一种小肽在制备治疗骨关节炎药物中的应用的制作方法

1.本发明属于制药领域，具体涉及一种小肽在治疗骨关节炎中的应用。


背景技术：

2.骨关节炎是一种慢性退行性疾病，包括关节软骨丧失、软骨下骨硬化、骨赘和低度滑膜炎、半月板及髌骨下脂肪垫损伤。严重者可发生关节畸形，行动障碍。现代医学多采用消炎镇痛药进行治疗，如非甾体抗炎药和弱阿片类药物。然而，由于这些药物只能缓解不同症状的疼痛，但不能有效阻止关节软骨退变，长期用药治疗不利于远期身体健康，非甾体抗炎药存在潜在的心血管和消化道出血风险，加之患者抗拒药物治疗，从而导致疗效不佳，严重影响人们日常正常活动需求。为此，亟需探索预防、延缓甚至逆转骨关节炎的发病，寻找安全有效的保护剂或者天然制剂。
3.龟板是我国一种传统中药，具有滋阴潜阳、强肝肾、抗癌、防癌，对阴虚潮热、骨蒸劳热、心烦意乱、高血压、脑中风等症具有较好的预防和治疗作用。有研究表明一些龟提取物具有良好抗高血压和抗菌作用。从石金钱龟中提取的蛋白质和肽已在动物实验中被证明具有抗氧化和免疫系统增强作用。然而，龟板肽对于抗炎及其作用机制研究较少，对于骨关节炎是否存在影响尚不清楚。但有研究发现，龟甲胶能延缓关节软骨细胞的退变，延缓骨关节炎的病理进程。还有研究发现，龟板肽分子是治疗骨病的有效成分，能够治疗骨质疏松。但龟板肽是否对关节炎有效仍未被证实。
4.本发明通过提取龟板肽，然后对龟板肽中的肽段组成和功能进行大量分析和验证，最终得到一种对骨关节炎具有较好治疗作用的小肽。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种小肽在制备治疗骨关节炎药物中的用途。
6.上述目的是通过以下技术方案实现的：
7.申请人首先从中药龟板中提取分离生物活性肽，接着通过液质联用、质谱解析、序列比对、分子对接和体外酶活抑制实验等大量试验从中筛选出具有较强cox-2酶抑制活性的小肽，其氨基酸序列为n-q-g-x-b(seq id no.1)或k-n-g-p(seq id no.2)或w-g-x-b(seq id no.3)。该小肽为首次从中药龟板中分离鉴定，为充分利用龟板药材提供了新途径，同时也为相关药物的开发提供了新资源。
8.上述小肽既可以从龟板中提取分离，也能使用本领域所熟知的人工方法合成。当使用提取分离方法进行制备时，需要从提取得到的多肽中分离目标肽段，所述目标肽段的分离可使用本领域所熟知的色谱法等，例如使用半制备或制备液相色谱进行分离，在已明确目标肽段分子结构的基础上，本领域技术人员在使用这些分离方法时无需克服技术障碍。
9.当使用人工合成方法进行制备时，该小肽由于分子量小，因此还具有合成工艺简单、周期短、成本低廉等优势。
10.体内动物实验结果表明：本发明提供的小肽对大鼠体重没有显著影响，说明小肽不会对大鼠正常生长造成损害。但是该小肽能明显改善膝关节软骨缺损及表面状态，说明对骨关节损伤具有治疗作用；通过对血清中ctx
‑ⅱ
、comp和关节液tnf-α含量分析，发现该小肽能缓解骨关节炎症状，延缓关节软骨的降解和退变，且作用温和，副作用小。
11.综上，本发明提供的小肽既能在体外发挥对cox-2酶的抑制活性，又能在体内发挥对骨关节炎的治疗作用，从而能应用于制备cox-2抑制剂或治疗骨关节炎药物，具有广泛的应用前景。
附图说明
12.图1：小肽对大鼠体重变化趋势的影响。
13.图2：小肽对大鼠血清中ctx
‑ⅱ
含量的影响。
14.图3：小肽对大鼠血清中comp含量的影响。
15.图4：小肽对大鼠关节液tnf-α含量的影响。
