一种生物组织材料及其制备方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种生物组织材料及其制备方法。


背景技术：

2.目前，临床上常用的生物组织(如生物瓣膜、生物补片等所用的动物源性胶原纤维组织材料)通常使用化学试剂(如戊二醛和/或甲醛贮存)进行交联固定处理。生物组织一般保存在包含戊二醛和/或甲醛的稀释水溶液中，使生物组织的成分可以保持无菌环境和水合状态。然而，大量的研究证明生物组织假体在植入后，残留的戊二醛会促使瓣膜的钙化，而且戊二醛具有较高的毒性，即使很低的残留量也会在人体产生毒性，不利于内皮化的形成。因此，用戊二醛处理和保存的生物组织假体在植入前必须经过多次大量的清洗以去除戊二醛。但是，在植入生物组织材料或其制备的生物组织假体时，手术前医疗人员应当尽量减少医疗器械暴露在外的准备工作，因为使用“易得即用”的生物组织和生物组织假体不仅可以降低染菌或误差机率，也可以减少生物组织假体的植入时间。
3.将生物材料开发成为脱离戊二醛溶液保存的干燥状态，可以较好解决上述问题。脱细胞生物组织材料具有低免疫源性、完整的纤维结构和良好的机械强度，常用的脱细胞方法主要有物理法、酶消化法、酸碱法及化学去垢剂法等。然而，大量研究表明，以上几种方法存在很多问题，例如脱细胞不足导致免疫反应或脱细胞过度导致胶原结构破坏；生物材料植入体内后，生物组织表面磷脂对脂蛋白和钙结合蛋白的吸附可能导致钙化，钙化会导致生物材料硬化或者降解。
4.因此，开发一种抗免疫、抗钙化的干态生物组织材料及其制备方法不仅有广阔的发展前景也具有重要的实际应用价值。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种可以抗免疫及抗钙化的干态生物组织材料及其制备方法。
6.为了解决上述问题，本发明提供一种干态生物组织材料的制备方法，
7.包括以下步骤：
8.步骤1：获取经过交联剂交联处理过的生物组织材料；
9.步骤2：采用脱细胞溶液对所述生物组织材料进行脱细胞处理，所述脱细胞溶液包括浓度逐渐增大的第一脱细胞溶液至第n脱细胞溶液，其中，n大于等于2，且为正整数；
10.步骤3：采用溶解溶液对所述生物组织材料进行第一次抗钙化处理，所述溶解溶液用于溶解生物组织磷脂类杂质；
11.步骤4：采用去除溶液对所述生物组织材料进行第二次抗钙化处理，所述去除溶液用于去除交联和脱细胞过程中醛基的氧化产物羧基；
12.步骤5：采用还原溶液对所述生物组织材料进行第三次抗钙化处理，所述还原溶液用于保护游离醛基；
13.步骤6：采用脱水溶液对所述生物组织材料进行脱水处理，所述脱水溶液包括浓度逐渐增大的第一脱水溶液至第m脱水溶液，其中，所述第m脱水溶液的浓度小于第n脱细胞溶液的浓度，其中，m大于等于2，且为正整数，以获得干态生物组织材料。
14.可选的，所述交联剂为醛类交联剂，所述醛类交联剂包括戊二醛、甲醛、乙二醛。
15.可选的，步骤2具体包括：
16.配置脱细胞溶液，所述脱细胞溶液为单元醇或多元醇水溶液；
17.将所述生物组织材料按照顺序依次置于所述第一脱细胞溶液至第n脱细胞溶液中，且分别放置至少1小时，以对所述生物组织材料进行脱细胞处理；
18.清洗经过脱细胞处理的所述生物组织材料。
19.进一步的，将所述生物组织材料按照顺序依次置于所述第一脱细胞溶液至第n脱细胞溶液中，且分别放置至少1小时，以对所述生物组织材料进行脱细胞处理包括：
20.当所述脱细胞溶液包括第一脱细胞溶液和第二脱细胞溶液，且所述第一脱细胞溶液的浓度为50％～70％，所述第二脱细胞溶液的浓度为70％～100％时，先将所述生物组织材料置于所述第一脱细胞溶液中至少1小时，再将所述生物组织材料置于所述第二脱细胞溶液中至少1小时；或者，
