用于增殖性疾病的组合治疗的制作方法

1.本发明涉及药物组合物或组合产品，包含某些噻唑与某些蛋白激酶抑制剂、特别是磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶抑制剂(pi3k)的组合。本发明还涉及所述药物组合物或组合产品用于治疗或预防增殖性疾病例如癌症如乳腺癌或淋巴癌的用途。本发明还涉及在患者中治疗或预防增殖性疾病的方法，包括向患者施用本发明的药物组合物或组合产品。


背景技术：

2.基底样乳腺癌(blbc)占所有乳腺癌的约15％，是该疾病的与不良预后相关的一种侵袭性分子亚型。大多数blbc是三阴性的(缺乏雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2的表达)，因此对目前可用的靶向治疗没有反应。
3.白血病占所有人类恶性肿瘤的约8％。根据细胞谱系和临床表现，人类白血病可分为四个亚组。急性白血病、急性髓性白血病(aml)和急性淋巴性白血病(all)与侵袭性且通常致命(除非立即治疗)的疾病相关。两者都在幼儿中最为普遍。由于缓慢发作，慢性白血病、慢性粒细胞白血病(cml)和慢性淋巴性白血病(cll)最常见于老年群体中。
4.急性淋巴性白血病(all)占所有白血病病例的12％，并且占儿童中所有白血病病例的80％。大多数all患者不会表现出可鉴定的遗传或环境原因。然而，基因突变、遗传联系和暴露于致癌因素被认为是最突出的危险因素。在all中，被称为母细胞的早期造血细胞在骨髓中积聚。这也反映在all的临床表现上，其特征是骨髓不能发挥其正常功能而导致贫血和白细胞减少。
5.因此，需要用于治疗这些癌症的新分子靶标。
6.本发明人设计了一种新的组合治疗，其靶向一般性的增殖性疾病，特别是乳腺癌和淋巴癌。
7.本发明取决于某些噻唑化合物与某些pi3k抑制剂的组合。本发明人惊奇地发现，这两种化合物的组合导致发生协同作用的组合治疗。特别地，该组合已显示协同地降低乳腺癌和淋巴癌细胞活力。


技术实现要素：

8.因此，从一个方面来看，本发明提供了一种药物组合物，包含：
9.(a)式(i)的化合物：
10.11.其中x是o或s，优选o；
12.r6是h、c
1-6
烷基、-(ch2)
p
cooh、-(ch2)
p
cooc
1-6
烷基、-(ch2)
p
conh2、-(ch2)
p
conhc
1-6
烷基、和-(ch2)
p
con(c
1-6
烷基)2；
13.r
11
是h或c
1-6
烷基；
14.每个r5是-oc
1-10
烷基、-sc
1-10
烷基、-c
1-12
烷基、或oar2；
15.其中ar2是苯基，任选地取代有一个或多个卤素；
16.每个p为0至3；
17.每个z为1至2；
18.或其药学上可接受的盐、或水合物或溶剂合物；和
19.(b)式(x)的化合物
[0020][0021]
式(xi)的化合物
[0022][0023]
或通式(xii)的化合物
[0024][0025]
其中r1是c
1-4
烷基，例如me或et；
[0026]
r2是h或卤素；
[0027]
r3是n或ch；和
[0028]
r4是h或卤素；
[0029]
或式(x)至(xii)中任一个的药学上可接受的盐、或其水合物或溶剂合物。
[0030]
优选的式(xii)的化合物是下式的那些：
[0031][0032]
或其药学上可接受的盐，或水合物或溶剂合物。
[0033]
从另一方面来看，本发明提供了一种用于同时、顺序或分开使用的组合产品，包含：
[0034]
(a)式(i)的化合物：
[0035][0036]
其中x是o或s，优选o；
[0037]
r6是h、c
1-6
烷基、-(ch2)
p
cooh、-(ch2)
p
cooc
1-6
烷基、-(ch2)
p
conh2、-(ch2)
p
conhc
1-6
烷基、和-(ch2)
p
con(c
1-6
烷基)2；
[0038]r11
是h或c
1-6
烷基；
[0039]
每个r5是-oc
1-10
烷基、-sc
1-10
烷基、-c
1-12
烷基、或oar2；
[0040]
其中ar2是苯基，任选地取代有一个或多个卤素；
