具有中和活性的抗尼帕病毒单克隆抗体及应用的制作方法

1.本发明公开了一种单克隆抗体，属于免疫学和微生物学领域。


背景技术：

2.尼帕病毒(nipah virus,niv)属于副黏病毒科(paramyxoviridae)亨尼帕病毒属(henipavirus)，为单股负链rna病毒。niv为人畜共患病病毒，人能通过接触感染，会引起致命的呼吸和神经系统性疾病。niv的自然宿主是果蝠，可以通过果蝠-猪-人传播，还可以直接通过蝙蝠传人及人与人之间传播。
3.niv最开始出现于马来西亚，在1998年9月至1999年4月期间，马来西亚霹雳州出现多名猪场饲养人员因重度脑炎死亡和大量猪患病死亡案例，最开始认为是乙型脑炎病毒感染，后来发现这次疫情在易感人群、感染率以及感染方式上与乙型脑炎有着明显的不同，并且许多患者曾接种过日本脑炎疫苗，研究人员认定这是一种新型传染性疾病。这次疫情中感染的人员和家畜均表现出急性呼吸系统综合征，最终造成256人感染，105人死亡，116万头猪死亡，并蔓延至新加坡一屠宰场，导致11名工人感染、1人死亡。1999年10月，研究人员从一名患者脑脊髓液中分离出病毒。不久之后，从马来西亚果蝠尿液中分离出niv，确定了niv的自然宿主。随后，在印度、柬埔寨、泰国等国家都曾报道过尼帕病毒病。近年来，尼帕病毒病多次在孟加拉国和印度发生，已造成数百人死亡，死亡率在50％～100％之间。niv的研究主要集中于马来西亚型(niv malaysia，niv-my)和孟加拉型(niv bangladesh，niv-bd)。
4.niv在入侵宿主细胞的过程中，通过病毒表面糖蛋白g与受体ephrin-b2/b3结合后，会引起g蛋白在受体结合区和茎状区内激活融合蛋白f发生构象改变，从而激活f蛋白与细胞膜融合，最终病毒侵入细胞。因此，在疫苗和抗病毒类药物研究中，g蛋白和f蛋白都是重要的研究靶标。目前尚无疫苗可用于人体，抗体类药物也仅有一株单克隆抗体m102.4进入临床实验。m102.4是通过重组人源fab噬菌体抗体库筛选得到的人源单克隆抗体，能有效地中和尼帕病毒和同属于副黏病毒科、亨尼帕病毒属的亨德拉病毒(hendra virus,hev)，在雪貂和非洲绿猴的攻毒保护性实验中，m102.4能够在亨尼帕病毒攻毒后有效保护动物存活。2010年，m102.4被批准作为紧急保护性药物在两位高暴露风险的人身上使用，结果这两人都没有出现感染症状。但是有关单克隆抗体在治疗尼帕病毒病中的应用还缺乏进一步的深入研究和报道。
5.鉴于本领域对于抗尼帕病毒治疗性抗体的技术需求，本发明的目的就是提供一种能够针对独特抗原表位，并具有优异中和活性的尼帕病毒糖蛋白g的单克隆抗体，进而提供其在制备尼帕病毒病治疗药物中的应用。


