寻找已知启动子序列结合未知蛋白的特异性引物及方法与流程

1.本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种寻找已知启动子序列结合未知蛋白的特异性引物及方法。


背景技术：

2.dna相互作用蛋白在包括基因调控在内的许多生物过程中发挥着重要作用。这些蛋白质与dna序列结合或与其他dna结合蛋白相互作用以调节基因表达。dna相互作用蛋白的鉴定有助于理解其在基因调控中的作用，并有助于发现调控机制。
3.转录因子与启动子区域上的特异性调控元件的结合在基因表达和调控中至关重要。激活转录这一活动需要与dna结合的反式激活子募集转录共激活因子或抑制子，以及众多与基础转录因子相互作用的相关蛋白，因而分析这些与dna结合的大型蛋白质复合物是阐明调节基因表达机制的重要步骤。
4.目前已知的dna-蛋白互作技术主要包括：dna pulldown、chip、emsa、双荧光素酶、酵母单杂等。
5.dna pull down得以成功实施的基础是dna短片段上含有对dna结合蛋白高亲和力的位点，这种dna短片段可以是天然存在的也可以是由寡核苷酸形成的。已知生物素/链霉亲和素纯化系统中生物素与链霉亲和素可以形成紧密且基本不可逆的复合物，将生物素化的核苷酸分子掺入dna片段的末端(即探针)，再使用该dna片段与beads共孵育，利用生物素与亲和素的高亲和力，以获取含有生物素标记的dna片段。再向dna-磁珠复合物中加入活性蛋白，遂形成包含蛋白质、dna、磁珠、以及dna-蛋白质-磁珠的混合物。借助磁力架对磁珠的吸引力，对混合物进行反复洗涤，最后用高盐缓冲液将目标蛋白质从剩余的dna-蛋白质-磁珠中洗脱。
6.相较于emsa，dna pull down的优点是可以同时分析复合物中的大量蛋白质。
7.wu-guo deng等人将环氧合酶-2启动子作为探针，与核提取物孵育，最后通过免疫印迹评估复合物中的蛋白质，检测到一系列转录因子。
8.为了探究蛋白混合物中的结合蛋白，质谱技术可以对蛋白质复合物进行更加深入的定量分析。
9.diem hong tran等人将dna pull down与二维凝胶电泳和质谱分析相结合，鉴定了六种与人d-氨基酸氧化酶基因5’侧翼区域结合的蛋白质。
10.但是，利用dna pulldown方法来研究启动子与转录因子相互作用以阐明基因表达调控机制的相关研究甚少。


技术实现要素：

11.本发明是为了解决现有的启动子转录因子互作技术上所存在的种种问题，提供一种可节省人力物力、降低成本的dna pulldown方法。
12.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
13.一种寻找已知启动子序列结合未知蛋白的特异性引物，所述的特异性引物序列如下：agagcattgcgaccagcggcttgac。
14.本发明还提供利用上述通用引物寻找已知启动子序列结合未知蛋白(转录因子)的方法，所述方法具体包含以下步骤：
15.步骤一、制备含有生物素标记的启动子片段：设计带有生物素标记的特异性通用引物，使用巢式pcr结合降落pcr的方法获得带有生物素标记的探针；
16.步骤二、磁珠预处理：使用wash/binding buffer洗涤磁珠三次；
17.步骤三、制备探针—磁珠复合物：将步骤一中带有生物素标记的启动子片段和步骤二中预处理的磁珠结合；
18.步骤四、提取组织的活性总蛋白；
19.步骤五、dna pulldown：将步骤四制备的组织活性总蛋白加入到步骤三制备的探针—磁珠复合物中，加入蛋白酶抑制剂及dtt 4℃共孵育5h；
20.步骤六、sds-page垂直电泳检测：将步骤五中的孵育产物置于磁力架上静置2min以上，收集磁珠，向磁珠中加入冰冷pbs洗涤，收集蛋白—探针—磁珠复合物，向蛋白—探针—磁珠复合物中加入pbs和蛋白上样缓冲液，95℃加热5min，置于磁力架上静置2min以上，取上清进行sds-page垂直电泳检测。优选地，所述步骤一制备含有生物素标记的启动子片段的方法为：选取靶基因转录起始位点上游2000bp及下游500bp，在此区域内设计外引物，用pcr技术扩增以提高模板质量；再以一次pcr产物为模板，设计内引物，利用生物素标记的特异性通用引物，用降落pcr技术进行二次扩增，得到特异的含有生物素标记的启动子片段。
21.优选地，所述步骤二磁珠预处理的方法为：用wash/binding buffer洗涤链霉亲和素标记的磁珠，置于磁力架上静置2min以上，去除wash/binding buffer洗涤液，重复三次；所述wash/binding buffer配方为：0.5m nacl、20mm ph＝7.5的tris-hcl、1mm edta。