[0041]
每个p为0至3；
[0042]
每个z为1至2；
[0043]
或药学上可接受的盐、或水合物或溶剂合物；和
[0044]
(b)式(x)的化合物
[0045][0046]
式(xi)的化合物
[0047][0048]
或通式(xii)的化合物
[0049][0050]
其中r1是c
1-4
烷基，例如me或et；
[0051]
r2是h或卤素；
[0052]
r3是n或ch；和
[0053]
r4是h或卤素；
[0054]
或式(x)至(xii)中任一个的药学上可接受的盐、或其水合物或溶剂合物。
[0055]
从另一方面来看，本发明提供了一种用于同时、顺序或分开使用的药物药盒组合物，包含：包含如本文所限定的化合物(i)和药学上可接受的稀释剂或载体的第一组合物，以及包含如本文所限定的化合物(x)至(xii)和药学上可接受的稀释剂或载体的第二组合物。
[0056]
特别地，本发明涉及如前文所限定的药物组合物、组合产品或药盒，其中式(i)的化合物是：
[0057][0058]
或药学上可接受的盐、或水合物或溶剂合物；和
[0059]
如上文所限定的式(x)至(xii)的化合物或其药学上可接受的盐、或水合物或溶剂合物。
[0060]
从另一方面来看，本发明提供了如上文所限定的药物组合物或组合产品用于在治疗或预防增殖性疾病例如癌症，尤其是乳腺癌或淋巴癌中使用。
[0061]
从另一方面来看，本发明提供了一种在有此需要的患者中治疗或预防增殖性病症例如癌症，尤其是乳腺癌或淋巴癌的方法，包括向所述患者(优选人)施用有效量的如上文所限定的药物组合物或组合产品。
[0062]
从另一方面来看，本发明提供了一种在有此需要的患者中治疗(例如减轻症状)或预防增殖性疾病例如癌症，尤其是乳腺癌或淋巴癌的方法，包括向所述患者(优选人)施用有效量的式(i)的化合物，并且同时、分开或顺序地向所述患者施用如上文所限定的式(x)至(xii)的化合物。在顺序施用中，任一种化合物都可以先施用。
[0063]
从另一方面来看，本发明提供了一种在有此需要的患者中治疗(例如减轻症状)或预防增殖性疾病例如癌症，尤其是乳腺癌或淋巴癌的方法，包括：
[0064]
(i)分别鉴定已接受如上文所限定的式(i)的化合物或式(x)至(xii)的化合物的患者；
[0065]
(ii)向所述患者施用有效量的如上文所限定的式(x)至(xii)的化合物或式(i)的化合物，使得所述患者施用有式(i)的化合物和式(x)至(xii)的化合物二者。
[0066]
从另一方面来看，本发明提供了如上文所限定的组合物或组合产品在制备用于治疗或预防增殖性疾病例如癌症、尤其是乳腺癌或淋巴癌的药物中的用途。
[0067]
从另一方面来看，本发明提供了一种用于制备如上文所限定的组合物的方法，包括在至少一种药物赋形剂的存在下混合式(i)的化合物和式(x)至(xii)的化合物。
[0068]
定义
[0069]
术语卤素(hal)在本文中是指卤化物，例如cl或f。
[0070]
在可能的情况下，本发明的化合物(即式(i)至(v)或式(x)至(xv)的那些)可以以盐、水合物或溶剂合物的形式、尤其是盐的形式施用，或者可以以非盐形式施用。
[0071]
本发明涉及以下二者：药物组合物，其中化合物(i)和(x)至(xii)以单一组合物混
合在一起，以及组合产品如药盒，其中将活性化合物提供在分开的组合物中并且被设计用于同时、分开或顺序施用。用于治疗或预防如本文所限定的增殖性疾病的任何方法包括同时、分开或顺序施用活性成分或施用本发明的组合物。
[0072]
根据本发明的“组合”是指在一个剂量单位形式中的固定组合，或用于组合施用的成套部件，其中式(i)的化合物和其组合伙伴式(x)至(xii)(也称为“组合伙伴”或“治疗剂”)可以在同时独立地施用或在时间间隔内分开施用，尤其是在这些时间间隔允许组合伙伴显示合作且优选地协同作用的情况下。
[0073]
