一种荧光微球偶联抗体的方法及其应用与流程

1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种荧光微球偶联抗体的方法及其应用。


背景技术：

2.荧光免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术。该技术以固定有检测线(包被抗体或包被抗原)和质控线(抗抗体)的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光标记抗体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。
3.对于带有多个抗原决定簇的大分子抗原(蛋白、病毒、致病菌等)，通常采用“三明治”型双抗夹心免疫层析方法，即待测物在流动相作用下先与荧光标记抗体结合，当到达检测线时再与包被抗体结合形成双抗夹心的“三明治”型。目前，荧光免疫层析技术中荧光微球与抗体的偶联办法多需要经过多次离心和超声反应，提高微球与待标记抗原抗体的充分混匀及碰撞概率，避免微球形成块状物，降低微球在反应过程中的聚集而导致的反应不均一性，从而保证偶联效率和偶联强度，从而导致荧光免疫层析技术的偶联工序过于繁杂，造成了偶联时间长、生产效率低下的局面。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种荧光微球偶联抗体的方法，能够在省略多次离心和超声的基础上，提高荧光微球偶联抗体的偶联效率和偶联强度，偶联工艺简单、耗时短，易于生产放大应用。
5.为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
6.本发明提供了一种荧光微球偶联抗体的方法，所述方法包括如下步骤：
7.经活化的荧光微球与抗体溶液在振荡条件下进行偶联反应，得到偶联反应液；
8.将偶联反应液依次与第一封闭液和第二封闭液混合进行封闭，经离心、终洗、重悬后即得偶联抗体的荧光微球。
9.优选的，所述活化采用的活化液为1-10mg/ml的edc
·
hcl溶液；所述活化液与荧光微球的体积比为1-4:1-4。
10.优选的，所述抗体溶液为抗体经mes缓冲液稀释所得；所述抗体溶液的浓度为0.1-0.5mg/ml。
11.优选的，所述振荡的温度为20-30℃，所述振荡的转速为500-1000rpm。
12.优选的，所述第一封闭液为质量百分数为10％-40％的吐温20溶液；所述第二封闭液为含有牛血清白蛋白、甘氨酸、吐温20的tris-hcl缓冲溶液，ph为7.0-9.0。
13.优选的，所述离心的参数为：转速12000-15000rpm、温度4-10℃、时间10-20min。
14.优选的，所述终洗缓冲液为含有牛血清白蛋白、吐温20的tris-hcl缓冲溶液，ph为7.0-9.0。
15.优选的，所述重悬的试剂为含有牛血清白蛋白、吐温20、海藻糖、柠檬酸三钠的
tris-hcl缓冲溶液，ph为7.0-9.0。
16.本发明提供了上述的方法制备得到的偶联抗体的荧光微球。
17.本发明还提供了上述的方法或上述偶联抗体的荧光微球在制备荧光免疫层析试剂盒中的应用。
18.本发明的有益效果：
19.本发明提供了一种荧光微球偶联抗体的方法，通过连续进行活化、偶联和封闭，经过终洗和重悬后得到偶联抗体的荧光微球。本发明所提供的偶联方法摆脱了传统偶联工艺繁琐的离心换液流程和超声分散步骤，精简了偶联工艺，节省了偶联时间，提高了生产效率。同时，将本发明所述工艺得到的偶联有抗体的荧光微球应用于pct检测后可知，最低检出限为0.04ng/ml，变异系数不超过15％，相对偏差在
±
15％以内，即利用本发明偶联方法得到的荧光微球的偶联效率高，降低了检测的检出限，精密度好、准确度高、工艺稳定性好，适宜大批量生产。
具体实施方式
20.本发明提供了一种荧光微球偶联抗体的方法，所述方法包括如下步骤：
21.经活化的荧光微球与抗体溶液在振荡条件下进行偶联反应，得到偶联反应液；
22.将偶联反应液依次与第一封闭液和第二封闭液混合进行封闭，经离心、终洗、重悬后即得偶联抗体的荧光微球。
23.本发明中，所述荧光微球优选为纳米荧光微球，所述荧光微球的粒径优选为0.1-0.2μm。本发明中，所述活化的步骤优选的包括：将活化液与荧光微球混合后振荡活化。所述活化液优选为edc
·
hcl溶液；所述edc
·
