纯化C1-INH的方法与流程

纯化c1-inh的方法
1.本发明涉及一种纯化c1-酯酶抑制剂(c1-inh)的方法，更具体地，涉及一种c1-inh浓缩物。
2.c1-inh是一种补体激活途径的蛋白质，它是血浆中存在的蛋白酶的抑制剂，通过与激活的c1r和c1s形成共价复合物来控制c1激活。它还“控制”重要的凝血酶，例如血浆前激肽释放酶、因子xi和xii，以及纤溶酶。
3.c1-inh缺乏例如与遗传性血管性水肿(hae)相关，该疾病是由c1-inh缺乏(haei型)或c1-inh活性降低(haeii型)引起的。c1-inh缺乏也可能由消耗c1-inh引起，这是由于血液接触表面(如心肺机中)时产生的酶的中和，但也可能是在启动凝血级联反应的疾病过程中，如在慢性疾病、特别是风湿性疾病的情形下出现的免疫复合物导致的。目前，c1-inh蛋白替代必须被视为预防或治疗急性hae的金标准。这对于市售的人血浆衍生的c1-inh尤其如此，据报道，与在转基因兔中产生的、与人c1-inh蛋白不同的市售重组c1-inh相比，市售的人血浆衍生的c1-inh具有更天然的功能(feussner et al.,transfusion 2014oct；54(10):2566-73,doi:10.1111/trf.12678)。已被考虑的其他治疗应用包括使用c1-inh预防、减少和/或治疗缺血再灌注损伤(参见wo2007/073186)。
4.从人血浆中分离和/或纯化c1-inh是一种已知的、但或多或少有些昂贵、特别是经常非常耗时的过程。从血浆中制备c1-inh的不同方法包括各种分离方法，例如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤、沉淀和疏水相互作用层析。单独使用这些方法中的任何一种通常不足以充分纯化c1-inh，特别是c1-inh浓缩物，因此在现有技术中已经提出了它们的各种组合。
5.ep0698616b描述了使用阴离子交换层析，然后进行阳离子交换层析。ep0101935b描述了沉淀步骤和疏水相互作用色谱在负模式下的组合，以达到以约20％产率获得90％纯度的c1-inh制剂。us5030578描述了peg沉淀和jacalin-琼脂糖色谱以及负模式下的疏水相互作用色谱。
6.wo01/46219描述了一种方法，其中在酸性条件下(ph相应地设置为ph5.5)用阴离子交换剂将含c1-inh的起始材料处理两次。第一个离子交换步骤之后是peg沉淀，然后是第二个离子交换步骤，就像在的生产中一样，已知它仍然包含act(参见feussner et al.,transfusion 2014oct；54(10):2566-73,doi:10.1111/trf.12678)。
7.在用于治疗血管性水肿的四种市售c1-inh浓缩物中，三种是血浆来源的。它们以商品名和出售。这些c1-inh浓缩物是根据不同的专有工艺制备的(参见feussner et al.,transfusion 2014oct；54(10):2566-73,doi:10.1111/trf.12678)。已知这些专有工艺分别涉及一系列步骤，包括但不限于：冷沉淀、离子交换色谱、沉淀、巴氏杀菌、超滤和/或渗滤和/或疏水相互作用色谱。这些多步骤过程是完善、稳健和可靠的。它们产生大量产物，其中可检测到的伴随蛋白质、特别是α-1-抗胰凝乳蛋白酶(act)的量很小。
8.尽管分子量仅为c1-inh的一半，但act在血浆衍生的c1-inh制剂(例如上述
或)的制造过程中会进行共纯化。其中，(和)的act水平最低(feussner et al.,transfusion 2014oct；54(10):2566-73,doi:10.1111/trf.12678)，即远低于5μg/iu c1-inh。
9.不言而喻，制造商力求提供尽可能纯净的产品。只要它们对实际最终产品的效果和安全性没有负面影响，微量的伴随蛋白质是可以接受的。但原则上，即使是微量的伴随蛋白质也是不需要的。