如本文所用，“组合产品”是指适合药用的产品，其由多于一种活性成分的混合或组合产生并且包括活性成分的固定组合和非固定组合二者。术语“固定组合”或“固定剂量”是指活性成分例如式(i)的化合物与它的组合伙伴(式(x)至(xii)的化合物)二者以单一实体或剂量的形式同时施用于患者。术语“非固定组合”是指活性成分例如式(i)的化合物与组合伙伴(式(x)至(xii)的化合物)二者作为分开的实体以同时、同步或顺序之一施用于患者，而没有特定的时间限制，其中这样的施用在有此需要的温血动物体内提供治疗有效水平的两种化合物。
[0074]
以下关于本发明优选化合物的所有讨论同样适用于本发明的这些方面。
[0075]
发明详述
[0076]
本发明涉及式(i)的化合物和式(x)至(xii)的化合物的组合治疗。我们已经惊奇地发现这种组合治疗产生协同作用。我们的结果证明了乳腺癌细胞或淋巴癌细胞活力的降低，药物组合物或组合产品提供比单独使用单个化合物所预期的更大程度的降低，即化合物的组合产生的整体效果大于单个元素的总和。
[0077]
增殖性疾病
[0078]
本发明涉及用于增殖性疾病的新组合治疗。优选地，本发明的组合物用于治疗增殖性疾病，所述增殖性疾病选自良性或恶性肿瘤，脑、肾、肝脏、肾上腺、膀胱、乳腺、淋巴系统、胃、胃肿瘤、卵巢、结肠、直肠、前列腺、胰腺、肺、阴道或甲状腺的恶性上皮肿癌，肉瘤，胶质母细胞瘤，多发性骨髓瘤，白血病或胃肠道癌。
[0079]
如果增殖性疾病是乳腺癌或淋巴癌，例如慢性淋巴性白血病或急性淋巴性白血病，则尤其优选。本发明的组合物或组合产品可以特异性靶向转移性乳腺腺癌或急性淋巴性白血病。
[0080]
化合物a
[0081]
本发明取决于式(i)的化合物和式(x)至(xii)的化合物的治疗组合。式(i)的化合物是
[0082]
[0083]
其中x是o或s，优选o；
[0084]
r6是h、c
1-6
烷基、-(ch2)
p
cooh、-(ch2)
p
cooc
1-6
烷基、-(ch2)
p
conh2、-(ch2)
p
conhc
1-6
烷基、-(ch2)
p
con(c
1-6
烷基)2；
[0085]r11
是h或c
1-6
烷基；
[0086]
每个r5是-oc
1-10
烷基、-sc
1-10
烷基、-c
1-12
烷基、或oar2；
[0087]
其中ar2是苯基，任选地取代有一个或多个卤素；
[0088]
每个p为0至3；
[0089]
每个z为1至2；
[0090]
或其药学上可接受的盐、或水合物或溶剂合物。
[0091]
如果x是o，则是优选的。
[0092]
如果r6是-cooc
1-6
烷基，或-conhc
1-6
烷基，例如-cooc
1-2
烷基，或-conhc
1-2
烷基，则是优选的。
[0093]
如果r
11
是h或甲基，则是优选的，优选h。
[0094]
如果z是1，则是优选的。如果p是0，则是优选的。
[0095]
如果r5基团在环上的对位，则是优选的。
[0096]
如果r5是-oc
4-10
烷基、-sc
4-10
烷基、-c
4-10
烷基或oar2，则是优选的；
[0097]
其中ar2是苯基，任选地取代有一个卤素。halo是指卤素，并且优选为cl或f，尤其是f。
[0098]
更优选地，式(i)的化合物具有式(ii)：
[0099][0100]
其中x是o或s；
[0101]
r6是h、c
1-6
烷基、-(ch2)
p
cooh、-(ch2)
p
cooc
1-6
烷基、-(ch2)
p
conh2、-(ch2)
p
conhc
1-6
烷基、-(ch2)
p
con(c
1-6
烷基)2、
[0102]r11
是h或c
1-6
烷基；
[0103]
r5是-oc
1-10
烷基、-sc
1-10
烷基、-c
1-12
烷基、或oar2；
[0104]
ar2是苯基，任选地取代有一个或多个卤素；
[0105]
每个p为0至3；
[0106]
或其盐。
[0107]
本发明更优选的式(i)的化合物是式(iii)的那些化合物：
[0108][0109]
r6是-(ch2)
p
cooc
1-6
烷基、或-(ch2)
p
conhc
1-6
烷基；
[0110]r11
是h或甲基；
[0111]
r5是-oc
1-10
烷基、-sc
1-10
烷基、-c
1-12
烷基、或oar2；
[0112]
ar2是苯基，任选地取代有一个卤素；
[0113]