hcl溶液的浓度优选为1-10mg/ml，更优选为4-8mg/ml。本发明中，所述活化液与所述荧光微球的体积比为优选为1-4:1-4，更优选为1:1。所述活化的时间优选为15-30min，更优选为18-25min。
24.本发明中，所述抗体溶液优选为抗体经mes缓冲液稀释所得；所述mes缓冲液的ph优选为6.5-7.0；所述抗体溶液的浓度优选为0.1-0.5mg/ml，更优选为0.2-0.3mg/ml。本发明对所述抗体的种类并没有特殊限定，本发明中所述抗体可选的为鼠源单克隆抗体。本发明中，所述荧光微球与所述抗体溶液的体积比优选为1-4:18-72，更优选为1:18。本发明中，所述振荡的温度优选为20-30℃，更优选为22-25℃；所述振荡的转速优选为500-1000rpm，更优选为800-900rpm。本发明对所述振荡的设备并没有特殊限定，在本发明的具体实施例中，所述振荡的设备优选为恒温振荡器。本发明中，所述偶联反应的时间优选为2-5h，更优选为3h。
25.本发明中，所述第一封闭液优选为吐温20溶液；所述吐温20溶液的质量百分数优选为10％-40％，更优选为20％-30％。所述第二封闭液优选为含有牛血清白蛋白、甘氨酸、吐温20的tris-hcl缓冲溶液；所述tris-hcl缓冲溶液的ph优选为7.0-9.0，更优选为7.5-8.5。本发明所述第二封闭液中，所述牛血清白蛋白的质量百分数优选为0.5％-5％，更优选为1％-2％；所述甘氨酸的质量百分数优选为1
‰‑5‰
，更优选为2
‰‑3‰
；所述吐温20的质量百分数优选为0.1
‰‑1‰
，更优选为0.4
‰‑
0.6
‰
。本发明中，所述第一封闭液和第二封闭液的封闭时间均优选为15-30min，更优选为20-25min。
26.本发明中，所述离心的转速优选为12000-15000rpm，更优选为13000-14000rpm；所
述离心的温度优选为4-10℃，更优选为6-8℃；所述离心的时间优选为10-20min，更优选为15-18min。
27.本发明中，将离心得到的沉淀与终洗缓冲液混合进行终洗。所述终洗缓冲液优选为含有牛血清白蛋白、吐温20的tris-hcl缓冲溶液；所述tris-hcl缓冲溶液的ph优选为7.0-9.0，更优选为7.5-8.5。本发明的终洗缓冲液中，所述牛血清白蛋白的质量百分数优选为0.5％-5％，更优选为1％-2％；所述吐温20的质量百分数优选为0.1
‰‑1‰
，更优选为0.4
‰‑
0.6
‰
。
28.本发明将终洗后的混合液经离心所得沉淀进行重悬。所述重悬的试剂优选为含有牛血清白蛋白、吐温20、海藻糖、柠檬酸三钠的tris-hcl缓冲溶液；所述tris-hcl缓冲溶液的ph优选为7.0-9.0，更优选为7.5-8.5。本发明所述重悬的试剂中，所述牛血清白蛋白的质量百分数优选为0.5
‰‑5‰
，更优选为1
‰‑3‰
；所述吐温20的质量百分数优选为0.1
‰‑1‰
，更优选为0.4
‰‑
0.6
‰
；所述海藻糖的质量百分数优选为5％-15％，更优选为8％-12％；所述柠檬酸三钠的质量百分数优选为0.5
‰‑5‰
，更优选为1
‰‑3‰
。
29.本发明提供了上述的方法制备得到的偶联抗体的荧光微球。
30.本发明还提供了上述的方法或所述偶联抗体的荧光微球在制备荧光免疫层析试剂盒中的应用。
31.本发明实施例中，所述荧光微球采用金属铕元素螯合物与苯乙烯单体共聚得到，生产厂家为bangs laboratories。
32.本发明中，所用原料、试剂与设备均为已知产品，采用常规市售产品即可。
33.为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
34.实施例1
35.荧光微球偶联pct抗体的方法：
36.(1)荧光微球活化：依次向反应容器中加入50μl浓度50mm、ph6.8的mes缓冲液溶解的4mg/ml的edc
·
hcl活化液，50μl荧光微球，混合均匀后置于20℃的恒温振荡器中，500rpm的条件下活化15min，得到经活化的荧光微球；
37.(2)荧光微球偶联：将步骤(1)中经活化的荧光微球与900μl的pct抗体溶液混合均匀，然后置于20℃恒温振荡器中偶联3h，得到偶联反应液；
38.(3)封闭：向步骤(2)的偶联反应液中加入20μl的40％吐温20溶液，混合均匀后置于恒温振荡器中封闭15min；完成后继续向溶液中添加400μl的第二封闭液，其中第二封闭液为含有牛血清白蛋白、甘氨酸、吐温20的ph为7.0的tris-hcl缓冲溶液，混合均匀后置于20℃恒温振荡器中封闭15min；