具体实施方式
16.下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
17.实施例1多肽的制备
18.通过煎煮、萃取、浓缩、过滤等手段将龟板中的总蛋白提取出来，并减少提取物中脂溶性和其它小分子水溶性成分如矿物质等含量，接着将总蛋白进行酶解得到多肽，具体方法如下：
19.1.总蛋白的提取
20.(1)在热水中处死石金钱龟，剔除内脏、血液及鳞片后，将龟板洗净并打碎；
21.(2)在4％醋酸中浸泡碎龟板1小时后洗净放入锅中熬煮3次，每次煮制3小时；
22.(3)将3次熬煮得到的汤汁合并、过滤，在55℃下旋转蒸发浓缩至基本无冷凝液流出；
23.(4)将浓缩物用石油醚萃取三次除去脂溶性杂质，接着用透析袋过滤除去部分水溶性小分子；
24.(5)放入真空冷冻干燥箱中冷冻干燥，粉碎后按6％添加量加入到0.6mol/l的edta溶液中，搅拌反应30min以脱去蛋白中结合的钙，过滤，滤液再次冷冻干燥，得蛋白粗提取物。
25.2.多肽的制备
26.(1)称取蛋白粗提取物，以1:25(g/ml)的固液比添加ph 7.5的naoh溶液；
27.(2)加入碱性蛋白酶，使溶液中的酶浓度为1.2％，55℃恒温条件下水浴酶解6h；
28.(3)再放入95℃热水浴中，持续搅拌15分钟使酶灭活；
29.(4)4℃，10000r/min离心10分钟，收集离心液；
30.(5)将离心液通过截留分子量小于6000d的超滤膜过滤，除去灭活酶和未水解的大分子蛋白，然后旋转蒸发浓缩后放入真空冷冻干燥箱冻干，粉碎后得到多肽粉末。
31.实施例2肽段的鉴定和功能验证
32.(1)龟板肽的主要肽段鉴定
33.采用高效液相色谱-电喷雾质谱-质谱联用仪(hplc
–
esi-qqtof
–
ms/ms)对实施例1制备的龟板肽进行分析，肽溶液在inter sustain aq-c18(250mm
×
4.6mm，5μm)色谱柱上以0.8ml/min的流速分离；流动相：乙腈 0.1％三氟乙酸(b相)，水 0.1％三氟乙酸(a相)，浓度10mg/ml，进样量8μl，柱温30℃，检测波长215nm。梯度洗脱条件：0～9min，0％～9％b；9～12min，9％～13％b；12～20min，13％～26％b；20～60min，26％～70％b。
34.质谱条件为：esi 离子源；雾化器压力为40.00psi；毛细管电压，3500v；干气流量，10.0l/min；干气温度325℃；m/z 100～1500扫描光谱。质谱扫描范围设定在m/z100-1500。采用peakview 2.2分析软件进行esi-ms和ms/ms分析，测定了石金钱龟龟板肽的结构，总共鉴定出5个峰和9个肽段。具体肽段信息如下表所示。
35.石金钱龟龟板肽的质谱分析
[0036][0037]
(2)分子对接筛选功能肽段
[0038]
环氧化酶-2(cox-2)在正常关节液内的活性极低，几乎成无表达或弱表达状态，金荣忠等研究表明cox-2在koa软骨组织中表达增加。cox-2被诱导生成后能大量生成前列腺e，共同参与炎症反应，不但抑制细胞外基质中的ⅱ型胶原的合成，而且能抑制软骨细胞的增殖，促进软骨细胞的凋亡，加速软骨基质的破坏，最终导致关节软骨的退行性改变。
[0039]
参考文献：张应生.化湿补肾法对木瓜蛋白酶诱导的大鼠膝骨关节炎模型软骨修复机制的研究[d].福建中医药大学,2019.
[0040]
何俊君.阳和汤影响木瓜蛋白酶诱导的兔膝骨关节炎模型滑膜炎症的实验研究[d].福建中医药大学,2019.)
