一种蝙蝠蛾卵的消毒方法与流程

：
1.本发明属于冬虫夏草人工培育技术领域，具体涉及一种蝙蝠蛾卵的消毒方法。


背景技术：

2.冬虫夏草是由冬虫夏草菌ophiocordyceps sinensis侵染蝙蝠蛾幼虫形成的虫菌复合体(或虫形菌核以及在虫形菌核上生长形成的子座)，是青藏高原特有的珍稀生物资源。随着冬虫夏草消费量剧增，野生冬虫夏草的产量无法满足市场需求。为保护高原生态环境和珍贵生物资源，促进生物经济的发展，模拟高原生态的冬虫夏草人工培育已业已取得重大突破，包括冬虫夏草菌子实体的人工培育、寄主昆虫蝙蝠蛾低海拔规模化人工饲养以及利用冬虫夏草菌感染蝙蝠蛾幼虫获得媲美野生的冬虫夏草。在冬虫夏草人工培育过程中，尤其是寄主昆虫蝙蝠蛾规模化人工饲养过程中，污染控制极为重要。作为源头控制措施之一，冬虫夏草寄主昆虫蝙蝠蛾卵的无菌化是污染控制的关键步骤。
3.许多方法已用于昆虫卵的消毒，如利用氯化汞、硫柳汞、甲醛、二氧化氯、次氯酸钠等。蝙蝠蛾卵壳一般粘附大量来自雌虫的黏液，这些黏液在高原寒冷环境中具有保护卵的作用，但是，这些黏液携带来自母体和环境的大量微生物，因此单一消毒剂难以使蝙蝠蛾卵表面无菌化。同时，各种消毒剂的作用效果不同，对卵孵化的影响也有差异。因此，有必要建立既有效杀灭蝙蝠蛾卵表微生物又尽可能不伤害卵孵化的方法。cn 113261536 a公开了一种蝙蝠蛾卵的消毒处理方法，包括以下步骤：用温水对蝙蝠蛾卵进行清洗；将蝙蝠蛾卵表面去水；将过氧化氢根离子消毒液原液与水按1:150～1:250比例稀释，浸泡蝙蝠蛾卵15～25分钟；脱碱处理并做去水处理；使用盐酸、福尔马林和清水按1:1:15～1:1:20的比例配制消毒液，对蝙蝠蛾卵进行消毒处理；将蝙蝠蛾卵再次晾干。但是，这种方法耗时较长(大于20分钟)；消毒时的温度范围为18-25℃，对卵孵化和以后生长的影响未明确；更重要的是该专利未公开蝙蝠蛾卵的消毒效果。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种可有效杀灭蝙蝠蛾卵表面的细菌、真菌和微孢子虫，保持卵的正常孵化率的蝙蝠蛾卵表面的无菌化方法，从而解决蝙蝠蛾昆虫规模化饲养中来自卵表面的微生物污染问题。
5.本发明的蝙蝠蛾卵的消毒方法，包括以下步骤：
6.在温度10-16℃下，用无菌pbs冲洗蝙蝠蛾卵，再以消卵液a浸泡消毒，用无菌pbs冲洗蝙蝠蛾卵，再以消卵液b浸泡消毒，用无菌pbs冲洗蝙蝠蛾卵，获得消毒后的卵；
7.所述的消卵液a是含氢氧化钠和次氯酸钠的溶液，所述的消卵液b为含甲醛的溶液。
8.优选，所述的消卵液a为含质量比2.4％的氢氧化钠和体积比5％的次氯酸钠的水溶液，所述的消卵液b为含质量分数37％甲醛的水溶液。
9.优选，所述的蝙蝠蛾包括但不限于钩蝠蛾属thitarodes、蝠蛾属hepialus或无钩
蝠蛾属ahamus的冬虫夏草菌主要寄主昆虫，尤其是小金蝠蛾hepialus xiaojinensis、虫草钩蝠蛾thitarodes armoricanus、贡嘎钩蝠蛾t.gonggaensis、剑川钩蝠蛾t.jianchuanensis、康定钩蝠蛾t.kangdingensis、云南钩蝠蛾t.yunnanensis、玉树钩蝠蛾t.yushuensis、桑巴钩蝠蛾t.shambalaensis等。
10.优选，具体步骤为：
11.a1：以无菌pbs冲洗蝙蝠蛾卵两次，每次30秒；
12.a2：以消卵液a浸泡7-10分钟，然后无菌pbs冲洗蝙蝠蛾卵两次，每次30秒；
13.a3：以消卵液b浸泡3-8分钟，然后无菌pbs冲洗蝙蝠蛾卵两次，每次30秒，获得消毒后的卵；
14.这些步骤使用的温度范围为10-16℃；
15.所述的消卵液a为含质量比2.4％的氢氧化钠和体积比5％的次氯酸钠的水溶液，所述的消卵液b为含质量分数37％甲醛的水溶液。
16.本发明公开的蝙蝠蛾卵消毒方法有效杀灭细菌和真菌(通过平板检测消毒卵的无菌性)，消毒时间短(约12分钟)，使用对卵发育友好的温度范围(10-16℃)，对蝙蝠蛾卵孵化率无显著影响(与未消毒的受精卵无显著差异)，实现了冬虫夏草人工培育过程中蝙蝠蛾卵表面的无菌化。
具体实施方式：
17.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
18.实施例1：
19.消卵液a：于超净工作台中，以无菌水配制含质量比2.4％的氢氧化钠和体积比5％的次氯酸钠的水溶液。