技术实现要素：

6.基于上述目的，本发明首先提供了一种抗尼帕病毒糖蛋白g的特异性中和抗体，所述抗体为单克隆抗体，所述抗体重链可变区cdr1、cdr2和cdr3区氨基酸序列和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3区氨基酸序列分别如下述任一序列组合所示：
7.seq id no:1第26-33、51-58、97-110位和seq id no:3第26-34、52-54、91-100位，或
8.seq id no:5第26-33、51-58、97-105位和seq id no:7第27-37、55-57、94-107位，或
9.seq id no:9第26-33、51-58、97-110位和seq id no:11第26-34、52-58、97-105位，或
10.seq id no:13第26-33、51-58、97-108位和seq id no:15第27-37、55-57、94-102位。
11.在一个优选的实施方案中，所述抗体重链可变区的氨基酸序列和抗体轻链可变区的氨基酸序列分别如下述任一序列组合所示：
12.seq id no:1和seq id no:3(在本发明中，具有该可变区的抗体被命名为“1a9”)，或
13.seq id no:5和seq id no:7(在本发明中，具有该可变区的抗体被命名为“1d11”)，或
14.seq id no:9和seq id no:11(在本发明中，具有该可变区的抗体被命名为“1f9”)，或
15.seq id no:13和seq id no:15(在本发明中，具有该可变区的抗体被命名为“2b6”)。
16.在一个更为优选的实施方案中，所述抗体重链恒定区的氨基酸序列如seq id no:17所示，所述抗体轻链恒定区的氨基酸序列如seq id no:19或seq id no:21所示。
17.其次，本发明还提供了一种编码上述单克隆抗体重链和/或轻链的多核苷酸，编码所述抗体的重链可变区的多核苷酸序列和编码所述抗体的轻链可变区的多核苷酸序列分别如下述任一序列组合所示：
18.seq id no:2和seq id no:4(在本发明中，具有该编码序列的抗体被命名为“1a9”)，或
19.seq id no:6和seq id no:8(在本发明中，具有该编码序列的抗体被命名为“1d11”)，或
20.seq id no:10和seq id no:12(在本发明中，具有该编码序列的抗体被命名为“1f9”)，或
21.seq id no:14和seq id no:16(在本发明中，具有该编码序列的抗体被命名为“2b6”)。
22.在一个优选的实施方案中，编码所述抗体重链恒定区的多核苷酸的序列如seq id no:18所示，编码所述抗体轻链恒定区的多核苷酸的序列如seq id no:20或seq id no:22所示。
23.第三，本发明还提供了一种表达上述编码单克隆抗体重链和/或轻链的多核苷酸的功能元件。
24.在一个优选的实施方案中
，
所述功能元件为线性表达框。
25.在另一个优选的实施方案中，所述功能元件为哺乳动物表达载体。
26.第四，本发明还提供了一种含有上述功能元件的宿主细胞。
27.在一个优选的实施方案中，所述细胞为expi 293f细胞。
28.在另一个优选的实施方案中，所述细胞为cho-s细胞，本发明可以使用cho-s细胞构建稳转工程细胞株，实现产业化生产。
29.最后，本发明提供了上述的单克隆抗体在制备尼帕病毒病治疗药物中的应用。