21.当所述脱细胞溶液包括第一脱细胞溶液、第二脱细胞溶液和第三脱细胞溶液，且所述第一脱细胞溶液的浓度为50％～60％，所述第二脱细胞溶液的浓度为60％～80％，所述第三脱细胞溶液的浓度为80％～100％时，先将所述生物组织材料置于所述第一脱细胞溶液中至少1小时，再将所述生物组织材料置于所述第二脱细胞溶液中至少1小时，最后将所述生物组织材料置于所述第三脱细胞溶液中至少1小时。
22.可选的，步骤3具体包括：
23.配制浓度为1％～100％的溶解溶液，所述溶解溶液为甲醇、乙醇、氯仿和乙醚中至少一种，且所述溶解溶液的ph值为5.0～9.0；
24.将所述生物组织材料置于所述溶解溶液中，在0℃～50℃下，放置1小时～72小时，以对所述生物组织材料进行第一次抗钙化处理；
25.清洗经过第一次抗钙化处理的所述生物组织材料。
26.可选的，步骤4具体包括：
27.配制浓度为0.01％-50％的去除溶液，所述去除溶液为碳酸钠、碳酸氢钠、1，1，2—三甲丙基硼烷、二异丁基氢化铝、硼烷和硼氢化钠中至少一种，且所述去除溶液的ph值为5.0～9.0；
28.将所述生物组织材料置于所述去除溶液中，在-100℃～50℃下，放置1小时～72小时，以对所述生物组织材料进行第二次抗钙化处理；
29.清洗经过第二次抗钙化处理的所述生物组织材料。
30.可选的，步骤5具体包括：
31.配置浓度为0.01％～50％的还原溶液，所述还原溶液为偏磷酸盐、氨基酸、3-二甲基氨基丙基和氨基醇中至少一种，且所述还原溶液的ph值为5.0～9.0；
32.将所述生物组织材料置于所述还原溶液中，在0℃～50℃下，放置1小时～72小时，以对所述生物组织材料进行第三次抗钙化处理；
33.清洗经过第三次抗钙化处理的所述生物组织材料。
34.可选的，步骤6具体包括：
35.配置脱水溶液，所述脱水溶液为丙酮、乙醇、甘油、正丁醇和叔丁醇中一种或多种混合物；
36.将所述生物组织材料按照顺序依次置于所述第一脱水溶液至第m脱水溶液中，在0℃～50℃下，放置1小时～120小时，以对所述生物组织材料进行脱水处理。
37.可选的，在步骤6之后还包括：
38.对所述干态生物组织材料进行无氧包装和灭菌处理，其中，灭菌处理的方式包括eo灭菌或辐照灭菌。
39.可选的，所述干态生物组织材料用于制造干态瓣膜。
40.与现有技术相比，本发明至少具有以下技术效果：
41.1、本发明通过三次抗钙化处理，达到溶解磷脂、去除羧酸、保护醛基的目的，具有完整的抗钙化工艺，从而达到高抗钙化性能；
42.2、本发明通过对所述干态生物组织材料进行无氧包装和灭菌，来进一步降低生物组织材料钙化风险；并通过所述第m脱水溶液的浓度小于第n脱细胞溶液的浓度保证生物组织胶原结构完整性；所述脱细胞溶液包括浓度逐渐增大的第一脱细胞溶液至第n脱细胞溶液，可以有效脱去免疫毒性物质；
43.3、本发明干态生物组织材料的脱细胞效果好，具备低免疫性能，生物组织材料的完整性好，生物组织材料的力学性能良好；干燥状态的生物组织材料的存储、运输、使用方便，降低了染菌或误差机率。
附图说明
44.图1为本发明实施例一和对比例一至五所获得的牛心包样品分别在大鼠皮下植入后的钙含量；
45.图2为本发明实施例一的牛心包样品的he染色；
46.图3为本发明对比例七的牛心包样品的he染色。
具体实施方式
47.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
48.另外，以下说明内容的各个实施例分别具有一个或多个技术特征，因此并不意味着使用本发明者必需同时实施任一实施例中的所有技术特征，或仅能分开实施不同实施例中的一部份或全部技术特征。换句话说，在实施为可能的前提下，本领域技术人员可依据本发明的公开内容，并视设计规范或实作需求，选择性地实施任一实施例中部分或全部的技术特征，或者选择性地实施多个实施例中部分或全部的技术特征的组合，借此增加本发明实施时的弹性。
49.本发明实施例提供了一种干态(即干燥状态)生物组织材料的制备方法，包括以下步骤：
50.步骤1：获取经过交联剂交联处理过的生物组织材料；
51.步骤2：采用脱细胞溶液对所述生物组织材料进行脱细胞处理，所述脱细胞溶液包括浓度逐渐增大的第一脱细胞溶液至第n脱细胞溶液，其中，n大于等于2，且为正整数；
