一种基于金属纳米酶材料和温敏性凝胶的组合材料及其构建方法与流程

1.本发明涉及复合材料技术领域，具体领域为一种基于金属纳米酶材料和温敏性凝胶的组合材料及其构建方法。


背景技术：

2.目前，金属纳米酶(如铁基纳米酶，锰基纳米酶等)已经逐步成为一个跨学科，越来越受到重视的材料，如在锰基纳米酶是以锰为活性中心并具有天然酶活性的纳米材料。二价的mn离子除了在光合作用中起到了重要作用之外，在水解和磷酸转移酶中也至关重要。此外更高价的锰是核糖核苷酸还原酶、过氧化氢酶、过氧化物酶和线粒体中超氧化物歧化酶(sod)的氧化还原中心。2016年，研究人员发现八面体氧化锰纳米材料具有类超氧化物歧化酶的性质，他们将该性质与磁共振成像技术相结合，以此达到利用氧化锰提高核磁共振对比度的目的。这是由于在肿瘤组织部位sod的含量降低而超氧阴离子的含量升高，而磁共振成像对比度与超氧阴离子的浓度有关，超氧阴离子浓度越低其对比效果越好。当氧化锰与超氧自由基接触时它的迟豫时间将得到很大的提高。最近研究结果表示，枝状四氧化三锰纳米颗粒由于具有较大的孔径，其同时具有类超氧化物歧化酶和类过氧化氢酶的活性，且活性依赖于尺寸大小和形貌，其对超氧阴离子的消除率可超过百分之五十，从细胞层面对帕金森症进行有效的保护。
3.不过一直以来，模拟酶应用到生物机体的体内研究进展较为缓慢，究其原因也发现，模拟酶尽管具有较好的氧化酶活性，过氧化氢酶活性，但是其也存在生物相容性问题，同时也存在给药途径的问题。迄今为止，尚未见报道较为成熟的模拟酶制剂的制备，现有模拟酶更多的给药方式非常不规范，基本都是采用纯化水等进行分散后直接递送，这种方式导致模拟酶在目标作用部位停留时间及短，无法有效发挥作用。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种基于金属纳米酶材料和温敏性凝胶的组合材料及其构建方法以解决上述背景技术中提到的技术问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于金属纳米酶材料和温敏性凝胶的组合材料，其组成成分包括金属纳米酶和温敏性凝胶，金属纳米酶和温敏性凝胶混合比例为1～10μg:1ml。
6.一种基于金属纳米酶材料和温敏性凝胶的组合材料构建方法，其构建方法包括如下步骤：
7.步骤1：制备金属纳米酶材料
8.采用金属化合物，溶解于无水乙醇中，磁力搅拌至完全溶解，将混合物转入聚四氟乙烯反应釜中，在温度100～120℃条件下反应24h，然后冷却至室温，加水洗涤后，得终产物；
9.步骤2：制备聚乳酸温敏性凝胶
10.将反应釜预热温度设定为80～120℃，在惰性气体保护下加入peg，待peg受热熔化，降低温度至常温，在惰性气体正压保护下加入交联催化剂，然后加入d,l-丙交酯，在惰性气体保护条件下，设定反应釜温度为150～180℃，连续合成6～12h，合成完成后，在反应釜夹套中通入冷循环水，将液体物料温度降低至常温，在洗涤罐中加入适量纯化水，将液体物料倒入其中，强力搅拌进行溶解，静置，去除上清液，取出固体聚乳酸聚合物至不锈钢容器中，配置pbs缓冲液，控制溶液温度低于常温，将聚乳酸聚合物投入pbs缓冲液中搅拌溶解，冷冻干燥后备用；
11.步骤3：构建组合材料
12.将步骤1和步骤2制备的产物进行混合，旋涡，混合比例为1～10μg:1ml，将混合产物进行冻干或采用预灌封注射器灌装。
13.优选的，步骤1中，醋酸锰和无水乙醇的比例为：1.2～1.5g：60～100ml。