30.本发明提供的抗尼帕病毒糖蛋白g的单克隆抗体由猴源可变区和人源恒定区组成，所述猴源可变区轻重链均具有独特的cdr区。本发明提供的抗体显示出优异的抗原结合能力，与孟加拉型和马来西亚型尼帕病毒糖蛋白g均具有良好的结合活性。所述抗体能够有效中和尼帕假病毒；而且所述抗体的中和活性随着抗体浓度的升高而增强，在1μg/ml的浓度下即可对尼帕假病毒实现近100％的中和。本发明还公开了所述抗尼帕病毒糖蛋白g的单克隆抗体在制备尼帕病毒病治疗药物中的应用。
附图说明
31.图1.恒河猴记忆b细胞分选结果图；
32.图2.巢式pcr毛细管电泳图谱；
33.图3.elisa筛选具有结合活性抗体的od
450-630nm
值分布图；
34.图4.elisa检测抗体与抗原结合活性随浓度变化曲线图；
35.图5.抗体与niv-bd假病毒的中和结果图；
36.图6.抗体与niv-my假病毒的中和曲线图；
37.图7.抗体对niv-bd/my g蛋白与受体ephrin-b2/b3结合的竞争抑制曲线图。
具体实施方式
38.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。
39.实施例1抗体的筛选和制备
40.1.血液样品的采集
41.对雌性恒河猴进行三次免疫，即在第0、28、49天采用肌肉注射的方式，分别免疫腺病毒载体尼帕病毒候选疫苗、重组niv g蛋白和重组hev g蛋白。最终采集第77天恒河猴血液样本。
42.2.fitc标记蛋白niv-bd g
43.为分选抗原特异的记忆b细胞，fitc标记抗原蛋白niv-bd g。方法如下：
44.1)fluorescein isothiocyanate fitc(sigma,f4274)溶于dmso，浓度为20mg/ml。取100μl niv-bd g蛋白(3.3mg/ml)，加缓冲液(ph 9.6碳酸盐缓冲液)至400μl。
45.2)加8μl fitc至niv-bd g蛋白溶液中，4℃避光孵育3h。
46.3)用30kd的超滤管对溶液加pbs换液，直至滤过液为透明无色。将标记好的蛋白用锡箔纸包好，4℃存放待用。
47.3.流式分选记忆b细胞
48.将采集的血样利用ficoll密度梯度离心法分离pbmc，过程如下：
49.1)取新鲜抗凝全血，edta抗凝。用等体积pbs稀释全血。
50.2)在离心管中加入一定体积的分离液，将稀释后的血样平铺到分离液液面上方，保持两液面界面清晰。分离液、抗凝未经稀释全血、pbs(或生理盐水)体积为1:1:1。
51.3)配平，室温，水平转子800g，加速减速3档位，离心30min。离心结束后，管底是红细胞，中间层是分离液，最上层是血浆/组织匀浆层，血浆层与分离液层之间是一层薄且较致密的白膜，即单个核细胞(包括淋巴细胞和单核细胞)层。小心吸取白膜层到另一离心管中。
52.4)用pbs稀释到一定体积，颠倒混匀。室温，水平转子300g，离心10min，弃上清，重复洗涤2次。用pbs将淋巴细胞重悬备用。
53.5)细胞计数，取5
×
105个细胞，体积为50μl，加入表1所列推荐量的5种荧光染料，4℃避光孵育1h。
54.表1.流式分选细胞所用染料列表
55.标记荧光公司/货号体积抗原fitcsigma,f42744μgiggpebd,55578715μlcd19apc-af 700beckman，im24705μlcd3percpbd，55285110μlcd27pc7beckman，a5482310μl
56.6)使用含2％fbs的pbs洗涤2-3次，400μl fpbs重悬，用40μm细胞筛去除细胞团，4℃避光保存供分选。
57.7)使用细胞分选仪(beckman，moflo xdp)分选niv-bd g特异的单个记忆b细胞。分选策略为：igg