52.步骤3：采用溶解溶液对所述生物组织材料进行第一次抗钙化处理，所述溶解溶液用于溶解生物组织磷脂类杂质；
53.步骤4：采用去除溶液对所述生物组织材料进行第二次抗钙化处理，所述去除溶液用于去除交联和脱细胞过程中醛基的氧化产物羧基；
54.步骤5：采用还原溶液对所述生物组织材料进行第三次抗钙化处理，所述还原溶液用于保护游离醛基；
55.步骤6：采用脱水溶液对所述生物组织材料进行脱水处理，所述脱水溶液包括浓度逐渐增大的第一脱水溶液至第m脱水溶液，其中，所述第m脱水溶液的浓度小于第n脱细胞溶液的浓度，其中，m大于等于2，且为正整数，以获得干态生物组织材料。
56.步骤1具体包括：获取经过交联剂交联处理过的生物组织材料，并对所述生物组织材料进行第一次清洗。在本步骤中，所述生物组织材料包括但不限于经过交联剂交联处理。经过交联剂交联处理过的生物组织材料为异种或同种异体生物组织材料，例如心包、心脏瓣膜、覆膜、胸膜、小肠粘膜下层、硬脑膜、硬脊膜、韧带和皮肤，具体例如牛心包。其中，所述交联剂包括戊二醛，所述交联剂还可以包括甲醛、乙二醛等醛类交联剂。第一次清洗可以采用生理盐水、ph值为6.8～8.6(具体例如6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6)的磷酸盐缓冲液或ph值为6.8～8.6的d-hanks溶液(具体例如6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6)，在室温下清洗2次～3次，每遍清洗8分钟～10分钟(具体例如8分钟、9分钟或10分钟)。
57.在本步骤中，经过交联剂戊二醛交联处理后的生物组织材料中存在游离醛基。
58.步骤2具体包括：采用脱细胞溶液对所述生物组织材料进行脱细胞处理，所述脱细胞溶液包括浓度逐渐增大的第一脱细胞溶液至第n脱细胞溶液，其中，n大于等于2，且为正整数，并进行第二次清洗。
59.详细的，首先，配置脱细胞溶液，以洗脱生物组织细胞及细胞间物质，所述脱细胞溶液可以为单元醇或多元醇水溶液等，具体可以为甲醛、乙醇、乙二醇等。所述脱细胞溶液包括至少两种浓度的溶液，详细的，所述脱细胞溶液包括浓度逐渐增大的第一脱细胞溶液至第n脱细胞溶液，以有效脱去免疫毒性物质。其中，n大于等于2，且为正整数。所述脱细胞溶液的浓度为50％～100％，以所述脱细胞溶液包括两种浓度的溶液为例(即n＝2)，第一脱细胞溶液的浓度为50％～70％(具体例如50％、55％、60％、65％、69.9％)，第二脱细胞溶液的浓度为70％～100％(具体例如70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％)；以所述脱细胞溶液包括三种浓度的溶液为例(即n＝3)，第一脱细胞溶液的浓度为50％～60％(具体例如50％、55％、59.9％)，第二脱细胞溶液的浓度为60％～80％(具体例如60.1％、65％、70％、75％、79.9％)，第三脱细胞溶液的浓度为80％～100％(具体例如80.1％、85％、90％、95％、100％)。
60.接着，将生物组织材料按照顺序依次置于第一脱细胞溶液至第n脱细胞溶液中，且分别放置至少1小时，以所述脱细胞溶液包括两种浓度的溶液为例，先将所述生物组织材料置于浓度为50％～70％的所述第一脱细胞溶液中至少1小时，再将所述生物组织材料置于
x-100切割机)切割成大小为50mm*50mm的牛心包样品，并采用生理盐水(例如华仁药业的生理盐水)在室温下清洗牛心包样品，清洗2次～3次，每次10分钟；
84.步骤2：配制三种浓度的乙醇水溶液，乙醇含量分别为50％、75％、90％，在室温下，将牛心包样品由低浓度到高浓度依次浸没在乙醇水溶液中，每种浓度浸没24小时，三种浓度的乙醇水处理完成后，再将牛心包样品浸没在10mm的tris-hci与1mm的edta混合液中，并将ph值调至7.4