20.消卵液b：于生物安全柜中，以无菌水配制含质量分数37％甲醛的水溶液。
21.蝙蝠蛾卵消毒：将小金蝠蛾雌虫所产的卵置于垫上湿润滤纸的培养皿(直接＝9cm)中，置于12℃下；消毒前，在生物安全柜中将卵收集、装入不锈钢筛网中(筛网体积根据消毒卵的数量选择)，以无菌pbs(称取8.0g nacl、0.2g kcl、1.44g na2hpo4、0.24g kh2po4溶于800ml蒸馏水中，用hcl调节溶液至7.4，最后加蒸馏水定容至1l即可得0.01m pbs缓冲液，灭菌消毒备用)将卵表面充分被湿润，避免后续步骤卵仍出现漂浮、无法完全接触消卵液；以无菌pbs冲洗蝙蝠蛾卵两次，每次30秒；然后分别进行以下处理：
22.a处理(处理1-4)：将蝙蝠蛾卵浸泡消卵液a中7或10分钟，然后无菌pbs冲洗蝙蝠蛾卵两次，每次30秒；再将蝙蝠蛾卵浸泡消卵液b中3或8分钟，然后无菌pbs冲洗蝙蝠蛾卵两次，每次30秒。整个消毒过程中，操作室的温度为10-16℃。
23.b处理(对照2-5)：将蝙蝠蛾卵浸泡消卵液a中7或10分钟，然后无菌pbs冲洗蝙蝠蛾卵两次，每次30秒；再将蝙蝠蛾卵浸泡消卵液a中3或8分钟，然后无菌pbs冲洗蝙蝠蛾卵两次，每次30秒。整个消毒过程中，操作室的温度为10-16℃。
24.c处理(对照6-9)：将蝙蝠蛾卵浸泡消卵液b中7或10分钟，然后无菌pbs冲洗蝙蝠蛾卵两次，每次30秒；再将蝙蝠蛾卵浸泡消卵液b中3或8分钟，然后无菌pbs冲洗蝙蝠蛾卵两次，每次30秒。整个消毒过程中，操作室的温度为10-16℃。
25.由此获得经过a、b、c处理后消毒的卵。
26.1、蝙蝠蛾卵的消毒效果检测：以无菌毛笔沾无菌水浸湿，将消毒的卵分别移入lb(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，用去离子水定容至1l；ph＝7.0，灭菌备用)和ppda(去皮土豆200g，葡萄糖20g，蛋白胨10g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，维生素b120mg，水1000ml，其配制方法是将去皮土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20-30min，用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取，滤液中加入葡萄糖，蛋白胨，磷酸二氢钾，硫酸镁，维生素b1，补充水分到1000ml，灭菌备用)平板中，每个平板约加入100粒卵，每个处理设置3个重复，每个重复设置10块平板；将加入虫卵的平板置于9-13℃培养室中，12天后观察平板中是否出现细菌、真菌及其它微生物，统计平板的污染率。结果如表1所示，消卵液a和b不同消毒时间的组合均能杀灭蝙蝠蛾卵表面的微生物，消毒卵在平板中未出现微生物污染。加入未消毒卵的平板和其他消毒处理的卵的平板均被细菌和真菌污染。
27.表1蝙蝠蛾卵的消毒效果
28.消毒处理编号消卵液a消毒时间消卵液b消毒时间平板污染率(％)对照1(未消毒卵)
ꢀꢀ
100对照27 30100对照37 80100对照410 30100对照510 80100对照607 3100对照707 8100对照8010 3100对照9010 8100处理1730处理2780处理31030处理41080
29.注：平板污染率(％)是指消毒卵置于lb和ppda平板中9-13℃下培养12天时出现微生物的平板比例。
30.2、蝙蝠蛾卵孵化率检测：在超净工作台中，将消毒卵加入垫上无菌湿润滤纸的培养皿(直径＝9cm)中(每个平板约100粒)，每个处理3块平板，将加入虫卵的平板置于9-13℃培养室中，待到卵孵化到未出现幼虫为止，计数培养皿中所有卵粒、已孵化卵粒(以及幼虫数量)和未孵化卵粒。未孵化卵粒一般为未受精卵。设立未消毒蝙蝠蛾卵作为对照。结果显示(表2)，消卵液a和b不同消毒时间的组合处理的蝙蝠蛾卵孵化率与未消毒卵的无显著差异，说明本发明使用的蝙蝠蛾卵消毒方法未显著影响卵的孵化率。
31.表2蝙蝠蛾卵消毒后的孵化率
32.消毒处理编号消卵液a消毒时间消卵液b消毒时间卵孵化率(％)对照(未消毒卵)
ꢀꢀ
51.95
±
4.55％a处理17351.15
±
3.95％a处理27855.35
±
4.05％a处理310350.64
±
2.35％a
处理410853.64
±
4.35％a
33.注：相同字母表示处理间在5％水平差异显著(tukey检验)。