每个p为0至3；
[0114]
或其盐。
[0115]
本发明更优选的式(i)的化合物是式(iv)的那些化合物：
[0116][0117]
r6是-cooc
1-6
烷基、或-conhc
1-6
烷基；
[0118]r11
是h或甲基；
[0119]
r5是-oc
1-10
烷基、-sc
1-10
烷基、-c
1-12
烷基、或oar2；
[0120]
ar2是苯基，任选地取代有一个卤素；
[0121]
或其盐。
[0122]
本发明更优选的式(i)的化合物是式(v)的那些化合物：
[0123]
r6是-cooc
1-2
烷基；
[0124]r11
是h或甲基；
[0125]
r5是-oc
4-10
烷基、-sc
4-10
烷基、-c
4-12
烷基、或oar2；
[0126]
ar2是苯基，任选地取代有一个卤素；
[0127]
或其盐。
[0128]
本发明更优选的式(i)的化合物是式(vi)的那些化合物：
[0129]
r6是-cooch3；
[0130]r11
是h或甲基；
[0131]
r5是-oc
5-8
烷基或-sc
5-8
烷基；
[0132]
或其盐。
[0133]
优选的化合物是：
[0134][0135][0136]
或其盐。
[0137]
特别优选的化合物是：
[0138][0139]
或其盐。
[0140]
化合物b
[0141]
本发明的组合物或组合产品的第二组分是如上文所定义的式(x)至(xii)的化合物。
[0142]
在通式(xii)的化合物中：
[0143][0144]
如果r2或r4之一是h并且另一个是卤素例如f或cl，则是优选的。如果r4是h并且r2是卤素，则是优选的。
[0145]
如果r1是甲基或乙基，则是优选的。
[0146]
因此，在一个优选的实施方案中，本发明提供了式(xii)的结构，其中：
[0147]
r1是me或et；
[0148]
r2是卤素；
[0149]
r3是n或ch；并且
[0150]
r4是h。
[0151]
优选的选项是：
[0152][0153]
或acalisib(式xv)。
[0154]
在进一步的实施方案中，可以使用pilaralisib。在最优选的实施方案中，化合物是：
[0155][0156]
或其盐。
[0157]
因此，在最优选的实施方案中，本发明涉及药物组合物或组合产品，其包含上文限定的化合物1至4中的一种或多种和buparlisib，尤其是化合物2和buparlisib。
[0158]
在可能的情况下，本发明的化合物(即式(i)至(v)或式(x)至(xii)的那些)可以以
盐、水合物或溶剂合物形式，尤其是盐形式施用。
[0159]
通常，可通过使用所需的酸容易地制备药学上可接受的盐。盐可以从溶液中沉淀并通过过滤收集或可以通过蒸发溶剂来回收。例如，可以将酸如盐酸的水性溶液添加到式(x)至(xii)的化合物的水性悬浮液中，并将所得混合物蒸发至干(冻干)以获得作为固体的酸加成盐。或者，可以将式(x)至(xii)的化合物溶解在合适的溶剂(例如醇，如异丙醇)中，并且可以将酸添加在相同溶剂或另一种合适的溶剂中。所得酸加成盐然后可以直接沉淀，或通过添加极性较小的溶剂如二异丙醚或己烷来沉淀，并通过过滤分离。
[0160]
合适的加成盐由形成无毒盐的无机酸或有机酸形成，并且实例是盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、葡萄糖酸盐、琥珀酸盐、丙酮酸盐、草酸盐、草酰乙酸盐、三氟乙酸盐、糖酸盐、苯甲酸盐、烷基或芳基磺酸盐(例如甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐)和羟乙基磺酸盐。代表性实例包括三氟乙酸盐和甲酸盐，例如双或三三氟乙酸盐和单或二甲酸盐，特别是三或双三氟乙酸盐和单甲酸盐。
[0161]
式(i)的化合物可以使用已知的化学合成路线制备。wo2014/118195和wo2011/039563以及其中引用的参考文献中概述了合成方法。
[0162]
用于制备式(x)至(xii)的化合物的合成方法描述于文献中。这些化合物是可商购的。
[0163]