10.有可能在实验室规模上从相应的制剂中分离出100％纯的c1-inh。然而，出于经济原因，在工业规模上实现如此高的纯度并不容易和可靠，而仅仅是由于与耗时的过程相关的产品损失。换言之，衍生此类制剂的原材料，即血液，并不足够丰富而能够允许仅为了达到极高的纯度而过度损失活性物质。
11.无论如何，制造商不断努力改进各自的工艺。在改进已建立的多步骤工艺(例如制造中使用的流程)方面的相应努力可能意味着要审查和修改各个步骤。例如，此类更改可能会导致更高的产量、更快的处理时间等。或者，由于其他原因，例如供应链中的更改(例如，工艺中使用的第三方材料的可用性等)可能只需要进行小的更改)。每一个小的改变都可能带来不便。例如，伴随蛋白质的数量，虽然仍然非常微小，但可能比相应变化之前少。
12.c1-inh制剂中存在的微量act长期以来—并且仍然被认为不会造成伤害。然而，仍然希望提供尽可能纯的c1-inh制剂，从而进一步降低通过多步方法从血浆中获得的c1-inh制剂中的act含量。
13.act蛋白由423个氨基酸组成，包括在氨基末端的25个残基的信号肽，该信号肽从成熟蛋白中切割下来。由于多个位点的重度糖基化，act的总分子量约为55至66kda。它具有典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂结构(baker et al.,serpina3(aka alpha-1-antichymotrypsin),front.biosci.2007(12),2821-2835)。act发现同源蛋白酶形成丝氨酸蛋白酶抑制剂：蛋白酶复合物，肝脏将其从循环血浆中清除的速度比单独act快10到50倍(mast et al.,biochem.1991(30),1723-1730)。act是一种急性期蛋白，血浆水平会响应于炎症而升高。它在急性期响应中的作用是作为几种丝氨酸蛋白酶的抑制剂，最明显的是白细胞组织蛋白酶g(crispe,j.immunol.2016(196),17-21)。组织蛋白酶g在炎症部位释放，在那里它杀死和降解病原体、重塑组织并激活促炎细胞因子和受体。丝氨酸蛋白酶抑制剂调节例如act可避免组织蛋白酶g的过度或延长活性和由此产生的组织损伤。人血浆中act的浓度通常在400mg/l左右((hollander et al.,bmc pulm.med.2007(29),7)。
14.已知市售的act制剂包含浓度范围为31μg/iu c1-inh(在的情况下)或低于5μg/iu c1-inh(在或的情况下)的act。
15.为确保act的水平低于5μg/iu c1-inh或更低，需要能够通过多步过程以c1-inh产品最小损失的方式对从血浆中获得的c1-inh制剂进行进一步纯化或“精制”的方法。通常很难获得足够量的人血浆来满足现有需求。在已建立和优化的多步骤工艺中获得的c1-inh制剂高度浓缩。因此，从血浆中获得的现有c1-inh制剂的进一步纯化或精制不应带来不便，例如产品损失、不必要的稀释等。
16.为了解决这个问题，本发明提供了一种对通过包括几个步骤的在前方法从血浆中获得的c1-inh制剂耗尽1-抗凝乳蛋白酶(act)的方法，其中从c1-inh制剂中耗尽act是通过阴离子交换色谱法进行的。
17.构成起始材料的c1-inh制剂中的act浓度可以是例如低于100、50、35、30、25、20、15μg/iu c1-inh，优选低于35μg/iu c1-inh，更优选低于10μg/iu c1-inh，最优选低于5μg/iu c1-inh。
18.发明人能够显著减少c1-inh制剂中仍然存在的act含量，而基本上不会伴随c1-inh产物的损失或不必要的稀释，提供了有效的精制步骤，提高了旨在用作药物的现有c1-inh制剂的纯度和安全性。
19.优选地，c1-inh制剂是通过包括、但不限于下述的几个步骤的在前方法从血浆中获得的制剂：冷沉淀、离子交换色谱、沉淀、巴氏杀菌、超滤和/或渗滤和/或疏水相互作用色谱。
20.相应的c1-inh制剂以商品名和为人所知。用于生产它们的制造过程所产生的制剂中act含量已经很低。