14.优选的，步骤2中，peg分子量为1500～2500，peg、d,l-丙交酯和交联催化剂的比例1:2:0.009。
15.优选的，一种基于金属纳米酶材料和温敏性凝胶的组合材料使用方式为采用纯化水配置使用。
16.本发明的有益效果是：
17.(1)本发明提供的复合材料具有稳定的耐热和耐寒性能，冻干产物具有良好的水溶性，温敏性凝胶属于高分子水凝胶，其在低温下为液态，高温时凝聚，这种状态的变化随温度可逆，同时具有聚合材料的多种特征，如网络结构和高含水量，将金属纳米酶材料与温敏性凝胶进行组合，可使酶在目标作用部位更长时间的停留，以发挥更大的作用。
18.(2)本发明提供的复合材料能够在使用前，分为预灌封水针或冻干制剂，预灌封水针可直接加装针头进行灌肠，灌胃等；冻干制剂按照冻干前比例溶解后直接使用，方便快捷。
19.(3)本发明提供的复合材料，金属基模拟酶的抗氧化酶活性，过氧化氢酶活性与单纯模拟酶相比活性不降低。
20.(4)本发明提供的复合材料，其相变温度可以通过控制嵌段的分子量来进行控制，复合材料在复合后，与单纯温敏性凝胶相比，相变温度无明显变化，既能实现温敏性凝胶的相变特性，又能兼顾金属基模拟酶的酶活性。
附图说明
21.图1为本发明实施例中锰基纳米酶电子扫描显微镜照片；
22.图2为本发明实施例中模拟酶和复合材料超氧化物酶活性对比图；
23.图3为本发明实施例中模拟酶和复合材料过氧化氢酶活性对比图；
24.图4为本发明实施例中空白对照肠组织病理切片；
25.图5为本发明实施例中单纯锰基纳米酶干预后肠组织病理切片；
26.图6为本发明实施例中单纯温敏凝胶干预后肠组织病理切片；
27.图7为本发明实施例中复合材料干预后肠组织病理切片。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.实施例：
30.金属基模拟酶选用锰基模拟酶，包括以下步骤：
31.步骤1：准确称取1.225gmn(ch3coo)2·
4h2o溶解于60ml无水乙醇中，磁力搅拌至完全溶解，将混合物转入聚四氟乙烯反应釜中，在120℃条件下反应24h，产物冷却到室温后，加水洗涤三次，得终产物；
32.步骤2：取反应釜预热温度设定为120℃，在惰性气体保护下加入peg，待peg受热熔化，降低温度到常温，在惰性气体正压保护下加入交联催化剂，然后加入d,l-丙交酯，在惰性气体保护条件下，设定反应釜温度为150℃，连续合成12h，在合成完成后，在反应釜夹套中通入冷却水循环，将液体的物料温度降低至常温，在洗涤罐中加入适量纯化水，将液体的物料放置其中强力搅拌进行溶解，静置，去除上清液，取出固体物至不锈钢容器中，配置好pbs缓冲液，控制溶液温度低于常温，将聚乳酸聚合物投入pbs缓冲液中搅拌溶解，进行冷冻干燥后备用，其中peg分子量为peg1500～2500，peg：d,l-丙交酯：交联催化剂质量比为1:2:0.009；
33.pbs缓冲液：磷酸氢二钠5g 磷酸二氢钠0.3g 聚乳酸聚合物100g 纯化水600ml。
34.步骤3：将步骤1和步骤2制备的产物进行混合，旋涡，混合比例为10μg:1ml，将混合产物进行冻干。
35.上述方法制备的锰基纳米酶复合材料具有稳定耐热耐寒及水溶性，通过高分辨率扫描电子显微镜可看出锰基纳米材料的微观结构，如图1中两幅图所示，呈现多面体。
36.对实施例1中合成的锰基纳米酶和纳米酶复合材料分别进行超氧自由基清除能力测试和过氧化氢的清除能力测试：
