宽体金线蛭抗凝血因子XIa多肽及其应用的制作方法

宽体金线蛭抗凝血因子xia多肽及其应用
技术领域
1.本发明属于多肽领域，涉及宽体金线蛭抗凝血因子xia多肽及其突变体的应用。


背景技术：

2.血栓性疾病是危害人类健康的常见疾病，是全球主要的死亡原因。尽管传统抗血栓药物如肝素或华法林在临床应用中具有良好的抗栓效果，但其干扰了机体促凝血与抗凝血的精妙平衡，常伴有出血等并发症。因此，研发出血风险小的抗血栓药物具有十分重要的价值。
3.临床资料显示，先天缺乏凝血因子xi(factor xi,fxi)的患者患缺血性脑卒中及深静脉血栓的比率明显降低，且一般无自发性出血。研究发现fxi能增强血栓形成中凝血酶的生成，而在止血过程中对凝血酶的生成作用有限。因此，fxi/fxia抑制剂具备低出血风险的特点，以fxi/fxia为靶点研发抗栓药物成为目前新药研发热点。
4.宽体金线蛭分布广泛，其唾液腺中含有大量抗栓活性组分如凝血酶抑制剂水蛭素，fxa抑制剂antistasin等，广泛应用于抗栓治疗。目前未发现有来源于宽体金线蛭的抑制fxi/fxia的多肽。