22.优选地，所述步骤三制备探针—磁珠复合物的方法为：取步骤一中制备的生物素标记的启动子片段，加入到步骤二预处理的磁珠中，并涡旋以悬磁珠，4℃过夜，将过夜后装有探针—磁珠复合物的离心管置于磁力架上，静置2min以上，去上清，收集探针—磁珠复合物，向探针—磁珠复合物中加入wash/binding buffer洗涤三次，每次洗涤结束后，均置于磁力架上静置2min以上，收集离心管壁上被吸附的探针—磁珠复合物，向最后一次洗涤结束后收集的探针—磁珠复合物中加入elution buffer，得探针—磁珠复合物；所述elution buffer配方为：10mm ph＝7.5的tris-hcl、1mm edta。
23.优选地，所述步骤六向磁珠中加入冰冷pbs洗涤三次。
24.本发明首先针对靶基因转录起始位点上游2000bp和下游500bp这个区域内设计巢式pcr的外引物，经一次pcr扩增以提高模板质量，扩增得到的产物作为二次pcr的模板，在此基础上设计内引物，利用生物素标记的特异性通用引物，经降落pcr进行二次扩增得到生物素标记的启动子片段；偶联在磁珠上的链霉亲和素与生物素具有高的亲和力；组织活性总蛋白与磁珠-探针复合物共孵育，作用蛋白(转录因子)可以和探针磁珠特异性结合，洗脱得到磁珠-探针-蛋白复合物；最后向磁珠-探针-蛋白复合物中加入pbs和5
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蛋白上样缓冲液，置于水浴锅内95℃加热5min，取上清进行sds-page垂直电泳检测。
25.本发明与现有技术相比具有如下有益效果：
26.(1)本发明通过设计生物素标记的特异性通用引物，降低了dna pulldown实验成本。
27.(2)本发明通过利用巢式pcr结合降落pcr的方法制备含有生物素标记的启动子片段，有效提高了扩增的特异性和灵敏度。
28.(3)本发明通过利用磁珠与磁力架的磁性结合作用，相比传统的琼脂糖珠可以更有效的去除上清，更有效的去除非特异性结合的基因及蛋白，提高了反应的特异性；磁珠代替琼脂糖珠，省掉离心步骤，节约实验时间。
29.(4)本发明通过利用生物素与链霉亲和素具有高亲和力这一特性，通过pcr技术获得生物素标记的启动子片段，然后与偶联在磁珠上的链霉亲和素结合，从而保证了磁珠与目标片段结合的特异性。
附图说明
30.图1：一次pcr产物的电泳结果图，其中泳道1为dl2000 marker，泳道2为λ-hind lll，泳道3和泳道4为红鳍东方鲀趋化因子ccl25b的一次产物目标条带,泳道5和泳道6为红鳍东方鲀趋化因子ccr9b的一次产物目标条带；
31.图2：二次pcr产物的电泳结果图，其中泳道1和5为dl2000 marker，泳道2和3为经二次pcr扩增得到的ccr9b启动子片段，泳道6和7为经二次pcr扩增得到的ccl25b启动子片段，泳道4和8为阴性对照；
32.图3：dna pulldown法钓取出的互作蛋白(转录因子)效果图，其中泳道1为蛋白marker，泳道2为ccr9b启动子在脑中钓取的蛋白(转录因子)，泳道3为ccr9b启动子在鳃中钓取的蛋白(转录因子)，泳道4为ccr9b启动子片段，泳道5为dl2000 marker，泳道6为ccl25b启动子在脑中钓取的蛋白(转录因子)，泳道7为ccl25b启动子在鳃中钓取的蛋白(转录因子)，泳道8为ccl25b启动子片段。
具体实施方式
33.为了更好的说明本发明，下面结合附图和具体实施方式做进一步说明。本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。
34.实施例1：红鳍东方鲀趋化因子ccl25b及其受体ccr9b基因带有生物素标记的启动子序列的克隆
35.本实施例中申请人首先通过ncbi在线网站获取红鳍东方鲀ccl25b、ccr9b基因转录起始位点上游2000bp及下游500bp，并在此区域内设计一对外引物(ccl25bf1、ccl25br1、ccr9bf1、ccr9br1)。以红鳍东方鲀基因组dna为模板，使用rtaq酶扩增分别得到2013bp(ccl25b)、2040bp(ccr9b)的启动子片段；再以一次pcr产物为模板，设计一对内引物(ccl25bf2b、ccl25br2u、ccr9bf2b、ccr9br2u)，利用生物素标记的特异性通用引物(upl)，使用phanta max super-fidelity dna polymerase进行二次降落pcr扩增分别得到1120bp(ccl25b)、1130bp(ccr9b)启动子片段。