39.(4)离心：将步骤(3)封闭后的混合液以12000rpm转速，4℃下离心10min，收集离心后所得沉淀；
40.(5)终洗：向步骤(4)离心所得沉淀中加入1000μl终洗缓冲液，其中，终洗缓冲液为含有牛血清白蛋白、吐温20的ph为8.0的tris-hcl缓冲溶液，重悬混匀后离心10min，收集沉淀；
41.(6)重悬：向步骤(5)离心处理后所得的沉淀中加入1000μl含有牛血清白蛋白、吐温20、海藻糖、柠檬酸三钠的ph为7.0的tris-hcl缓冲溶液，重悬后即得所述偶联pct抗体的
荧光微球，置于2-8℃保存备用。
42.实施例2
43.荧光微球偶联兔单克隆抗体(rabmabs)的方法：
44.(1)荧光微球活化：依次向反应容器中加入100μl浓度10mm、ph7.4的pb缓冲液溶解的8mg/ml的edc
·
hcl活化液，100μl荧光微球，混合均匀后置于20℃的恒温振荡器中，500rpm的条件下活化15min，得到经活化的荧光微球；
45.(2)荧光微球偶联：将步骤(1)中经活化的荧光微球与1800μl的兔igg抗体溶液混合均匀，然后置于20℃恒温振荡器中偶联3h，得到偶联反应液；
46.(3)封闭：向步骤(2)的偶联反应液中加入40μl的40％吐温20溶液，混合均匀后置于恒温振荡器中封闭15min；完成后继续向溶液中添加800μl的第二封闭液，其中第二封闭液为含有牛血清白蛋白、甘氨酸、吐温20的ph9.0的tris-hcl缓冲溶液，混合均匀后置于20℃恒温振荡器中封闭15min；
47.(4)离心：将步骤(3)封闭后的混合液以15000rpm转速，10℃下离心20min，收集离心后所得沉淀；
48.(5)终洗：向步骤(4)离心所得沉淀中加入2000μl终洗缓冲液，其中，终洗缓冲液为含有牛血清白蛋白、吐温20的ph8.0的tris-hcl缓冲溶液，重悬混匀后离心10min，收集沉淀；
49.(6)重悬：向步骤(5)离心处理后所得的沉淀中加入2000μl含有牛血清白蛋白、吐温20、海藻糖、柠檬酸三钠的ph为7.0的tris-hcl缓冲溶液，重悬后即得所述偶联rabmabs抗体的荧光微球，置于2-8℃保存备用。
50.实施例3
51.将实施例1获得的偶联pct抗体的荧光微球与实施例2得到的偶联rabmabs抗体的荧光微球喷洒到玻璃纤维上，烘干后制得结合垫，然后与试纸条的其他常规组分一起组装得到干式免疫荧光层析试纸条，用于pct的检测，测试结果如下：
52.1.线性范围
53.检测方法：分别使用浓度为0.05ng/ml、0.15ng/ml、4.89ng/ml、11.28ng/ml、22.34ng/ml、40.92ng/ml的pct血清样本进行检测，每个样本检测三次，分别求出检测结果的均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以检测结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按下述公式计算线性回归的相关系数(r)：
[0054][0055]
式中：
[0056]
xi为测定样本的理论浓度；
[0057]
yi为与测定样本相对应的实际测量值；
[0058]
i为1，2，3，
……
，n。计算结果如下表1所示。
[0059]
表1检测结果
[0060][0061]
由表1可以得出，利用由本发明所述方法得到的偶联抗体的荧光微球组成的试纸条检测pct的线性范围为0.05ng/ml～40ng/ml，线性相关系数r≥0.990。
[0062]
2.最低检出限
[0063]
检测方法：吸取100μl样本，垂直滴加至检测卡加样处，开始计时，15分钟后，将检测卡轻轻插入仪器检测孔，按下检测键，仪器会自动检测，出具定量检测结果。同时用灭活新生牛血清作为空白样本。重复检测20次，得出20次检测结果，计算其平均值(m)和标准差(sd)，根据下述公式计算得到检出限，结果如表2所示。
[0064]
最低检出限＝m 2sd；
[0065]
式中，m为20次测量结果的平均值；sd为20次测量结果的标准差。
[0066]
表2检测结果
[0067][0068]
由表2可以得出，利用由本发明所述方法得到的偶联抗体的荧光微球组成的试纸条检测pct的最低检出限小于或等于0.04ng/ml。
[0069]
3.精密度
[0070]