/cd3-/cd19

/cd27

/niv-bd g

，直接将单个细胞分选至96孔板中，每孔含有20u rna酶抑制剂及20μl去rna酶的水中，-80℃保存。图1为细胞分选结果图。图中r7方框圈出部分的细胞特征为igg

/cd3-/cd19

/cd27

/niv-bd g

，即niv-bd g特异性记忆b细胞。
58.4.单细胞pcr扩增抗体可变区
59.1)反转录pcr
60.分选得到1124个niv-bd g特异的记忆b细胞，使用superscriptⅲ反转录试剂盒，按说明书将混合好的体系直接加入含有单个细胞的96孔板进行pcr反应，反应体系及条件如下：
61.反应条件：42℃，10min；25℃，10min；50℃，60min；94℃，5min。反转录-pcr反应体系如表2所述。
62.表2.反转录-pcr反应体系
[0063][0064]
2)巢式pcr
[0065]
以反转录产物为模板，分别进行2次巢式pcr反应扩增h、κ、λ，具体过程如下：
[0066]
第一轮巢式pcr反应体系如表3所述：
[0067]
表3.第一轮巢式pcr反应体系
[0068][0069]
第一轮巢式pcr反应条件：首先，95℃预变性5min；接着进行40个扩增循环:95℃30s，57℃30s，72℃45s；最后72℃延伸10min。
[0070]
第一轮巢式pcr引物如表4所述：
[0071]
表4第一轮巢式pcr引物
[0072]
[0073][0074]
第二轮巢式pcr反应体系如表5所述，
[0075]
表5.巢式pcr反应体系
[0076][0077]
第二轮巢式pcr反应引物如表6所示：
[0078]
表6第二轮巢式pcr引物
[0079]
[0080][0081]
第二轮巢式pcr反应条件同第一轮巢式pcr。
[0082]
3)毛细管电泳
[0083]
巢式pcr结束后，扩增产物用qiaxcel dna fast analysis cartridge进行毛细管电泳，挑选轻重链配对的阳性克隆进行测序，测序获得的抗体可变区序列用vector nti软件及imgt网站进行分析。图2为巢式pcr毛细管电泳结果。
[0084]
5.线性表达框表达抗体
[0085]
通过上述反转录反应，单细胞克隆中获得了254对配对的抗体序列，如果采用传统的克隆表达方法费时费力，通过构建线性表达框的方法可以快速表达抗体。
[0086]
首先，通过pcr反应获得启动子-前导序列片段、恒定区(生工生物合成，重链恒定区序列由seq id no:17所示，dna编码序列由seq id no:18所示，kappa型轻链恒定区序列由seq id no:19所示，dna编码序列由seq id no:20所示，lamda型轻链恒定区序列由seq id no:21所示，dna编码序列由seq id no:22所示)-多聚a尾片段(genbank登记号：x03896.1)，再扩增抗体可变区片段。扩增可变区pcr反应体系如表7所示。
[0087]
表7扩增可变区片段反应体系
[0088][0089][0090]
pcr反应条件：首先，95℃预变性5min；然后进行30个扩增循环：95℃，30s；60℃，30s；72℃，30s；最后，72℃延伸10min。
[0091]
以扩增好的启动子-前导序列片段、恒定区-多聚a尾片段和可变区片段为模板，以cmv-up和tk-poly a为引物，进行重叠延伸pcr分别扩增h、κ和λ链的线性表达框，pcr产物经
核酸电泳鉴定。扩增全长线性表达框反应体系如表8所示。
[0092]
表8扩增全长线性表达框反应体系
[0093][0094]
反应条件：首先，95℃预变性5min；然后进行30个扩增循环：95℃，30s；60℃，30s；72℃，3min；最后，72℃延伸10min。
[0095]
pcr反应产物直接用omega公司试剂盒回收，用nano(ge healthcare)对pcr回收产物进行定量。转染前一天晚上按2
×
104cells每孔150μl铺好96孔板。转染当天，取轻重链各0.2μg，加入0.8μl turbofect转染试剂，使用dmem培养基稀释至40μl，混匀室温孵育15min。按顺序缓慢逐滴加入96孔板中，放入37℃培养48h。
[0096]
6.elisa筛选具有结合活性的抗体
[0097]
1)实验前一天96孔酶联板包被1μg/ml的niv-bd g蛋白，每孔100μl包被。将包被的酶联板放入湿盒，4℃过夜。
[0098]
2)实验当天用洗板机(bio-tek，405_ls)清洗5次。每孔加入100μl封闭液，37℃孵箱中放置1小时。
[0099]
3)洗板机洗5次，加入100μl的转染细胞培养上清，37℃孵箱中静置1小时。
[0100]
