一种石墨烯量子点掺杂抗菌水凝胶的制备方法与流程

1.本发明体涉及一种石墨烯量子点掺杂抗菌水凝胶的制备方法。


背景技术：

2.近年来，慢性创伤如压疮、糖尿病足、ⅲ度烧伤或烫伤等发病率不断攀升。慢性伤口易继发感染，经久不愈，严重影响患者生活质量；若发生感染扩散，还可能导致脓毒症等并发症，危及患者生命。水凝胶敷料可缩短慢性创面治疗时间，明显减少换药次数，促进伤口愈合。但目前临床上使用的多数水凝胶敷料缺乏智能性，抗感染效果差，开发新型抗菌敷料解决慢性伤口难愈合问题迫在眉睫。
3.纳米技术作为一个新兴的领域，正在被广泛地探索，以期为创面的护理与治疗带来创新的方法。例如gqds在氙灯照射下可以迅速产生热，对细菌的内外膜造成不可逆的损伤，导致细胞质泄漏和死亡，促进感染创面的愈合。并且，gqds对细胞无明显毒性且具有良好的血液相容性。因此在慢性创面修复治疗中引起了极大的关注。但gqds表面带有大量带负电的羧基，使其与表面带负电的细菌结合受到了一定限制。
4.ε-pl是一种天然的光谱抗菌材料，于2003年被fda批准成为安全的食品保鲜剂。聚赖氨酸分子外部含有大量的氨基，所带的正电荷能与细菌表面的负电位点结合以杀死细菌。通过用ε-pl改性gqds制得的小分子抗菌剂(gqds-ε-pl)，可以通过光热和化学联合治疗方法达到良好的抗菌效果。但将gqds-ε-pl作为慢性伤口敷料，虽能抗感染，却对伤口缺乏保护力，无法避免伤口发生二次创伤。
5.抗菌水凝胶是一类性能优于传统敷料的新型敷料，因具有良好的抑菌、保湿、控制和吸收渗出液、避免伤口粘连、减轻伤口疼痛、促进肉芽组织生长、保护伤口等优点，被广泛研究。目前开发的抗菌水凝胶多通过负载银离子等小分子抗菌剂而制得，缺乏智能性，易发生抗菌剂突释，无法达到长效、按需抗菌目的。且受外力破坏后很难自修复，使用寿命短，无法为伤口提供良好的愈合环境。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种石墨烯量子点掺杂、多重响应性自愈合抗菌水凝胶的制备方法。
7.本发明采用的技术方案是：
8.一种石墨烯量子点掺杂抗菌水凝胶的制备方法，所述方法为：先通过水热反应将氧化石墨烯制备成石墨烯量子点(gqds)；然后在存在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)作催化剂的条件下，使用聚赖氨酸(ε-pl)对石墨烯量子点进行改性，获得改性石墨烯量子点(gqds-ε-pl)；最后将改性石墨烯量子点与季氨化壳聚糖(qcs)和四臂聚乙二醇苯甲醛(4arm peg-ba)在水溶液中进行席夫碱反应形成动态亚胺键，交联制得gqds-ε-pl/qcs/4arm peg-ba水凝胶。
9.本发明通过动态共价键构筑自愈合性抗菌水凝胶，使活性抗菌物质动态交联于水
凝胶网络中，可以解决前述问题。亚胺键是一种动态、可逆的共价键，由氨基和醛基基团缩合而成，俗称席夫碱键。它是一种重要的化学键，在受到外力破坏后能够通过水凝胶内部网络中频繁断裂和再生，为其提供自愈合能力，以延长敷料使用寿命。此外，水凝胶在酸性 ph和较高温度下降解较快，具有ph和温度响应性，利于其在细菌感染微酸环境的伤口处加速降解，裸露更多抗菌高分子，以实现根据伤口处细菌感染程度按需抗菌的目的。
10.具体的，所述方法包括如下顺序步骤：
11.(1)将氧化石墨烯溶液、nh3·
h2o和h2o2水溶液加入到反应釜中，在 180～200℃下反应6～8h，后冷却至室温；
12.(2)步骤(1)所得溶液用滤膜过滤以除去石墨烯残渣，旋蒸除掉未反应的氨水，透析除去小粒径gqds得到均一粒径的gqds；
13.(3)步骤(2)所得溶液冷冻干燥得到gqds粉末；
14.(4)将gqds粉末在室温下溶于双蒸水中，配制成0.5～1mg/ml的gqds溶液，调节溶液ph为4～5，加入edc和nhs，避光反应1～2h；
15.(5)往步骤(4)所得溶液加入ε-pl，避光搅拌18～24h，然后调节溶液ph为 7.00，再反应50～60min以终止反应；
16.(6)步骤(5)所得溶液置于透析袋中，室温下透析3d，每隔8h换一次水；
17.(7)步骤(6)所得溶液在-80℃冷冻干燥3d，得到改性石墨烯量子点 (gqds-ε-pl)；
18.(8)步骤(7)所得粉末在室温下溶于双蒸水中，配制成0.1～0.2g/ml的 gqds-ε-pl溶液；
19.(9)将qcs在室温下溶于双蒸水中，配制成0.01～0.05g/ml的qcs溶液；
20.(10)将4arm peg-ba在室温下溶于双蒸水中，配制成0.1～0.2g/ml的4arm peg-ba溶液；
21.(11)将步骤(8)和(9)及(10)中所得溶液按照4arm peg-ba：qcs：gqds-ε-pl 质量比为比为：4.4～6.9：0.88～1.37：0～6.1的比例混合均匀，室温下反应1～20min得湿态抗菌水凝胶；