±
0.1，温度调至5
±
1℃，浸没5小时，然后再浸没于1％sds溶液中，在室温下，浸没5小时，最后用生理盐水清洗3次，每次5分钟。
85.步骤3：配制乙醇含量为70％的乙醇水溶解溶液，溶解溶液的ph值为7.3～7.5，再将牛心包样品浸没在溶解溶液中，在室温下，浸没48小时，最后用生理盐水清洗3次，每次5分钟。
86.步骤4：称量10g碳酸钠，将其溶解在含有1l pbs的容器中，并将溶液的ph值调至7.3～7.5，以得到去除溶液；再将牛心样品浸没在去除溶液中，在室温下，浸没24小时，最后用生理盐水清洗3次，每次5分钟。
87.步骤5：配制含有1％氨基醇的保护溶液(即还原溶液)，保护溶液的ph值调至7.3～7.5；再将牛心包样品浸没在保护溶液中，在室温下，浸没48小时，最后用生理盐水清洗3次，每次5分钟。
88.步骤6：配制两种浓度的甘油溶液，即分别含甘油60％和80％的脱水溶液；先将牛心包样品浸没于含甘油60％的脱水溶液中，在37℃下，浸没48小时，再将牛心包样品浸没于含有80％甘油的脱水溶液中，在37℃下，浸没48小时。
89.步骤7：用铝箔袋包装牛心包样品，再通过真空包装机(例如为巨仕达，j-vb06真空包装机)抽真空，封装后，进行伽玛射线灭菌。
90.《对比例一》
91.通过实施例一中去掉了步骤3后的制备方法制备干态生物组织材料，并通过测试干态生物组织材料的钙含量来测试抗钙化性能，测试结果如图1。
92.《对比例二》
93.通过实施例一中去掉了步骤4后的制备方法制备干态生物组织材料，并通过测试干态生物组织材料的钙含量来测试抗钙化性能，测试结果如图1。
94.《对比例三》
95.通过实施例一中去掉了步骤5后的制备方法制备干态生物组织材料，并通过测试干态生物组织材料的钙含量来测试抗钙化性能，测试结果如图1。
96.《对比例四》
97.通过实施例一中去掉了步骤3～5后的制备方法制备干态生物组织材料，并通过测试干态生物组织材料的钙含量来测试抗钙化性能，测试结果如图1。
98.《对比例五》
99.通过实施例一中去掉了步骤3～5，同时采用步骤6’替换步骤6后的制备方法制备干态生物组织材料，其中，步骤6’为：将脱水后的牛心包样品放入纸塑袋中，密封，并进行eo灭菌；并通过测试干态生物组织材料的钙含量来测试抗钙化性能，测试结果如图1。
100.《对比例六》
101.通过实施例一中去掉了步骤2后的制备方法制备干态生物组织材料，并通过测试
干态生物组织材料的钙含量来测试抗钙化性能，测试结果如表1。
102.《对比例七》
103.通过实施例一中采用步骤6”替换步骤6后的制备方法制备干态生物组织材料，其中，步骤6”为：配制两种浓度的甘油溶液，即分别含甘油70％的脱水溶液和含甘油95％的脱水溶液，先将牛心包样品浸没于含甘油70％的甘油溶液中，在37℃下，浸没48小时，再浸没于含甘油95％的甘油溶液中，在37℃下，浸没48小时；并通过测试干态生物组织材料的钙含量来测试抗钙化性能，测试结果如表1。
104.由图1可以看到，在将本发明实施例一和对比例一至五所获得的牛心包样品分别进行大鼠皮下植入，并在8周后取出后，通过原子吸收分光光度计分别测量牛心包样品的钙含量的结果显示，经过本发明实施例一的制备方法所获得的牛心包样品的钙含量最低，因此，本发明实施例一的制备方法能够显著提升牛心包样品的抗钙化性能。
105.由表1可以看到，在将本发明实施例一和对比例六及七所获得的干态牛心包样品中，本发明实施例一具备低含水量，力学性能优异的特点，并且本发明实施例一的制备方法还具备抗免疫性能。
106.由图2-3中的牛心包样品的he染色显示，对比例七的制备方法所获得的牛心包样品的胶原结构被破坏，而本发明实施例一的制备方法所获得的牛心包样品的纤维组织走向一致，胶原纤维未被明显破坏。
107.表一
[0108][0109]
虽然本发明披露如上，但并不局限于此。本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。