4)洗板，将hpr标记的羊抗人igg二抗(abcam，ab97225)以1:10000用稀释液进行稀释，每孔100μl加入到elisa板对应孔中，37℃孵箱中静置1小时。
[0101]
5)洗板，每孔加入100μl的tmb单组份显色液，显色6min，室温避光，之后每孔加入50μl终止液终止反应。酶标仪检测450-630nm的od值。
[0102]
结果：将254株单抗进行筛选，以od
450-630nm
值等于0.1时为cutoff值，得到59株能与niv-bd g特异性结合的抗体，对这些抗体进行进一步地表达纯化以及验证等实验。图3为elisa筛选具有结合活性的抗体的od
450-630nm
值分布图。
[0103]
7.表达质粒构建与抗体制备
[0104]
构建抗体表达质粒，进行单抗的表达制备。方法如下：
[0105]
1)将抗体重链h和轻链l线性表达框全长基因用ecor i(neb，r3101)和not i(neb，r3189)双酶切，连接至pcdna3.4表达质粒。
[0106]
2)取pcdna3.4-h和pcdna3.4-l各15μg，转染至30ml expi 293体系(life，a14524)中，125rpm，5％co2培养72h。
[0107]
3)3000
×
g，离心10min收集表达上清，采用rprotein a亲和纯化。用pbs对收集的抗体进行换液，然后用bca蛋白定量试剂盒(thermo scientific，23225)测定抗体浓度。
[0108]
实施例2.elisa检测抗体结合活性
[0109]
1)实验前一天96孔酶联板包被100μl 1μg/ml的niv-bd或niv-my g蛋白(niv-bd g的genbank登记号：ay988601.1，niv-my g的genbank登记号：fn869553.1)，4℃过夜。
[0110]
2)实验当天，洗板后每孔加入100μl封闭液，37℃下放置1小时。
[0111]
3)洗板机洗板，首孔加入150μl浓度为20μg/ml的纯化单克隆抗体，其余孔加入100μl的稀释液。从首孔吸出50μl加入到次孔，以此类推，按1:3梯度稀释每孔终体积为100μl。室温静置1小时。
[0112]
4)洗板，将hpr标记的羊抗人igg二抗以1:10000用稀释液进行稀释，每孔100μl加入到elisa板对应孔中，室温孵育1小时。
[0113]
5)洗板，每孔加入100μl的tmb单组份显色液，显色6min，室温避光，之后每孔加入50μl终止液终止反应。用酶标仪上检测450-630nm的od值。
[0114]
结果如图4所示，单抗与niv-bd和niv-my g蛋白均具有良好的结合活性，单抗1a9的ec
50
值分别为18.26ng/ml、22.81ng/ml；单抗1d11的ec
50
值分别为9.91ng/ml、20.2ng/ml；单抗1f9的ec
50
值分别为15.04ng/ml、23.56ng/ml；单抗2b6的ec
50
值分别为5.40ng/ml、9.56ng/ml。
[0115]
对上述4株抗体进行测序，单抗1a9重链和轻链可变区的核苷酸编码序列分别由seq id no:2和seq id no:4所示，重链和轻链可变区的氨基酸序列分别由seq id no:1和seq id no:3所示；对重链和轻链可变区氨基酸序列进一步分析，重链可变区cdr1、cdr2和cdr3区氨基酸序列分别如seq id no:1第26-33、51-58、97-110位所示，轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3区氨基酸序列分别如seq id no:3第26-34、52-54、91-100位所示。
[0116]
单抗1d11重链和轻链可变区的核苷酸编码序列分别由seq id no:6和seq id no:8所示，重链和轻链可变区的氨基酸序列分别由seq id no:5和seq id no:7所示；对重链和轻链可变区氨基酸序列进一步分析，重链可变区cdr1、cdr2和cdr3区氨基酸序列分别如seq id no:5第26-33、51-58、97-105位所示，轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3区氨基酸序列分别如seq id no:7第27-37、55-57、94-107位所示。
[0117]
单抗1f9重链和轻链可变区的核苷酸编码序列分别由seq id no:10和seq id no:12所示，重链和轻链可变区的氨基酸序列分别由seq id no:9和seq id no:11所示，对重链和轻链可变区氨基酸序列进一步分析，重链可变区cdr1、cdr2和cdr3区氨基酸序列分别如seq id no:9第26-33、51-58、97-110位所示，轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3区氨基酸序列分别如seq id no:11第26-34、52-58、97-105位所示。