本发明的组合物或组合产品中式(i)的化合物与式(x)至(xii)的化合物的重量比将由预期用途、受试者的年龄和一般健康以及技术人员已知的其它因素指导。例如，适合于某些应用的特定重量比可为10至90重量％至90至10重量％，例如30至70重量％至70至30重量％。
[0164]
更优选地，每种化合物的量以摩尔数确定，并且每种化合物的比率为5∶1至1∶5摩尔，例如2∶1至1∶2摩尔。通常，对于某些应用，这些化合物以等摩尔量使用。
[0165]
组合物中本发明化合物的量通常由医师根据所需剂量确定。
[0166]
本发明的组合物或组合产品主要被提议用于治疗或预防增殖性疾病例如癌症。
[0167]
治疗性或治疗是指以下中的至少一种：
[0168]
(i).抑制疾病，即阻止、降低或延迟疾病的发展或其复发或其至少一种临床或亚临床症状，或
[0169]
(ii).缓解或减轻疾病的一种或多种临床或亚临床症状。
[0170]
预防是指(i)预防或延迟在哺乳动物中发展的疾病的临床症状的出现。
[0171]
对待治疗受试者的益处是统计学显著的或对患者或医生而言是至少可察觉的。一般而言，技术人员可以理解“治疗”何时发生。如果本发明的组合物或组合产品被治疗性使用，即治疗已表现出的病症，而不是预防性使用，则是特别优选的。可能的是本发明的组合物或组合产品在治疗性使用时比预防性使用更有效。
[0172]
本发明的组合物或组合产品可用于任何动物受试者，特别是哺乳动物，更特别是人，或用作疾病模型的动物(例如，小鼠、猴等)。
[0173]
为了治疗疾病，需要向患者施用有效量的活性组合物或组合产品。“治疗有效量”是指当施用于动物以治疗状态、障碍或病症时，足以实现这种治疗的组合物或组合产品的量。“治疗有效量”将根据组合物或组合产品、疾病及其严重程度以及待治疗的受试者的年
龄、体重、身体状况和反应性而变化，并且最终由主治医生决定。
[0174]
可能的是，为根据本发明治疗癌症，本发明的组合物或组合产品需要以某间隔重新施用。合适的剂量方案可以由医生开处方。
[0175]
本发明的组合物或组合产品通常包含与至少一种药学上可接受的载体混合的活性成分，所述载体根据预期的施用途径和标准的药学实践选择。
[0176]
术语“载体”是指与活性化合物一起施用的稀释剂、赋形剂和/或溶媒。本发明的药物组合物可包含多于一种载体的组合。这样的药物载体是本领域公知的。药物组合物还可包含任何合适的粘合剂、润滑剂、助悬剂、包衣剂和/或增溶剂等。组合物还可以包含其它活性组分，例如治疗癌症的其它药物。
[0177]
应当理解，根据本发明使用的药物组合物或组合产品可以是口服、肠胃外、经皮、舌下、局部、植入、鼻、或肠内施用(或其它粘膜施用)的混悬剂、胶囊剂或片剂的形式，其可以使用一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂以常规方式配制。本发明的组合物也可以配制成纳米颗粒制剂。
[0178]
然而，为了治疗癌症，本发明的组合物或组合产品将优选口服施用或通过肠胃外或静脉内施用，例如注射。因此，组合物或组合产品可以以片剂或注射溶液的形式提供。
[0179]
本发明的药物组合物或组合产品可包含每体积0.01至99重量％的活性材料。治疗剂量通常在约10至2000mg/天之间，优选在约30至1500mg/天之间。可以使用其它范围，包括例如50-500mg/天、50-300mg/天、100-200mg/天。
[0180]
施用可以每天一次、每天两次或更频繁，并且可以在疾病或病症的维持阶段期间减少，例如每两天或每三天一次，而不是每天一次或每天两次。剂量和施用频率取决于临床体征，其证实缓解期的维持，本领域技术人员已知的急性期的至少一种或更优选地多于一种的临床体征的减少或不存在。
[0181]
将本文所述的组合产品施用于已经暴露于、正在暴露于或将暴露于一种或多种抗增殖性化合物(特别是已知用于许多抗癌疗法的那些)的受试者。非限制性实例包括芳香酶抑制剂、抗雌激素、拓扑异构酶i或ii抑制剂、微管活性化合物、烷基化化合物、组蛋白脱乙酰酶抑制剂和环氧合酶抑制剂，例如wo2006/122806和其中引用的参考文献中公开的那些。是否将本发明的组合产品与一种或多种上述抗癌疗法组合的选择将由本领域技术人员已知的公认参数指导，包括所治疗的癌症的特定类型、受试者的年龄和健康状况等。