21.在上下文中注意到，据报道和/或的制造涉及冷沉淀、各种离子交换色谱步骤、peg沉淀、巴氏杀菌、过滤和冻干，而据报道的制造涉及冷沉淀、离子交换色谱、季氨乙基吸附、硫酸铵沉淀、巴氏杀菌、疏水相互作用层析、过滤和冻干。由于后者产生比前者更纯的产品，即具有更低的act含量，从后者中进一步耗尽act可能会以甚至更少的资源产生比在制造过程中已经获得的获自血浆的更好c1-inh制剂，因此是特别优选的。
22.因此，特别优选的是c1-inh制剂是通过包括但不限于疏水相互作用层析在内的几个步骤的在前方法从血浆中获得的制剂。
23.优选地，根据本发明的方法包括以下步骤：
24.(i)在其中c1-inh和act与固定相结合的第一条件下，用c1-inh制剂装载包含固定相的阴离子交换色谱柱；
25.(ii)任选的洗涤已装载柱的步骤；
26.(iii)应用第二条件以通过流动相洗脱act；
27.(iv)应用第三条件以通过流动相洗脱c1-inh。
28.优选地，前述步骤(iii)中的第二条件包括使用离子强度a的洗脱缓冲液，并且前述步骤(iv)中的第三条件包括使用离子强度b的洗脱缓冲液，其中离子强度a和b是不同的。
29.优选通过盐浓度梯度或通过使用具有不同盐浓度ca和cb的洗脱缓冲液eba和ebb的分步洗脱来实现从离子强度a到离子强度b的转变。
30.优选地，洗脱缓冲液eba由电导率为25℃下18.7至20.20ms/cm，优选25℃下18.9至19.8ms/cm，最优选25℃下19.2ms/cm的缓冲液组成，或更优选由10mm tris，175-190mm nacl(优选175-185mm nacl，最优选180mm nacl)，ph7.2组成。
31.选择洗脱缓冲液eba使得c1-ihn保持与荷载柱结合，其中至少一种或多种污染蛋白不与荷载柱结合，而选择洗脱缓冲液ebb使得与荷载柱结合的基本上所有c1-inh都不再结合，能够收集在洗脱液中。
32.通过精确选择洗脱缓冲液eba和ebb，可以在不损失或仅损失最少量c1-inh的情况下耗尽act等污染蛋白。
33.洗脱缓冲液ebb的电导率为25℃下高于25.3ms/cm，或25℃下高于30.4ms/cm，或25℃下高于38.5ms/cm，或25℃下高于47,7ms/cm，或25℃下高于54,8ms/cm，或25℃下高于63,4ms/cm，或25℃下高于69,7ms/cm，或25℃下高于77,8ms/cm，或25℃下等于或高于84,4ms/cm，其中洗脱缓冲液ebb基本上洗脱所有仍与阴离子交换色谱结合的c1-inh。技术人员可以容易地确定必要条件。
34.更优选地，洗脱缓冲液ebb由10mm tris、250mm nacl、ph7.2组成；或由10mm tris，300mm nacl，ph7.2组成；或由10mm tris，400mm nacl，ph7.2组成；或由10mm tris，500mm nacl，ph7.2组成；或由10mm tris，600mm nacl，ph7.2组成；或由10mm tris，700mm nacl，ph7.2组成；或由10mm tris，800mm nacl，ph7.2组成；或由10mm tris，900mm nacl，ph7.2组成，或由10mm tris，1m nacl，ph7.2组成。
35.缓冲液组成在25(
±
0.5)℃下测定的电导率10mm tris,250mm nacl ph 7.225,3ms/cm10mm tris,300mm nacl ph 7.230,4ms/cm10mm tris,400mm nacl ph 7.238,5ms/cm10mm tris,500mm nacl ph 7.247,7ms/cm10mm tris,600mm nacl ph 7.254,8ms/cm10mm tris,700mm nacl ph 7.263,4ms/cm10mm tris,800mm nacl ph 7.269,7ms/cm10mm tris,900mm nacl ph 7.277,8ms/cm10mm tris,1000mm nacl ph 7.284,4ms/cm
36.本发明的方法确实组合了缓冲液eba和ebb，如下所述：
37.a)
38.(i)洗脱缓冲液eba的电导率为25℃下18.7至20.2ms/cm，优选25℃下18.9至19.8ms/cm，最优选25℃下19.2ms/cm；
