个给药物质分配12个个体，分成组，并使其饥饿以进行口服给药。给药当天，
以蒸馏水(dw)为溶媒制备浓度为1mg/ml的药物溶液，并以每千克体重1ml的剂量口服给药，最终剂量为10mg/kg。在给药后1、3、8和24小时，通过心脏采血从每组的3名个体中采集全血，然后放置在肝素管中以防止凝血。此后，收集每个个体的大脑并将其置于ep管中，测量组织的重量，并在-20℃下进行冷冻储存。
[0224]
在分析当天，将体积为组织重量4倍的ddw添加到每个组织管中并均质化，并在室温下解冻储存的血浆。与血浆一样，取50μl组织匀浆并转移到单独的管中，然后向血浆和组织匀浆的每根管中添加200μl乙腈(an)，其总量为样品体积的4倍，以进行脱蛋白。在这种情况下，an包括一个内标。为了制备校准曲线，制备已知浓度为0.1ng/ml、0.5ng/ml、5ng/ml、50ng/ml和500ng/ml的an溶液(含内标)，并在每个血浆和大脑的空白血浆中以上述4倍的体积进行脱蛋白。因此，制备了对于血浆0.4ng/ml至2,000ng/ml以及对于大脑1ng/ml、5ng/ml、50ng/ml、500ng/ml和5,000ng/ml的最终校准曲线。将脱蛋白后获得的上清液0.5μl注入lc-ms/ms后，用is的峰面积校正实施例和比较例化合物(a95和a96)的峰面积，以获得每个样品采集点的峰响应，并通过校准曲线进行浓度转换。
[0225]
对于每个给药组随时间变化的血药浓度值，通过使用winnonlin8.1的非房室模型分析方法计算药代动力学参数(c
最大
、auc
inf
、t
1/2
等)。
[0226]
通过比较各给药组的暴露、半衰期变化等，比较各化合物的药代动力学特征，所得值如表5和表6所示。此外，根据大脑暴露与血液暴露的比率得出的结果值如表7所示。
[0227]
[表5]
[0228][0229]
[表6]
[0230][0231]
[表7]
[0232][0233]
根据上述结果，按照实施例1化合物、比较例2化合物(a96)和比较例1化合物(a95)
的顺序，确认在全身和大脑中每种化合物的暴露。在观察期间，大脑中损失的半衰期高于血液中观察到的值，假定这意味着一系列物质在功效表达部位的有效持久性。此外，已证实，当以相同剂量给药每种化合物时，实施例化合物在大脑中的绝对暴露和持久性最优异。此外，与比较例化合物(a95和a96)相比，已经证实实施例1化合物的大脑暴露与血液暴露的比率也是最优异的。
[0234]
除这些结果外，当综合考虑每种化合物的体外活性和药物的持久性时，当给药相同剂量时，与比较例化合物相比，能够预期实施例1化合物的功效最佳。为了达到特定水平的功效，可给药较低剂量，因此，预期可将全身暴露引起的副作用降至最低。
[0235]
实验例5-2：cyp抑制(％)
[0236]
为了证实药物与cyp(细胞色素p450)同工酶的相互作用，进行了以下实验。
[0237]
为了测量和实施例1化合物和比较例2化合物(a96)的抑制能力，制备cyp1a2、2c9、2c19、2d6和3a4重组酶。关于探针底物、阳性对照物、同工酶的使用以及测量每种物质抑制能力的测量条件，参考下表8。
[0238]
[表8]
[0239][0240]
在96孔板(costar，3792黑色，圆底)中进行培养，用于代谢的缓冲系统为50mm磷酸钾缓冲液，ph为7.4，最终反应体积为250μl。总缓冲液中的实施例1化合物、比较例2化合物(a96)、阳性对照物的最终浓度为10μm(2％甲醇(v/v))，每种均包括阴性对照物(仅甲醇，2％(v/v))。加入实验化合物的缓冲液与相同体积的cyp同工酶制备溶液混合，使最终浓度为10μm，然后在37℃荧光平板读取器中预热10分钟。每个孔添加nrs溶液(nadph再生系统：0.22mmβ-nadp、2.8mm葡萄糖-6-磷酸和0.6单位/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)，然后预培养30分钟。此后，通过将底物添加到经过预培养的孔中来启动反应，并在每个底物的测量波长下以1分钟的间隔监测30分钟。将从阳性对照物和实施例1化合物获得的测量值与阴性对照物(无抑制或化合物)的荧光强度进行比较，以确认每种化合物对同工酶的抑制能力。当每种化合物在10μm下处理时，对每种同工酶的抑制能力(％)如表9所示。抑制活性(％)的表示基于以下标准：a＝《50％，b＝》50％。