检测方法：分别使用0.15ng/ml和22.34ng/ml的pct血清样本重复检测10次，计算测量值的平均值m和标准差sd。按公式计算变异系数cv。式中：cv为变异系数；sd为10次测量结果的标准差；m为10次测量结果的平均值，结果如表3所示。
[0071]
表3检测结果
[0072][0073]
由表3可以得出，试剂盒的cv不大于15％。
[0074]
4.准确度
[0075]
检测方法：用0.15ng/ml和22.34ng/ml的pct血清样本进行测试，重复测定3次，取平均值，计算其相对偏差，结果如表4。
[0076]
表4检测结果
[0077][0078][0079]
由表4可以得出，试剂盒的准确度相对偏差在
±
15％以内。
[0080]
5.稳定性
[0081]
试剂盒在4-30℃保存18个月后，分别对试剂盒的线性范围、最低检出限，精密度，准确度进行检测。
[0082]
(1)线性范围
[0083]
检测方法：分别使用浓度为0.05ng/ml、0.15ng/ml、4.89ng/ml、11.28ng/ml、22.34ng/ml、40.92ng/ml的pct血清样本进行检测，每个样本检测三次，分别求出检测结果的均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以检测结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按下述公式计算线性回归的相关系数(r)：
[0084][0085]
式中：
[0086]
xi为测定样本的理论浓度；
[0087]
yi为与测定样本相对应的实际测量值；
[0088]
i为1，2，3，
……
，n。计算结果如下表5所示。
[0089]
表5检测结果
[0090][0091]
由表5可以得出，试纸条4-30℃放置18个月后，检测pct的线性范围为0.05ng/ml～40ng/ml，线性相关系数r≥0.990。
[0092]
(2)最低检出限
[0093]
检测方法：吸取100μl样本，垂直滴加至检测卡加样处，开始计时，15分钟后，将检测卡轻轻插入仪器检测孔，按下检测键，仪器会自动检测，出具定量检测结果。同时用灭活新生牛血清作为空白样本。重复检测20次，得出20次检测结果，计算其平均值(m)和标准差(sd)，根据下述公式计算得到检出限，结果如表6所示。
[0094]
最低检出限＝m 2sd；
[0095]
式中，m为20次测量结果的平均值；sd为20次测量结果的标准差。
[0096]
表6检测结果
[0097][0098]
由表6可以得出，试纸条4-30℃放置18个月后，检测pct的最低检出限小于或等于0.04ng/ml。
[0099]
(3)精密度
[0100]
检测方法：分别使用0.15ng/ml和22.34ng/ml的pct血清样本重复检测10次，计算
测量值的平均值m和标准差sd。按公式计算变异系数cv。式中：cv为变异系数；sd为10次测量结果的标准差；m为10次测量结果的平均值，结果如表7。
[0101]
表7检测结果
[0102][0103][0104]
由表7可以得出，试纸条4-30℃放置18个月后，变异系数cv不大于15％。
[0105]
(4)准确度
[0106]
检测方法：用0.15ng/ml和22.34ng/ml的pct血清样本进行测试，重复测定3次，取平均值，计算其相对偏差，结果见表8。
[0107]
表8检测结果
[0108][0109]
由表8可以得出，试纸条4-30℃放置18个月后，准确度相对偏差在
±
15％以内。
[0110]
由此可知，在4-30℃保存18个月后，试纸条的性能还满足线性范围，最低检出限，精密度，准确度参数，具有良好的稳定性。
[0111]
由以上实施例可知，本发明所提供的偶联方法摆脱了传统偶联工艺繁琐的离心换液流程和超声分散步骤，精简了偶联工艺，节省了偶联时间。利用本发明所述方法得到的偶联有抗体的荧光微球组成试纸条后用于pct检测，其最低检出限为0.04ng/ml，变异系数不超过15％，相对偏差在
±
15％以内，在4-30℃保存18个月后，试纸条的性能还满足线性范围、最低检出限、精密度、准确度参数，具有良好的稳定性。即利用本发明偶联方法得到的荧光微球的偶联效率高，降低了免疫检测的检出限，精密度好、准确度高、工艺稳定性好，适宜大批量生产。
[0112]
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。