39.(ii)洗脱缓冲液ebb的电导率为25℃下高于25.3ms/cm，或25℃下高于30.4ms/cm，或25℃下高于38.5ms/cm，或25℃下高于47.7ms/cm，或25℃下高于54.8ms/cm，或在25℃下高于63.4ms/cm，或25℃下高于69.7ms/cm，或25℃下高于77.8ms/cm，或25℃下等于或高于84.4ms/cm，其中洗脱缓冲液ebb洗脱步骤(i)后仍然结合在阴离子交换色谱柱上的基本上所有c1-inh。或者
40.b)
41.(i)洗脱缓冲液eba由10mm tris、175-190mm nacl(优选175-185mm nacl，最优选180mm nacl)，ph7.2组成，和
42.(ii)洗脱缓冲液ebb的电导率为25℃下高于25.3ms/cm或25℃下高于30.4ms/cm，或25℃下高于38.5ms/cm，或25℃下高于47.7ms/cm，或25℃下高于54.8ms/cm，或25℃下高于63.4ms/cm，或25℃下高于69.7ms/cm，或25℃下高于77.8ms/cm，或25℃下等于或高于84.4ms/cm，其中洗脱缓冲液ebb洗脱步骤(i)后仍然结合在阴离子交换色谱柱上的基本上所有c1-inh。
43.或者
44.c)
45.(i)洗脱缓冲液eba由10mm tris、175-190mm nacl(优选175-185mm nacl，最优选180mm nacl)，ph7.2组成，和
46.(ii)洗脱缓冲液ebb由10mm tris、250mm nacl、ph7.2组成或由10mm tris、300mm nacl、ph7.2组成；或由10mm tris，400mm nacl，ph7.2组成；或由10mm tris，500mm nacl，ph7.2组成；或由10mm tris，600mm nacl，ph7.2组成；或由10mm tris，700mm nacl，ph7.2组成；或由10mm tris，800mm nacl，ph7.2组成；或由10mm tris，900mm nacl，ph7.2组成，或由10mm tris，1m nacl，ph7.2组成。
47.发明人发现此类条件特别有用，因为它们允许消除act而没有c1-inh的实质性损失，即在这种情况下c1-inh回收率高于90％，优选至少95％，而act实质上下降，即下降50％或更多。
48.阴离子交换色谱中使用的固定相材料属于弱阴离子交换剂类型，例如deae(ge出售，使用二氨基乙基作为官能团)或-优选-强阴离子交换剂，例如q hp树脂、impres树脂、树脂(均由ge出售，均以季铵为官能团)或tmae、(由默克出售，以三甲基氨乙基为官能团)。
49.其中，最优选具有普通铵作为官能团的树脂。
50.优选地，c1-inh制剂来源于人血浆。
51.应当理解，血浆源自血液，其中血液是指在人类和其他动物中发现的体液。这意味着根据本发明的方法可用于精制源自各种动物血浆、但优选人血浆的c1-inh制剂，其中从人血浆获得的c1-inh制剂因为它们在治疗例如患有血友病的人中的重要性而是特别优选的。
52.进一步优选的是，c1-inh制剂基本上由溶解在介质中的c1-inh和act组成。
53.本发明的目的是进一步精制这种制剂，而不管它们的获得方式如何。优选地，act含量低于100、50、35、30、25、20、15μg act/iu c1-inh，优选低于35μg act/iu c1-inh，更优选低于10μg act/iu c1-inh，最优选低于5μg act/iu c1-inh。
54.本发明进一步提供了一种源自血浆的c1-inh制剂，其通过使用根据上述任一方法的方法能够获得。
55.虽然从血浆中获得的c1-inh制剂原则上是已知的，但是现有技术中不知道如本文所述已经消除了act的相应制剂。虽然原则上有可能获得高度纯化的c1-inh，即其中没有任何残留痕量的act，但根据本发明的方法非常显著地降低了act水平，但没有达到完全排除act。
56.下面通过附图和实施例对本发明作更详细的说明，其中附图描述如下：