[0241]
化合物10μm的治疗浓度非常高，基于该治疗浓度评估抑制能力并选择抑制率低于50％的药物作为候选药物是保守的标准。可以认为，在这种情况下，所选候选药物抑制cyp
同工酶的可能性最小。
[0242]
[表9]
[0243][0244]
根据上述结果，当以相同浓度处理时，证实实施例1化合物对主要cyp同工酶的抑制能力低于或类似于比较例2化合物(a96)。值得关注的是，比较例2化合物(a96)由于对cyp2c9具有非常高的抑制能力而具有药物相互作用。已知cyp2c9参与约10％的所有商用药物的代谢，并在治疗窗口狭窄的药物的功效丧失中起主要作用。此外，cyp2c9在研究和临床方面都具有非常重要的意义，因为据报道，多态性取决于每个个体。这也可以从以下事实中得知：cyp2c9出现在fda药物-药物相互作用(ddi)指南中在药物开发过程中应检查其抑制作用的基本同工酶列表中。
[0245]
基于此，确定当给药实施例1化合物时，由cyp抑制引起的药物相互作用低于比较化合物(a96)。
[0246]
实验例6：药理学
[0247]
在以下肥胖模型中评估本发明化合物的黑皮质素-4受体激动剂的药理作用。
[0248]
实验例6-1：高脂饮食诱导的小鼠肥胖模型
[0249]
采用高脂饮食诱导的小鼠肥胖模型，评估黑皮质素-4受体激动剂对肥胖的影响。
[0250]
五周龄的雄性c57bl/6n taconic小鼠用60kcal％的脂肪饮食(d12492，研究饮食)喂养15周以引发肥胖。在蒸馏水中制备实施例1化合物、比较例化合物(a95和a96)以及作为阳性对照物的西布曲明，并从第1天到第16天每天一次口服给药于通过高脂肪饮食引发的19周龄小鼠肥胖模型。从第1天到第16天，每天测量一次体重，每周测量五次膳食摄入量，每周测量两次饮用水摄入量。在第15天测量血糖和糖化血红蛋白，并在第17天处死所有动物。通过腹腔腔静脉采集血液，取出肝脏和附睾脂肪组织并称重。采集的血液置于肝素管中，离心分离血浆，然后进行血浆生化分析。
[0251]
表10显示了在第12天测得的每种化合物的每一剂量相比于溶媒的重量变化率的差异。
[0252]
[表10]
[0253]
第12天10mg/kg30mg/kg实施例1-9.4％*-15.1％**比较例1-4.8％-4.0％比较例2-0.2％-7.1％西布曲明-6.8％nt(未测试)
[0254]
(相比于溶媒的重量变化率的差异)
[0255]
溶媒对照组和化合物处理组之间体重的显著差异：*p《0.05，**p《0.01(平均值
±
sem，学生t检验，非配对，双尾)
[0256]
在该小鼠肥胖模型中，尤其是当仅给药实施例1化合物时，显示出显著的重量减
轻。当以10mg/kg和30mg/kg的剂量给药实施例1化合物时，与溶剂给药的溶媒对照相比，分别导致-9.4％和-15.1％的重量增加抑制，并且与比较例化合物(a95和a96)相比，显示出统计上显著的重量减轻效果。
[0257]
这是由于与比较例化合物相比，实施例1化合物具有更优越的体外mc4r激动剂能力、更优越的大脑绝对暴露性和持久性以及优异的大脑暴露与血液暴露的比率，人们认为，即使在低剂量下，也可以表现出显著的差异。
[0258]
此外，与西布曲明(reducetil)相比，实施例1化合物在功效方面表现出相等或更高的优越结果，西布曲明是相关领域中的肥胖治疗剂，因此预期实施例1化合物在实际临床应用中表现出显著的药物功效。