[0118]
单抗2b6重链和轻链可变区的核苷酸编码序列分别由seq id no:14和seq id no:16所示，重链和轻链可变区的氨基酸序列分别由seq id no:13和seq id no:15所示；对重链和轻链可变区氨基酸序列进一步分析，重链可变区cdr1、cdr2和cdr3区氨基酸序列分别如seq id no:13第26-33、51-58、97-108位所示，轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3区氨基酸序列分别如seq id no:15第27-37、55-57、94-102位所示。
[0119]
上述4株单克隆抗体具有相同的人源的重链恒定区和轻链恒定区，编码上述抗体重链恒定区的多核苷酸的序列如seq id no:18所示，编码所述抗体轻链恒定区的多核苷酸的序列如seq id no:20或seq id no:22所示，重链恒定区的氨基酸序列如seq id no:17所示，所述抗体轻链恒定区的氨基酸序列如seq id no:19或seq id no:21所示。
[0120]
实施例3.假病毒中和实验评价抗体中和活性
[0121]
包装hiv骨架的niv-bd和niv-my假病毒(dimple khetawat,c.c.b.,a functional henipavirus envelope glycoprotein pseudotyped lentivirus assay system.virology j.2010.7(312).)，体外评价抗体的中和活性。方法如下：
[0122]
1)用dmem培养基稀释单克隆抗体，96孔细胞培养板首孔加入75μl浓度为5μg/ml的抗体稀释液，其余孔加入50μl的dmem培养基。
[0123]
2)从首孔吸取25μl液体加入次孔，混匀，以此类推，按1:3倍比稀释，每孔终体积为50μl。将假病毒按以每孔50μl的体积加入各孔，混匀，37℃孵育1h。
[0124]
3)293t细胞计数，2
×
105cells/ml，每孔加入100μl。将培养板放入37℃恒温箱中培养36～48小时。
[0125]
4)取出细胞培养板，小心吸出培养液弃掉。各孔加入100μl细胞裂解液，震荡机上400rpm震荡15min。3000rpm室温离心10min。同时将荧光素酶检测系统(promega，e1501)的检测底物冻干剂和检测缓冲液混匀后，充盈glomax 96 microplate luminometer(promega)检测管路。吸取20μl裂解上清读取荧光值，计算抗体对细胞的保护率。
[0126]
结果如图5、6所示，抗体在体外可有效地中和以hiv为骨架的niv-bd和niv-my假病毒。抗体中和活性随着抗体浓度的升高而增强，在1μg/ml的浓度下单抗1d11、1f9和2b6即可对孟加拉型和马来西亚型尼帕假病毒实现近100％的中和；而1a9仅能中和niv-bd假病毒，对niv-my假病毒的中和效果不佳。对于niv-bd假病毒，单抗1d11和2b6具有较1a9和1f9更高的中和活性，在0.04μg/ml的浓度下中和率尚能达到95％以上；对于niv-my假病毒，单抗1d11、1f9和2b6的ic
50
值分别为57.87ng/ml、81.41ng/ml和28.26ng/ml。
[0127]
实施例4.竞争实验
[0128]
采用luminex微球竞争抑制实验验证单抗抑制尼帕病毒g蛋白与受体结合的能力，其方法如下：
[0129]
1)首孔加入10μl 10μg单克隆抗体，依次向下二倍稀释。
[0130]
2)每孔加入1.25ng受体ephrin-b2或ephrin-b3，体积10μl。每孔加入10μl制备好的微球(niv-bd/my g偶联微球各1500个)，摇床孵育60min。
[0131]
3)每孔加入10μl sape(浓度为12μg/ml)，摇床孵育30min。
[0132]
4)100μl assay buffer洗3次后通过luminex magpix仪器读数。
[0133]
抗体对尼帕病毒g蛋白与受体ephrin-b2/b3结合的竞争抑制曲线图如图7，结果表明抗体1d11和2b6能够有效抑制尼帕病毒g蛋白与受体ephrin-b2/b3的结合。抗体1d11和2b6抑制尼帕病毒g蛋白与受体结合的ic
50
值在0.04μg/ml至0.16μg/ml之间，提示抗体1d11和2b6很有可能通过抑制尼帕病毒g蛋白与受体ephrin-b2/b3的结合发挥其中和作用；而1a9和1f9可能通过其它的机制发挥中和作用。