57.图1：电泳凝胶图，显示根据现有技术的市售c1-inh制剂中存在act；
58.图2：通过成熟的工业方法获得的c1-inh制剂在以结合/洗脱模式进行aex的色谱图和在同一实验中获得的洗脱物样品的sds-page凝胶；
59.图3：对通过成熟的工业方法获得的c1-inh制剂使用以结合/洗脱模式进行的aex获得的洗脱物样品的sds-page凝胶；
60.图4：对通过成熟的工业方法获得的c1-inh制剂使用以结合/洗脱模式进行的aex获得的洗脱物样品的sds-page凝胶，以比较各种洗脱缓冲液；
61.图5：概述了在使用高离子强度c1-inh缓冲液的第二aex色谱洗脱液中c1-inh回收的纯度和程度的图表，这取决于使用nacl浓度为170至195mm的低离子强度缓冲液(对应于25℃下电导率为18.7至20.7ms/cm的缓冲液)在从同一aex基质第一次洗脱时使用的洗脱液缓冲液的盐含量。
62.图6：描述在使用高离子强度缓冲液的第二次aex色谱洗脱液中c1-inh和act的量的图表，这取决于使用nacl浓度为170至195mm的低离子强度缓冲液(对应于25℃下电导率为18.68至20.7ms/cm的缓冲液)在从同一aex基质第一次洗脱时使用的洗脱液缓冲液的盐含量。
63.在本发明的上下文中，以下定义适用：
64.在本发明的权利要求书和说明书中，“c1-inh”、“c1-inh”、“c1-inh制剂”和“c1-inh制剂”同时用于表示含有蛋白质c1-酯酶抑制剂的浓缩物，特别是含有蛋白c1-酯酶抑制剂的浓缩液。当提到技术背景和/或现有技术时，“c1-inh”也可以指蛋白质本身，例如在讨论c1-inh缺乏症的背景下。
65.在本技术/专利中：
66.‑“
hic”是指疏水相互作用色谱；
67.—“aex”指阴离子交换色谱法；
68.‑“
aex树脂”是指在aex中用作固定相的树脂；
69.‑“
强aex树脂”是指可在很宽的ph范围内使用的高度离子化的aex树脂；
70.‑“
弱aex树脂”是指离子化程度强烈依赖于ph值的树脂；
71.‑“
bc”表示色谱柱的结合能力；
72.‑“
负模式”或“流通模式”或“流通”是指在目标化合物(例如c1-inh)不与色谱柱的固定相结合的条件下进行色谱的方式；
73.‑“
结合模式”、“结合和洗脱”或“正模式”代表首先在目标化合物(例如c1-inh)与色谱柱固定相结合的条件下、然后在从色谱柱中洗脱出相同化合物的条件下进行的色谱；
[0074]-当“化合物与固定相结合”时，意思是被固定相吸附或保留在固定相上，而对化合物的结构完整性没有影响，优选不是通过共价键或化学吸附作用，而是通过物理吸附作用；
[0075]
‑“
wfi”是指“注射用水”；
[0076]
‑“
浓度梯度”表示溶液中溶解物质的浓度从较高浓度逐渐变化到较低浓度，
[0077]
‑“
分步洗脱”是指从第一浓度突然转变到第二浓度，而不是像浓度梯度中的连续转变，其中浓度逐渐降低；
[0078]
‑“
％”表示“重量百分比”，除非另有说明；
[0079]
‑“
沉淀剂”是引发蛋白质沉淀的试剂；
[0080]
‑“
洗脱物部分”是指从色谱柱流出的流动相流的一部分，无论其中包含的特定分析物之前是否与固定相结合或保留(如本文所述的正模式)或未结合(如此处提到的负模式)。
[0081]
下面将参照附图对本发明作更详细的说明。
[0082]
图1显示了现有技术已知的市售c1-inh制剂的电泳凝胶。虚线表示c1-inh(105kd)
的分子量。可以清楚地区分以商品名的分子量。可以清楚地区分以商品名和已知的源自血浆的市售c1-inh制剂之间的差异。该凝胶中的泳道1至5显示和包含痕量act，其中含有最少量的act(图1、1)，如feussner等人中更详细讨论的那样。和以及分别是通过涉及几个步骤的过程从血浆中获得的c1-inh制剂。制造和所涉及的步骤之前已经描述过(feussner等人,transfusion 2014oct；54(10):2566-73,doi:10.1111/trf.12678)。
[0083]