36.(1)所用外引物、内引物和labelled通用引物序列如表1：
37.表1.引物序列
[0038][0039]
(2)实验方法：
[0040]
采用传统方法提取红鳍东方鲀肌肉组织的dna，dna提取方法是本领域技术人员所熟知的，使用生工生物工程(上海)股份有限公司的《一步法动物组织活性蛋白提取试剂盒》(c500006)提取组织活性总蛋白：将100mg组织剪切成小块，加入适量的冰冷pbs洗涤两次后，4℃3000rpm离心3min，弃上清；将以上收集的组织中加入冷的抽提试剂，使用前每1ml抽提试剂加入1μldtt，10μlpmsf，1μl蛋白酶抑制剂，置玻璃匀浆器冰上均质30～50次，转移均质匀浆后的组织液到无菌无酶的ep管中，最大速度涡旋震荡10s，冰上放置20min，期间取出震荡3-5次，再于4℃，12000rpm离心10min以沉淀组织，转移上清为活性组织总蛋白部分。dna提取完成后，利用琼脂糖凝胶电泳检测dna的完整性，使用移液枪吸取2μldna溶液与1μl 6
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loading buffer混匀后点样，170v电泳20min，通过凝胶成像系统观察电泳结果检测dna的完整性。
[0041]
以红鳍东方鲀基因组dna为模板，进行巢式pcr反应，首先利用primer primer5.0设计一对外引物(表1)，其中ccl25bf1、ccl25br1为ccl25b基因所用外引物，ccr9bf1、ccr9br1为ccr9b基因所用外引物，ccl25bf1、ccl25br1、ccr9bf1和ccr9br1引物均是由上海捷瑞生物工程有限公司合成，进行普通pcr反应以克隆启动子片段，反应体系(20μl)如表2。
[0042]
表2.pcr反应体系
[0043][0044]
反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸2min10s，共进行34个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
[0045]
用1％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物条带大小是否正确(图1)，其中泳道1为dl2000 marker，泳道2为λ-hind lll，泳道3和4为ccl25b经pcr扩增后的目标片段，大小应为2013bp的单一条带，泳道5和6为ccr9b经pcr扩增后的目标片段，大小应为2040bp的单一条带，pcr产物条带检测合格后，使用天根生化科技(北京)有限公司的dna凝胶回收试剂盒回收纯化正确条带，实验步骤参照试剂盒所提供方法。
[0046]
将回收到的基因片段作为二次pcr的模板，利用primer primer5.0设计一对内引物，其中ccr9bf2b和ccr9br2u为ccr9b巢式pcr的内引物，ccl25bf2b和ccl25br2u为ccl25b巢式pcr的内引物，upl为具有生物素标记的特异性通用引物。ccl25bf2b、ccl25br2u、ccr9bf2b、ccr9br2u和生物素标记的特异性通用引物均是由华大基因合成，进行降落pcr反应以克隆带有生物素标记的启动子片段，反应体系(20μl)如表3。
[0047]
表3.降落pcr反应体系
[0048][0049]
反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，72℃退火与延伸1min30s，共进行5个循环；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸1min10s，共进行5个循环；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min10s，共进行25个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
[0050]