[0182]
下面参考以下非限制性实施例和附图进一步描述本发明。图1显示了bkm120(μm)和化合物2(μm)的组合处理。条形表示三个生物学重复的平均相对活力
±
sd。在图1中，组合中使用的0.5μm bkm120(buparlisib)对应于10％的预期抑制，ctrl＝对照处理，设置为100％活力。*＝p＜0.05，**＝p＜0.01，***＝p＜0.001，
◆
＝p＜0.0001。
实施例
[0183]
实施例中使用了以下化合物：
[0184][0185]
化合物b：
[0186][0187]
方法
[0188]
细胞培养
[0189]
mda-mb-436细胞系来自atcc。mda-mb-436细胞系从患有转移性乳腺癌的患者的胸腔积液建立。该细胞系是三阴性乳腺癌，但mda-mb-436细胞系被归类为间充质干细胞样，具有高度富集的基因用于生物过程，例如细胞运动(rho途径)、细胞分化和生长途径(alk)途径、tgf-β信号途径和wnt/β-catenin途径)。
[0190]
将mda-mb-436细胞维持在补充有10％fbs、0.3mg/ml l-谷氨酰胺和0.1mg/ml庆大霉素、10mcg/ml胰岛素的rpmi-1640培养基中，并在37℃湿润气氛中孵育。在t75 cm2培养瓶中，每3-4天使用0.5％胰蛋白酶-edta进行传代培养，细胞密度为2-3百万个细胞，以确保活跃增殖细胞。
[0191]
ccrf-cem(atcc ccl-119)细胞系来源于患有急性白血病的儿童的外周血t淋巴母细胞。根据供应商的建议培养细胞。向培养基rpmi-1640补充10μl/ml谷氨酰胺、2μl/ml庆大霉素和10％胎牛血清(fbs)，以制成完全生长培养基(cgm)。将细胞在37℃下在具有5％co2的湿润气氛中培养。每2-4天进行传代，以保持细胞密度低于2.5
×
106个细胞/ml，从而确保持续增殖。允许细胞在建立后适应两周，然后用于实验目的，并且在三个月后丢弃。
[0192]
刃天青(resazurin)活力测定
[0193]
将mda-mb-436细胞以1x104个细胞/孔接种。培养24小时后，当细胞为约30-50％汇合时，将培养基更换为不含庆大霉素的无血清生长培养基，以确保细胞同步并增加细胞对治疗的敏感性。mda-mb-436细胞在具有胰岛素的饥饿培养基中饥饿。用含有或不含化合物2nvp-bkm120(cayman chemicals，us)的新鲜无血清培养基替换培养基。在根据制造商的说明(rnd systems，uk)添加刃天青之前，在显微镜下观察细胞以评估可能的形态变化和应激
迹象。mda-mb-436细胞孵育72小时。
[0194]
ccrf-cem细胞在实验前72小时以4.0
×
105个细胞/ml接种，以确保细胞积极增殖。将细胞在80μl中在10％fbs或0.5％fbs中以5
×
104个细胞/孔接种在96孔板中。最外面的孔用培养基而不是细胞填充以避免可能的边缘效应。在用抑制剂处理之前，将细胞孵育1小时以使其沉降。通过将抑制剂在二甲亚砜(dmso)中稀释来制备抑制剂的工作储备液。抑制剂的最终浓度通过添加培养基来制备。处理和对照中dmso的浓度标准化至0.2％。在添加刃天青之前，将细胞用抑制剂处理24、28或72小时。
[0195]
刃天青代谢1-2小时(37℃，5％co2)，然后在544nm激发波长和590nm发射波长(biotek synergy ht)下读取荧光。实验以每种处理8个孔的系列进行并重复2-3次。
[0196]
组合测定
[0197]
为了确定协同作用，我们评估了组合治疗的效果是否显著大于每种单一疗法的效果。使用welch的方差分析和tamhane的t2校正来确定处理之间的统计学显著性，以进行多重比较，p＜0.05被认为是统计学显著的。
[0198]
对于ccrf-cem实验，还包括bliss independence以计算所研究组合的组合指数(ci)。组合指数使用以下计算：
[0199][0200]