[0041]
①
靶蛋白分子准备。
[0042]
首先从蛋白质数据库(http://www.rcsb.org/pdb)中检索cox-2晶体结构，选择受体。cox-2酶上自带配体的活性位点作为对接位点。再将蛋白质所带水分子进行去除，然后运用discovery studio 2018中macromolecules模块下的clean protein工具，对cox-2酶中出现的侧链缺失、非标准的氨基酸残基命名、不一致的蛋白质构象、未修复的氨基酸残基及其质子化状态、主链末端缺陷等问题进行修复，保存靶蛋白为mol2格式。
[0043]
②
配体小分子准备。
[0044]
对接配体分子结构名称：j-h、k-n-g-p、n-q-g-x-b、r-g、w-g-p-g-b、w-g-x-b、w-w-y-w-r、w-r-w-x-h-t-h-n-w、w-n-a-r-w-p-g-j，利用chemdraw画结构。
[0045]
③
准备完两个基本对接分子后，准备靶蛋白分子的分子表面文件，同时需要靶蛋白分子的pdb文件，然后利用dms生成靶蛋白分子表面文件。
[0046]
④
采用discovery studio 2018中受体为刚性而配体为柔性的半柔性cdocker对接方法。首先，利用receptor-ligand interactions模块下的define and editing binding site工具将前期处理好的蛋白质结构定义为受体分子。利用define site工具将蛋白质晶体结构中自带配体的结合位置定义为活性球并进行一定程度的调整。对活性球大小和位置进行调整，避免活性球过小无法包裹配体分子使得其在活性位点的优化失败，也避免活性球过大使得对接位置偏差导致对接结果不准确。最终确定活性球直径为cox-2酶的活性球坐标为(22.00，35.76，13)。
[0047]
⑤
利用receptor-ligand interactions模块下的docking optimization工具打开cdocker对接模块运行对接过程。
[0048]
⑥
分子对接结果：
[0049]
[0050][0051]
一般来说，能量越低表明蛋白质与小分子配体间的总能量和相互作用力所需能量越低，对接体系越稳定并且结合状态越紧密，一般以总能量为标准。以上结果说明n-q-g-x-b、k-n-g-p、w-g-x-b这三种肽段与cox-2酶作用效果较好。
[0052]
(2)体外酶活抑制实验
[0053]
①
试验方法
[0054]
cox-2酶用0.1mol/l的ph为8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris-hcl)缓冲溶液分别配制成500u/ml的溶液。将10μl的k-n-g-p、n-q-g-x-b、w-g-x-b肽段样品与110μl不同浓度的cox-2酶溶液混合，然后在25℃下温育5min。向混合物中添加20μl四甲基对苯二胺(tmpd)和20ml花生四烯酸(aa)溶液来启动反应。在25℃下反应20分钟后，使用酶标仪在610nm处记录吸光度值。所有实验重复三次。用以下公式计算抑制率：
[0055][0056]
式中，a
control
是不含样品tris-hcl的吸光度；a
sample
是样品的吸光度；a
controlblank
是不含样品和酶的tris-hcl的吸光度；a
samplebank
是不含酶的样品的吸光度。最后，通过spss软件计算抑制剂的半数最大抑制浓度(ic
50
)值。
[0057]
②
试验结果
[0058]
ic
50
值越小，表明抑制作用越强。对cox-2酶，在3种肽段中n-q-g-x-b表现出了最强的抑制作用(ic
50
＝0.045mg/ml)，其次是k-n-g-p(ic
50
＝0.26mg/ml)、w-g-x-b(ic
50
＝0.39mg/ml)，符合分子对接的研究结果。
[0059]
实施例3体内实验分析石金钱龟龟板肽对大鼠膝骨关节炎的作用
[0060]
1试验方法
[0061]
(1)试验设计
[0062]
实验动物来源于湖北省实验动物研究中心的spf级sd雄性大鼠，体重为200
±
10g。实验期间，大鼠饲养环境控制温度25
±
10℃，湿度40
±
10％，明暗周期12h，标准无病原体环境，自由饮水与摄食。适应性喂养1周后，将50只大鼠随机分为5组，每组10只：正常(normal)组(第14、17、20天关节腔内注射0.15ml生理盐水，灌胃生理盐水)；膝关节炎(koa)组(在关节内注射4％、0.09ml的木瓜蛋白酶和0.3mol/l、0.06ml的半胱氨酸混合溶液0.15ml，第14、17天和第20天，灌胃生理盐水45)；n-q-g-x-b组(第14、17天和第20天，在关节内注射4％、0.09ml的木瓜蛋白酶和0.3mol/l、0.06ml的半胱氨酸混合溶液0.15ml，灌胃n-q-g-x-b 45mg/kg/d)；w-g-x-b组(第14、17天和第20天，在关节内注射4％、0.09ml的木瓜蛋白酶和0.3mol/l、0.06ml的半胱氨酸混合溶液0.15ml，灌胃w-g-x-b 45mg/kg/d)；k-n-g-p组，第14、17天和第20天，在关节内注射4％、0.09ml的木瓜蛋白酶和0.3mol/l、0.06ml的半胱氨酸混合溶液0.15ml，灌胃k-n-g-p 45mg/kg/d)。