图2表示根据本发明的aex色谱实验的色谱图和分析来自该实验的洗脱样品的sds-page凝胶；柱负载是从c1-inh制剂的生产中取出的c1-inh浓缩物，即制备过程中最后一个疏水相互作用色谱步骤的洗脱液(稀释1:25)；结合能力bc为15mg蛋白质/ml树脂；通过从30mm到1000mm nacl的盐梯度进行分离。峰前洗脱物样品明显包含act，如图2中的sds-page凝胶所显示的(参见泳道6)。因此，图2的色谱图和sds-page凝胶证明了从通过涉及多个步骤的方法获得的、通过使用aex色谱已经包含非常低浓度的act的c1-inh制剂中消耗act。
[0084]
图3表示从aex色谱实验中获得的洗脱样品的sds-page凝胶，其柱载量和结合能力与图2所示的实验相同，但使用较不陡峭的盐梯度，即30mm至515mm nacl。图3的sds-page凝胶证明了使用aex色谱法从c1-inh制剂中消耗act。
[0085]
图4表示使用分步洗脱从aex色谱实验中获得的洗脱样品的sds-page凝胶，其中所述分步洗脱使用不同盐浓度的第一洗脱缓冲液，目的是从固定相洗脱act。“e1”表示对应于相应洗脱液1样品的泳道，“e2”表示对应于相应洗脱液2样品的泳道。可以清楚地看出，从c1-inh制剂中消耗act的程度随着盐浓度的增加而增加，而洗脱液2中c1-inh的回收程度随着盐浓度的增加而降低。
[0086]
图5显示了洗脱液2中c1-inh回收的纯度和程度，对于用于比较的不同洗脱物缓冲液1，这取决于洗脱液缓冲液1的盐含量。从图5可以推断出，nacl浓度范围为175-190，优选175-185，最优选180mm nacl的洗脱液缓冲液1最适合最大限度地从c1-inh制剂消耗act，而没有c1-inh的实质性损失。
[0087]
图6显示了对于用于比较的不同洗脱液缓冲液1而言，洗脱液2中c1-inh和act的量，取决于洗脱剂缓冲液1的盐含量。图6显示，与洗脱剂缓冲液1中较低的离子强度相比，在用于第一洗脱的缓冲液中nacl为175mm或更高浓度时，可以实现act的好得多的耗尽，而在洗脱剂缓冲液1中高于190mm的离子强度下，c1-inh的产率变得太低而无法商业化。
[0088]
源自动物血液，特别是人血的c1-inh制剂如今通过各种多步骤过程获得。脱离人血浆的已建立的工艺包括冷沉淀、离子交换色谱、季氨乙基吸附、硫酸铵沉淀、巴氏杀菌和疏水相互作用色谱等步骤的制造中包含的工艺步骤，参见feussner等人，或ep0101935)或冷沉淀、离子交换色谱的各个步骤、用peg(特别是peg-4000)沉淀和巴氏杀菌(包括在制造中的工艺步骤)。这些方法的共同点是它们包括沉淀步骤。附加的最后步骤是过滤和冻干。本发明提出增加阴离子交换色谱的额外步骤，以进一步纯化通过例如上面所述的多步骤工艺获得的c1-inh制剂，从而提供“精制”步骤，以进一步
提高现有产品的安全性。该精制步骤可以在过滤和冻干之前进行，但也可以是一系列其他步骤之后的最后一步，产生几乎对应于最终产品的c1-inh浓缩物或c1-inh制剂。
[0089]
出人意料的是，在额外的精制步骤中使用aex色谱法能够进一步从c1-inh制剂中耗尽act，而不会造成c1-inh的实质损失，也无需不必要的稀释。尽管aex色谱法早已为人所知，尽管偶尔会提到它用于制备c1-inh浓缩物，并且也在将c1-inh与伴随的蛋白质分离的背景下，但它迄今为止还没有被用于从通过多步方法获得的c1-inh制剂中耗尽act的具体目标，其中act仍然作为杂质存在，尽管过去已经做出了相当大的努力来获得基本上纯的c1-inh制剂。
[0090]
鉴于这种背景，根本不能够预期到这种方法是有可能的。相当令人惊讶的是，通过包含相应的精制步骤(即在相应工艺的相对较后阶段)，仍然可以改进能够以工业规模生产c1-inh制剂的已很好建立的方法。
[0091]
下面将通过参考实施例更详细地描述本发明。
实施例
[0092]
实施例1
[0093]
取自c1-inh制剂的生产中的c1-inh浓缩物，即制备中最后一个疏水相互作用色谱(hic)步骤的洗脱液被稀释1:25，以降低在前面的hic中使用的离液剂硫酸铵(as)的浓度，以实现蛋白质结合。然后以结合/洗脱模式进行aex色谱，即使用结合缓冲液将起始材料加载到柱上，随后用洗涤缓冲液洗涤，最后通过施加盐梯度洗脱。缓冲液和梯度的组成以及更多细节见表a-1，相应的色谱图和sds-page凝胶见图2。