37.(1)超氧自由基清除能力测试：按下表加入试剂，迅速混匀，在35℃水浴下反应，以空白作对照在320nm波长下,每间隔0.5min置石英比色皿内测一次a值,连续记录a值至反应达平衡。
38.试剂空白自氧化mn3o4plgplg-mn3o450mm ph8.2 tris－hcl缓冲液(ml)4.54.54.54.54.545mm邻苯三酚(μl) 10101010蒸馏水(μl)2010
ꢀꢀꢀ
1mg/ml mn3o4(μl)
ꢀꢀ
10
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39.(2)过氧化氢的清除能力
40.按下表加入试剂，迅速混匀，37℃水浴中反应，于240nm波长处每间隔0.5min置石英比色皿内测一次a值,连续记录a值至反应达平衡。(操作时需重新确认反应体系的样品量)
[0041][0042][0043]
超氧自由基清除能力测试见图2，过氧化氢的清除能力见图3。通过对复合前后两种材料对比发现，超氧自由基清除能力测试中，单纯锰基模拟酶超氧自由基清除能力测试反应时，其速度更快，复合后材料后其反应速度更慢，说明温敏凝胶可以减慢模拟酶与底物反应的速度，随着反应时间延长，反应的程度趋于一致。过氧化氢的清除能力测试中，单纯锰基模拟酶和模拟酶复合材料其反应趋势和反应速度趋于一致，反应程度趋于一致。这也表明，通过这种复合，模拟酶自身的酶活性并未降低。单纯模拟酶和模拟酶复合材料其酶活性趋于一致。
[0044]
为表现锰基模拟酶和模拟酶复合材料的应用，设计小鼠肠炎模型，分别用单纯模拟酶和复合材料进行灌肠治疗。
[0045]
实验分组信息
[0046]
[0047]
分组信息见上表，每组12只小鼠，适应性养殖三天，正常喂食饲料，煮沸后放冷饮用水，然后第1组继续自由饮用煮沸后放冷饮用水，2-4组更换为4％葡聚糖硫酸钠(dss)浓度的饮用水，正常饲喂，逐日观察，5-7天左右可观察到小鼠血便等情况。在第7天，各组(包括第一组)随机处死两只小鼠，确认肠炎模型的成模情况。每组给药按照表1中方案进行灌肠给药，连续三次，间隔一天。给药后，第二天每组处死小鼠解剖取材，组织固定于4％多聚甲醛中待he染色镜检。再连续养殖7天后，处死各组剩余小鼠，解剖，拍照，取材。为避免个体差异导致小鼠死亡，另取5只小鼠单独一笼同步进行dss喂水造模，若其他组中存在死亡则进行补充。
[0048]
最后对小鼠直肠组织进行取材，固定于4％多聚甲醛中，按照he染色进行病理诊断并进行累计打分。打分结果见下表，评分越高，病情越严重。
[0049]
病理诊断评分数据
[0050]
组别组名炎症病理评分病理诊断总体评分1阴性002阳性17413氧化锰模拟酶9184温敏性凝胶材料12225温敏性氧化锰模拟酶复合材料814
[0051]
病理切片见图4-图7。通过病理数据显示，温敏性氧化锰模拟酶复合材料对于小鼠急性肠炎的干预中，无论炎症病理评分还是病理诊断总体评分，均为最小。能够较好说明使用复合材料后，模拟酶在动物体内能够较好发挥作用，清除活性氧(ros)。确保目标炎性部位的恢复。在病理切片中，可以观察到，阳性组肠道损伤较大，阴性组肠道损伤基本无，单纯氧化锰组和单纯温敏凝胶组对肠炎的恢复均有一定作用，而复合材料的病理切片显示，其对于肠道的肠炎干预效果均好于单纯两种材料。
[0052]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。