其中ci是组合指数，ea代表作为单一疗法给予的药物a的效果，eb代表作为单一疗法给予的药物b的效果，并且e
ab
代表以与单一疗法相同的浓度组合给予的药物a和b。ci小于1表示协同作用，ci大于1表示拮抗作用，而ci为1表示累加作用。
[0201]
实施例1
[0202]
对pi3k抑制剂和cpla2α抑制剂化合物2获得剂量依赖性抑制
[0203]
已经证明pi3k和cpla2α抑制剂均有效降低blbc/tnbc中的细胞增殖。在用pi3k抑制剂和化合物2的共处理实验之前，进行了mda-mb-436细胞中同工型特异性pi3k抑制剂和选择性cpla2α抑制剂的剂量反应。
[0204]
化合物2在27μm范围内表现出剂量反应关系，并且ic50值为10.4μm(表1)。与设置为100％活力的未处理对照相比，用9μm及更高处理的细胞的活力显著降低。活力突然下降，标准偏差在ic50值附近很高。bkm120的斜率在等效范围内仅略有下降。pi3k抑制剂比化合物2更有效，ic50为1.2μm(表1)。
[0205]
表1：pan pi3k抑制剂bkm120和cpla2α抑制剂化合物2对blbc/tnbc细胞系mda-mb-436的计算的ic50值(72小时处理，n＝3)
[0206][0207]
实施例2
[0208]
基于最初的实验，确定了共处理实验中cpla2α抑制剂和pi3k抑制剂的次优剂量。对于bkm120，mda-mb-436细胞系中化合物2的次优剂量为5.0μm、6.5μm、7.5μm和0.4μm。
[0209]
在处理后72小时研究mda-mb-436细胞在组合实验中的增殖作用。化合物2与bkm120的组合在所有测试剂量中均显示出协同作用，并且当两种抑制剂组合时观察到抑制作用的约两倍变化(表2)。当5μm化合物2与0.4μm bkm120组合时，观察到额外的25
±
5％抑制。此外，在组合实验中，较高剂量的化合物2(6.5μm)与0.4μm bkm120的组合显示出42
±
10％的额外效果和在最高剂量化合物2(7.5μm)时的45
±
2％。
[0210]
表2：在用次优剂量的pan-pi3k抑制剂bkm120和cpla2α抑制剂化合物2单独和组合处理后72小时后mda-mb-436细胞的活力。以相对于设置为100％的未处理对照的百分比测量活力。p-值****＜0.0001
[0211][0212][0213]
讨论
[0214]
pi3k抑制剂如bkm120(pan-pi3k抑制剂)与cpla2α抑制剂化合物2的共处理可协同作用地降低mda-mb-436细胞中的细胞活力。当化合物2与任一pi3k抑制剂bkm120组合时获得对癌细胞活力的协同作用的观察表明共处理策略对高度侵袭性乳腺癌例如blbc/tnbc可
以是降低细胞活力和降低耐药性的有效处理策略。
[0215]
实施例3
[0216]
将化合物2和bkm120用于ccrf-cem细胞系。基于对化合物2和bkm120的已确定的剂量和时间依赖性，在具有理想血清浓度的培养基中进行了许多组合实验。每种化合物的次优剂量(通常对应于10-20％的活力抑制)用于研究可能的协同作用。
[0217]
在表3中，对于低剂量bkm120和化合物2的选定组合以相应组合指数(ci)，抑制表现为通过刃天青测定法确定的活力降低。
[0218]
当在表3中评估ci时，低剂量bkm120和化合物2的所有测试组合都表明协同作用，因为ci值都小于1。如图1所示，该组合的活力降低相对于单独0.6μm bkm120是统计学显著的。此外，所有组合处理相对于对照处理(p＜0.001)以及相对于作为单一治疗的低剂量bkm120均具有统计学显著性。
[0219]
表3：以平均值
±
sd表示的bkm120和化合物2之间组合的总抑制以及相应的组合指数(ci)
[0220]
bkm120(μm)化合物2(μm)总抑制(％)ci0.50.1621.8
±
6.80.740.50.2026.4
±
4.90.800.50.2437.5
±
7.20.620.60.1221.7
±
11.10.780.60.1622.7
±
13.10.750.60.2030.3
±
9.40.66