[0094]
表a-1:
[0095][0096]
因此，实施例1证明了通过使用aex色谱法从通过涉及多个步骤的方法获得的、包含已经非常低浓度的act的c1-inh制剂中耗尽了act。
[0097]
实施例2
[0098]
如实施例1中所述进行aex层析，但洗脱梯度为10mm nacl至515mm nacl。相应的色谱图显示在上文讨论的图3中。因此，实施例2证明了通过使用aex色谱法从通过涉及多个步骤的方法获得的、包含已经非常低浓度的act的c1-inh制剂中耗尽了act。
[0099]
实施例3
[0100]
起始材料
[0101]
使用在berinert工艺中获得的产品，一种通过疏水相互作用色谱(hic)获得的高
度纯化的c1-inh浓缩物，类似于feussner等人(doi:10.1111/trf.12678)所述(批号20181219-hw)，储存在-20℃。该材料在4℃下对10mm tris、32mm as ph7.2透析过夜，然后进行阴离子交换色谱实验，比较具有不同盐浓度的洗脱缓冲液1，如下表b-1所示。
[0102]
表b-1：使用不同缓冲液1的实验
[0103][0104]
物质和设备
[0105]
物质:
[0106]
通过milli-q获得的去离子水
[0107]
设备:
[0108][0109]
表b-2:柱负载
[0110][0111]1:1od＝2.76mg/ml蛋白；
[0112]2:体积＝用于加载到柱上的体积,也称为“柱负载”[0113]3:总蛋白＝加载的总蛋白量
[0114][0115]
表b-3:程序
[0116]
泵a1和缓冲液平衡缓冲液
泵a2洗涤缓冲液泵a3,a4,a6不同的洗脱缓冲液1泵b1洗脱缓冲液2泵a52m nacl泵s1柱负载
[0117]
表b-4:程序的实例
[0118]
步骤体积入口流速(cm/h；ml/min)出口平衡5cva1150；1.2废物样品施加241mls1130；1.0废物洗涤5cva2130；1.0废物洗脱15cva3150；1.2出口2洗脱25cvb1150；1.2出口3再生5cva5130；1.0废物
[0119]
产量的计算基于各自柱负载a-c(见上表b-1)的体积和洗脱液1和2的体积(分别为23.5ml)。
[0120]
分析
[0121]
通过sds-page分析来自“柱负载”(l)、“洗脱物1”(e1)和“洗脱物2”(e2)的样品。相应的sds-page凝胶如图4所示。来自“柱负载”和“洗脱物2”的样品在质量控制实验室中额外测试了c1-inh活性。
[0122]
比较的结果总结在图5所示的图表中，显示了在相应洗脱物2中回收的c1-inh的产率与以百分比表示的纯度的比较。据此，nacl浓度范围为175-190mm nacl，优选175-185mm nacl，最优选180mm nacl的洗脱缓冲液1最适合最大程度地消除act，而c1-inh制剂中没有c1-inh的实质性损失。这对应于洗脱缓冲液1的电导率为25℃下18.7至20.2ms/cm，优选25℃下18.9至19.8ms/cm，最优选25℃下19.2ms/cm。洗脱缓冲液2需要足够高以洗脱所有仍结合在阴离子交换色谱柱上的c1-inh，并且需要高于25℃下21.6ms/cm。洗脱缓冲液2的一个示例是由10mm tris、1m nacl、ph7.2组成的缓冲液组合物。
[0123]
图6显示，使用170mm nacl的洗脱缓冲液1(25℃下18.7ms/cm)时，act已经有所降低，但最终产品中act仍为起始量的49％，而使用175mm nacl(25℃下18.9ms/cm)的洗脱缓冲液1时，最终产品中act的量仅为起始量的17％。这说明了为获得c1-inh的最大产率和act的最低产率，对洗脱缓冲液1的离子强度/电导率的微调是多么重要。
[0124]
以上结合具体实施例对本发明进行了说明。这些实施例决不是为了限制本发明，而是用于说明本发明的工作方式。