用2％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物条带大小是否正确(图2)，其中泳道1和5为dl2000 marker；泳道2为带有生物素标记的ccr9b启动子片段，大小应为1155bp的单一条带；泳道3为未被生物素标记的ccr9b启动子片段，大小应为1130bp的单一条带；泳道4为阴性对照，应无任何条带出现；泳道6为带有生物素标记的ccl25b启动子片段，大小应为1145bp的单一条带；泳道7为未被生物素标记的ccl25b启动子片段，大小应为1120bp的单一条带；泳8为阴性对照，应无任何条带出现。在检测产物条带大小正常的情况下，收集带有生物素标记的启动子片段并用普通dna产物纯化试剂盒进行纯化，实验步骤参照试剂盒所提供方法。将纯化后的带有生物素标记的启动子片段使用thermo nanodrop2000进行浓度测定并置于-20℃保存以备下游实验。
[0051]
经测定，带有生物素标记的ccr9b启动子片段平均浓度为139.62ng/μl，ccl25b启动子片段平均浓度为118.18ng/μl。
[0052]
实施例2：探针—磁珠复合物的制备
[0053]
按照streptavidin magnetic beads说明书中的磁珠与核酸的结合容量，每1mg磁珠可结合500pmol以上的单链25bp生物素标记的寡核苷酸，结合实施例1中测得的带有生物素标记的启动子片段浓度，将磁珠与生物素标记的启动子片段共孵育，步骤如下：
[0054]
(1)取出于4℃存放的磁珠，轻轻搅动并彻底悬浮磁珠30s或通过端对端倒置混合》5min；
[0055]
(2)分别取30μl磁珠置于两个无菌无酶离心管中，分别向其中加入200μl wash/binding buffer，涡旋以悬磁珠，置于磁力架上静置2min，去上清，重复三次；
[0056]
(3)向洗涤后的磁珠中加入420μl生物素标记的ccr9b启动子片段，向另一洗涤后的磁珠中加入520μl生物素标记的ccl25b启动子片段，(按照磁珠结合核苷酸标准的1.5倍原则加入)，涡旋以悬磁珠，4℃过夜，置于磁力架上静置2min，去上清；
[0057]
(4)向步骤4所得沉淀中加入500μl wash/binding buffer，涡旋以悬磁珠，置于磁力架上静置2min，去上清，重复三次；
[0058]
(5)向步骤5所得沉淀中加入100μlte，得探针-磁珠复合物。
[0059]
实施例3：红鳍东方鲀鳃组织活性蛋白的制备及浓度测定
[0060]
使用生工生物工程(上海)股份有限公司的《一步法动物组织活性蛋白提取试剂盒》(c500006)提取红鳍东方鲀鳃、脑组织的活性总蛋白并置于-80℃保存备用，实验步骤参照试剂盒所提供方法，将提取得到的组织活性总蛋白用bca蛋白浓度测定试剂盒(bl521a)及紫外分光光度计进行蛋白标准曲线的绘制并计算所提蛋白浓度，实验步骤参照试剂盒所提供方法。
[0061]
经计算，所提鳃蛋白浓度为4.04μg/μl、所提脑蛋白浓度为4.56μg/μl。
[0062]
实施例4：蛋白—探针—磁珠复合物的制备
[0063]
根据实施例3中所测得的红鳍东方鲀鳃、脑组织总蛋白的浓度，按照每30μl磁珠加入500μg组织总蛋白的标准，制备蛋白—探针—磁珠复合物，步骤如下：
[0064]
(1)将所提鳃、脑组织总蛋白从-80℃取出后，至于冰盒内缓慢复温，分别取110μl脑组织蛋白样品、170μl鳃组织蛋白样品，向其中加入2μl蛋白酶抑制剂、2μl dtt，混匀后加入到探针-磁珠复合物中。
[0065]
(2)将步骤1所得混合物充分颠倒混匀后，置于4℃孵育5h。
[0066]
(3)将步骤2中孵育后的混合物置于磁力架上静置2min，去除上清液，收集磁珠。
[0067]
(4)用冰冷pbs(500μl)洗涤步骤3中收集的磁珠，重复三次，尽可能去除上清，收集沉淀，得蛋白—探针—磁珠复合物。
[0068]
实施例5：sds-page垂直电泳检测
[0069]
向实施例4所得蛋白—探针—磁珠复合物中分别加入48μlpbs和12μl 5
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蛋白上样缓冲液，95℃加热5min，取上清进行sds-page垂直电泳检测(图3)。泳道1为蛋白marker，泳道2为ccr9b启动子在脑中钓取的蛋白(转录因子)，泳道3为ccr9b启动子在鳃中钓取的蛋白(转录因子)，泳道4为ccr9b启动子片段，泳道5为dl2000 marker，泳道6为ccl25b启动子在脑中钓取的蛋白(转录因子)，泳道7为ccl25b启动子在鳃中钓取的蛋白(转录因子)，泳道8为ccl25b启动子片段。
[0070]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并
不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。