[0063]
灌胃开始前1h对全部大鼠进行禁食处理，大鼠灌胃体积依据当日小鼠实验前空腹1h的体重计算得到，时间为每天上午10时，记录体重。第14、17、20天造模，造模前各组均用
10％水合氯醛腹腔麻醉。实验结束前一天，对大鼠进行12h以上禁食不禁水处理。在实验第38天，用10％的水合氯醛麻醉，眼球取血，断颈处死。
[0064]
(2)体重指标
[0065]
每天灌胃前称重并记录体重。
[0066]
(3)血液及组织提取
[0067]
①
取血清：自大鼠血液样本在室温条件下自然凝血1h后，被置于4℃条件经3000r/min离心10min，取上清液，即为实验用血清样本。将其分装后置于-80℃条件下保存待测。测定前于4℃条件下自然解冻后使用，避免反复冻融。
[0068]
②
取关节液：将膝关节逐层分离至肌肉，以髌骨上缘为定位，行髌骨上缘横向切口，行肉眼观察关节内情况，包括关节液颜色及量，用有齿镊夹住髌骨轻轻向上提拉，分别沿膝关节内侧、外侧作纵行切口至股骨髁上方，屈曲大鼠膝关节，注射器抽取生理盐水清洗关节，所得关节液存入ep管中。
[0069]
(4)软骨组织肉眼观察
[0070]
观察颜色、组织状态、软骨形态变化
[0071]
(5)elisa检测血清血清中二型胶原羧基端端肽(ctx
‑ⅱ
)与软骨寡聚基质蛋白(comp)的含量和关节液中炎症细胞因子(tnf-α)的含量。
[0072]
①
标准品的稀释，准备1.5ml的离心管5个，做好标记。每个离心管中加入150μl标准品稀释液，在第一个试管中加入150μl原倍标准品，混匀后，用加样器吸出150μl移至第二个试管，如此反复，得到不同稀释倍数的标准溶液；
[0073]
②
加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样
③
将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
[0074]
温育：用封板膜封板后置37℃温育30min。
[0075]
④
配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。
[0076]
⑤
洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
[0077]
⑥
加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
[0078]
⑦
温育：用封板膜封板后置37℃温育30min。
[0079]
⑧
洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
[0080]
⑨
显色：每孔先加入显色剂a 50μl，再加入显色剂b 50μl，轻轻振荡混匀，37℃避光显色10-20min。
[0081]
⑩
终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)，以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(od值)。
[0082]
2.试验结果
[0083]
(1)体重
[0084]
试验结果表明，各组大鼠体重都有明显增重现象，呈正常增长趋势。结果分析大鼠属于正常发育增长，且石金钱龟龟板肽组体重高于其他组，说明龟板肽有助于大鼠生长发
育。结果见图1。
[0085]
(2)软骨组织肉眼观察结果
[0086]
①
正常(normal)组：股骨内侧髁关节软骨色泽鲜红，表面光滑，无软骨破坏和骨赘形成。
[0087]
②
膝关节炎(koa)组：股骨内侧髁软骨无光泽，局部凹凸不平，可见软骨缺损及骨赘形成。
[0088]
③
w-g-x-b组：股骨内侧髁软骨表面欠光泽，局部有不平，可见软骨缺损及骨赘形成。
[0089]
④
k-n-g-p组：股骨内侧髁软骨表面欠光滑，可见轻微软骨缺损和骨赘形成，其程度明显较模型组轻。
[0090]
⑤
n-q-g-x-b组：股骨内侧髁软骨表面欠光滑，无肉眼可见软骨缺损和骨赘形成。
[0091]
以上结果说明石金钱龟龟板肽有助于恢复大鼠软骨组织损伤，且肽段n-q-g-x-b效果最好。
[0092]
(3)血清中ctx
‑ⅱ
与comp含量
[0093]
ctx
‑ⅱ
、comp水平可作为骨关节炎早期诊断和预测的有用指标。n-q-g-x-b、k-n-g-p、w-g-x-b组ctx
‑ⅱ
、comp含量显著低于模型组，说明这些肽段有助于降低ctx
‑ⅱ
、comp含量，从而缓解关节炎症状。实验结果见图2、3。
[0094]
(4)关节液tnf-α的含量
[0095]
tnf-α直接参与了膝骨关节炎的发病，可选择性地抑制软骨胶原产生，减少蛋白聚糖合成，破坏关节软骨。模型组的tnf-α水平高于空白对照组和其他组，证实了上述细胞因子在大鼠中存在异常分泌。石金钱龟龟板肽可能通过抑制炎性因子tnf-α的释放达到缓解膝骨关节炎症状的作用，延缓关节软骨的降解和退变。实验结果见图4。