技术实现要素：

5.本发明目的在于提供一种全新的抑制fxia的多肽。
6.技术方案
7.宽体金线蛭(whitmania pigra)唾液腺转录组数据库中筛选得到kunitz型多肽序列，对其进行构建表达、筛选、氨基酸替换，得到一系列多肽；
8.该多肽及其突变体具有抗血栓活性，具有治疗血栓性疾病的价值。该多肽来源于宽体金线蛭(whitmania pigra)唾液腺转录组信息，命名为wpk1-5；
9.经克隆表达，初步筛选得到抗栓活性较强的wpk5。后为提高wpk5抗栓效果，以wpk5的全新kunitz骨架为基础，本发明采用loop替换策略来提高其活性。以wpk5的全新kunitz骨架为基础，采用高效凝血因子xia抑制剂pn2kpi中的loop1(
11
tgpcramisr
20
)和loop2(
34
fyggc
38
)，替换wpk5中的loop1(
11
tgpcrsnler
20
)和loop2(
34
qyggc
38
)，得到新多肽，命名为wpk5-mut。
10.本发明所提供的wpk1-5，wpk5-mut的氨基酸序列为：
11.[0012][0013]
所述的多肽在制备抗血栓药物中的应用：
[0014]
本发明提供的多肽wpk5，经测试对凝血因子xia具有抑制活性，ic
50
为978.20
±
52.15nm。本发明提供的多肽wpk5-mut，经测试对凝血因子xia具有较强的抑制活性，ic
50
为8.34
±
0.20nm。
[0015]
本发明提供的多肽wpk5-mut，经测试可剂量依赖性的延长三氯化铁诱导的小鼠颈动脉血栓形成时间且有效剂量为40μmol/kg，pn2kpi有效剂量为80μmol/kg。
[0016]
本发明提供的多肽wpk5-mut，经测试在40μmol/kg和80μmol/kg剂量下没有出血风险，证明其安全。
[0017]
有益效果：
[0018]
1、本发明从宽体金线蛭(whitmania pigra)唾液腺转录组数据库中筛选得到kunitz型多肽序列，对其进行构建表达、筛选、氨基酸替换，得到一系列多肽，命名为wpk1-5，其中所有的多肽序列为全新的序列，尽管其中部分序列的抗凝血活性不强，但依然可以作为多肽抗凝血药物的前药，对其可以进行修饰。此外在wpk5基础上对其两个loop氨基酸进行替换，命名为wpk5-mut对其进行克隆表达。
[0019]
体外药效实验证实：
[0020]
(1)wpk5对凝血因子xia有抑制活性，ic
50
为978.20
±
52.15nm；wpk5-mut对凝血因子xia有更强抑制活性，ic
50
为8.34
±
0.20nm。
[0021]
(2)该多肽wpk5-mut剂量依赖性的延长aptt(活化部分凝血活酶时间)，对pt(凝血酶原时间)无影响。
[0022]
动物体内实验证实：
[0023]
(1)该多肽wpk5-mut可剂量依赖性的延长三氯化铁诱导的小鼠颈动脉血栓形成时间，且活性优于pn2kpi。
[0024]
(2)该多肽wpk5-mut经小鼠断尾出血实验，在40μmol/kg和80μmol/kg剂量下无明显出血风险。
[0025]
总之，本发明多肽wpk5-mut具有抗凝血作用，体内活性相较pn2kpi更强，同时在一定剂量下无出血风险，可以用于脑损伤(如中风，脑中卒)等疾病预防与治疗。具有安全有效等特点，适合于抗血栓药物研究与开发。
附图说明
[0026]
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明的发明范围。
[0027]
图1为wpk1-5经纯化后电泳图；
[0028]
图2为wpk5-mut经纯化后电泳图；
[0029]
图3为wpk5对凝血因子xia的ic
50
图，a为不同浓度的405nm的吸收值；b为抑制率；
[0030]
图4为wpk5-mut对凝血因子xia的ic
50
图，a为不同浓度的405nm的吸收值；b为抑制率。
具体实施方式
[0031]
pn2kpi依据文献报道(navaneetham d et al.structural and mutational analyses of the molecular interactions between the catalytic domain of factor xia and the kunitz protease inhibitor domain of protease nexin 2.[j].the journal of biological chemistry,2005,280(43))，共57个氨基酸，包含loop1、loop2，可高效抑制凝血因子xia和三氯化铁诱导的小鼠颈动脉血栓形成，对其进行构建表达以供后续研究。
[0032]
实施例1：wpk系列多肽的发现
[0033]
取宽体金线蛭唾液腺，使用磁珠富集mrna，进行片段化，随机引物合成cdna第一链以及第二链，使用qiaquickpcr试剂盒纯化，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，pcr扩增，完成文库构建。使用illumina hiseq 4000测序，使用trinity(2.4.0版)进行转录组无参转录组de novo分析，blast注释和pfam分析，以“kunitz”为关键词搜索得到5条序列，命名为wpk1-5。序列信息如下：
[0034][0035]
实施例2：wpk系列多肽对凝血因子xia的抑制作用
[0036]
重组质粒ppic9k/wpk构建：采用无缝克隆(克隆位点noti)将wpk1-5序列克隆到ppic9k中，使用saci线性化后电转入毕赤酵母gs115中，经pcr和测序鉴定阳性转化子菌落，挑取阳性转化子菌落到生长培养基bmgy中，28.5℃，220r/min振荡培养，当菌液od600在4-6左右时，4000r/min，离心5min，将菌体转入表达培养基bmmy中，加入终浓度1％甲醇诱导，72h后离心收上清，经纯化得到wpk1-5目的蛋白(图1)。测wpk系列多肽对凝血因子xia的抑制活性，吸取100μl fxia(1nm)与50μl wpk1-5(10μm)于96孔板中混合均匀，37℃孵育1h，加入50μl底物fxia发色底物为s2366，终浓度为0.25mm，在405nm波长下持续检测1h，每分钟扫描一次。阴性对照：50μl tbs-bsa缓冲液 100μl fxia 50μl底物，空白对照：50μl样品 100μl tbs-bsa缓冲液 50μl底物(所有孔均设置复孔)。绘制吸光度值-反应时间曲线，曲线的斜率即为酶促反应的速度v，阴性反应速度v0，样品反应速度vi，抑制率＝(v
0-vi)/v0×
100％。
[0037][0038]
结论：wpk5在此系列多肽中对凝血因子xia的抑制活性较强。