22.(12)将步骤(11)所得的湿态水凝胶冷冻干燥，得到干态抗菌水凝胶。
23.具体的，步骤(1)中nh3·
h2o在混合溶液中质量浓度为1％～5％，h2o2在混合溶液中质量浓度为1％～5％，反应温度为120℃～200℃，反应时间为2h～24h。
24.优选的，步骤(5)中聚赖氨酸上-nh2与石墨烯量子点上-cooh的官能团摩尔比为1～ 80：1。
25.具体的，步骤(2)中用0.22μm滤膜过滤除去石墨烯残渣，以500d透析袋透析8h除去小粒径gqds。
26.本发明的有益效果主要体现在：本发明所用原料廉价易得，安全无毒，抗菌水凝胶的制备工艺简单，周期短，90s内即可原为成胶，不需要昂贵的仪器；所述水凝胶以水为溶剂，聚赖氨酸改性量子点、季氨化壳聚糖和四臂聚乙二醇苯甲醛为原料，通过席夫碱反应，原为生成动态亚胺键，形成具有网孔结构的智能性水凝胶；该水凝胶可以在受外力破坏后变成溶胶，静置后又回复凝胶状态，具有良好自愈合性，利于延长敷料的使用寿命；制备所得水凝胶具有可注射性和可形变能力，利于对不同形状伤口的封闭；水凝胶中的 gqds-ε-pl赋予其稳定的、反复光热升温能力；此外，水凝胶在酸性ph和较高温度下溶胀率较低、降
gel0，gel1，gel2，gel3，gel4和gel5。图中a,b,c,d,e,f分别代表gel0，gel1，gel2， gel3，gel4和gel5干态水凝胶，对应的4arm peg-ba：qcs：gqds-ε-pl质量比分别为： gel0：6.9：1.37：0，gel1：6.2：1.23：1.7，gel2：5.6：1.12：3.0，gel3：5.2：1.03：4.1， gel4：4.8：0.95：5.1，gel5：4.4：0.88：6.1。由图可知，所有水凝胶均显示出高度多孔和相互连接的网络结构。
50.步骤3)和7)所得的gqds和gqds-ε-pl以及步骤11)所得的gel0和gel1通过氙灯10min照射后的红外热成像图参见图2。由图可知，gqds、gqds-ε-pl、gel0和gel1 经氙灯照射10min后温度分别达到54.1℃、47.1℃、33.4℃和51.6℃；结果表明，因gqds 的存在使得水凝胶具有良好的光热性能。
51.步骤11)所得的gel0和gel1湿态水凝胶的抗菌活性图参见图3，具体实验步骤：将gel0， gel1和gel1 light与e.coli,s.aureus和p.aeruginosa菌悬液共孵育24h，取70μl细菌菌悬液均匀地涂敷到固体培养基上，再次培养24h后观察并记录琼脂板上菌落的生长情况。此外分别吸取100μl的e.coli,s.aureus和p.aeruginosa菌悬液，用紫外分光光度计测试od
600
的值，并计算不同水凝胶对三种细菌的抗菌率。由图可知，gel0中因含有的季氨化壳聚糖而具有一定的抗菌效果；gel1中随着gqds-ε-pl的加入使得抗菌效果明显增强；而gel1经氙灯照射10min后，通过光热和化学联合治疗杀菌率几乎为100％。因此，该水凝胶具有良好的抗菌性能。
52.步骤11)所得的gel0和gel1湿态水凝胶的可注射、自愈合及荧光发光效果图参见图4，具体操作:将溶液状态的gel1注入5ml注射器中,待其成胶。再顺利的注射出来，并可以顺滑的写出单词“1和2”,但在紫外灯照射下可明显看出水凝胶结构破坏严重。12h后观察到水凝胶通过自愈合作用恢复其完整的结构。这一现象充分印证了自愈合水凝胶可以顺利的从注射器中推出，且可通过重新交联完成新的自愈合过程。说明，该水凝胶具有良好的可注射性、自愈合性和荧光发光能力。
53.步骤12)所得的gel0和gel1干态水凝胶浸入不同温度、不同ph的pbs中，其在不同时间间隔的重量剩余率如图5所示，gel0和gel1在不同环境条件下均经历了先溶胀后降解的阶段。在凝胶溶胀阶段中，gel0和gel1在ph＝7.4，25℃下的最大溶胀率分别为： 221.5％和201.9％；在ph＝7.4；37℃下的最大溶胀率分别为：176.1％和230.2％；在ph ＝5.0，37℃下，gel0和gel1不溶胀或只有轻微溶胀。这说明gel0和gel1具有ph和温度依赖的可溶胀性。
54.在水凝胶降解阶段中，gel0和gel1在ph＝7.4，25℃下的最长降解时间分别为：90h 和120h；在ph＝7.4，37℃下的最长降解时间均为48h；在ph＝5.0，37℃下的最长降解时间分别为：12h和24h。两种水凝胶在ph＝5.0比在ph＝7.0下的降解时间快很多，这是因为水凝胶是通过动态亚胺键交联的，具有酸响应性。在同一ph7.4下，温度越低降解速度越慢。这是因为低温使分子热运动减慢，交联网络结合的更稳定。在相同条件下，gel1比gel0完全降解的时间更长，这是因为引入了更多的交联位点使得体系交联更紧密，水凝胶就更稳定。
55.以上所述仅为本发明的制备方法，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。