[0039]
实施例3：本发明提供的多肽突变体wpk5-mut序列及其与pn2kpi序列比对
[0040]
pn2kpi通过loop1(
11
tgpcramisr
20
)和loop2(
34
fyggc
38
)与xia催化结构域进行广泛的相互作用，对凝血因子xia表现出良好的抑制活性。本实施例中，为了进一步提高wpk5对凝血因子xia的抑制活性，采用loop替换的方法，以wpk5所提供的全新kunitz骨架为基础，使用pn2kpi两loop(
11
tgpcramisr
20
、
34
fyggc
38
)针对wpk-5两loop(
11
tgpcrsnler
20
、
34
qyggc
38
)进行替换。并对wpk5-mut与pn2kpi氨基酸序列分析，其相似性为60.78％。
[0041][0042]
实施例4：本发明提供的多肽突变体wpk5-mut的克隆表达及纯化
[0043]
重组质粒ppic9k/wpk5-mut构建：采用无缝克隆(克隆位点noti)将wpk5-mut序列克隆到ppic9k中，使用saci线性化后电转入毕赤酵母gs115中，经pcr和测序鉴定阳性菌落，挑取阳性菌落到生长培养基bmgy中，28.5℃，220r/min振荡培养，当菌液od600在4-6左右时，4000r/min，离心5min，将菌体转入表达培养基bmmy中，加入终浓度1％甲醇诱导，72h后离心收上清，经纯化得到目的蛋白。tricine-sds-page电泳分析显示，重组wpk5-mut蛋白获得高效表达，wpk5-mut蛋白为6.5kda，与预期重组蛋白的大小一致(图2)。
[0044]
实施例5：本发明提供的多肽wpk5与突变体wpk5-mut对凝血因子xia的抑制作用
[0045]
本实施例所述的多肽wpk5、多肽wpk5-mut是通过在毕赤酵母中重组表达、镍柱亲和层析获得。用发色底物法检测该重组多肽对凝血因子xia的抑制作用。
[0046]
吸取100μl fxia(1nm)与50μl wpk5(0-57500nm)、wpk5-mut(0-100nm)于96孔板中混合均匀，37℃孵育1h，加入50μl底物，fxia发色底物为s2366，终浓度为0.25mm，在405nm波长下持续检测1h，每分钟扫描一次。阴性对照：50μl tbs-bsa缓冲液 100μl fxia 50μl底物，空白对照：50μl样品 100μl tbs-bsa缓冲液 50μl底物(所有孔均设置复孔)。绘制吸光度值-反应时间曲线，曲线的斜率即为酶促反应的速度v，阴性反应速度v0，样品反应速度vi，抑制率＝(v
0-v)i/v0×
100％。使用软件graphpad prism 6.0进行数据处理(图3a，b；图4a，b)。
[0047]
结论：该多肽wpk5对凝血因子xia有抑制活性，ic
50
为978.20
±
52.15nm；该多肽wpk5-mut对凝血因子xia有较强抑制活性，ic
50
为8.34
±
0.20nm。
[0048]
实施例6：本发明提供的多肽wpk5-mut的抗凝活性
[0049]
本实施例中，用活化部分凝血活酶时间(aptt)及凝血酶原时间(pt)法检测本发明提供的多肽突变体(wpk5-mut)的抗凝活性。本实施例所述的多肽(wpk5-mut)是通过在毕赤酵母中重组表达、经镍柱亲和层析获得(见实施例4)。
[0050]
活化部分凝血活酶时间(aptt)测定：将40μl ppp和10μl样品溶液(空白对照组用生理盐水)在测试杯中混匀，37℃孵育3min。加入50μl aptt试剂，37℃继续孵育3min。将测试杯放于测试区，加入磁珠，然后加入50μl已经在37℃预热5min的cacl2溶液，立即开始反应。待测试杯中小磁珠停止转动，表示实验结束，读取血凝仪上纤维蛋白形成时间。通过计算该重组多肽延长凝血时间的倍数值分析其延长aptt的能力，计算公式为：延长aptt倍数＝(测定的各浓度aptt值-空白对照组aptt值)/空白对照组aptt值。
[0051]
凝血酶原时间(pt)测定：将40μl ppp和10μl样品溶液在测试杯中混匀，37℃孵育3min。将测试杯放于测试区，加入磁珠，然后加入100μl已经预热5min的pt试剂，立即开始反应。待测试杯中小磁珠停止转动，表示实验结束，读取血凝仪上纤维蛋白形成时间。
[0052]
结论：该多肽wpk5-mut剂量依赖性的延长aptt，对pt无影响。
[0053][0054][0055]
实施例7：本发明提供的多肽wpk5-mut对三氯化铁诱导的小鼠颈动脉血栓形成的抑制作用及其与pn2kpi体内活性对比
[0056]
小鼠(c57bl/6j，雄性，18-22g)腹腔注射5％水合氯醛麻醉。麻醉成功后将小鼠按仰卧位固定在加热垫(37℃)上保持体温。在小鼠颈部正中切口，逐步分离筋膜和肌肉，暴露出颈动脉，并钝性分离出颈动脉约5mm左右。将适合宽度的橡胶条(4
×
10mm)放置于动脉下，使之与周围的组织分离开，保持颈动脉干净，小鼠尾静脉给药wpk5-mut(10μmol/kg,，20μmol/kg，40μmol/kg)、pn2kpi(20μmol/kg，40μmol/kg，80μmol/kg)或生理盐水10min后，放置于激光散斑仪(moor flpi-2 moor instruments)下观察颈动脉血流情况，将浸有6％fecl3溶液的滤纸条(1*2mm)放置于颈动脉上3min后移除，并用生理盐水冲洗颈动脉3次，继续观察并记录颈动脉血流30min。观察用mflpi2measv2-0软件，分析数据用moorflpireviewv50软件。
[0057]
结论：该多肽wpk5-mut剂量依赖性的延长三氯化铁诱导的小鼠颈动脉血栓形成时间，有效剂量为40μmol/kg，pn2kpi剂量依赖性的延长三氯化铁诱导的小鼠颈动脉血栓形成时间，有效剂量80μmol/kg。该多肽体内活性强于pn2kpi。
[0058][0059]
实施例8：本发明提供的多肽wpk5-mut对小鼠断尾出血的影响
[0060]
小鼠(c57bl/6j，雄性，18-22g)腹腔注射5％水合氯醛麻醉，尾静脉注射给药wpk5-mut(40μmol/kg和80μmol/kg)或生理盐水10min后，,将小鼠放置于固定器中，将其尾部垂直，用尺测量，并在距尾尖3mm处作标记，然后用手术剪在鼠尾标记处剪断，并将其尾尖浸入37℃生理盐水中。剪断尾尖开始计时20min，另取一个秒表记录剪断尾尖后累积的血流时间(血流停止时同时暂停计时，再出现流血时继续计时)，如果出血时间t大于20min则记为20min，t即为出血时间。
[0061]
结论：该多肽wpk5-mut经小鼠断尾出血实验，与生理盐水组比，在40μmol/kg和80μmol/kg剂量下没有明显出血风险。
[0062]