一种新型抗炎虾青素衍生物的制备方法与流程

1.本发明涉及虾青素技术领域，具体涉及一种新型抗炎虾青素衍生物的制备方法。


背景技术：

2.虾青素(astaxanthin，asta)是一种类胡萝卜素，天然存在两种形式：游离虾青素(free astaxanthin，f-asta)和虾青素衍生物(astaxanthin ester，asta-e)。虾青素分子中的一个β-紫罗兰酮环和一个多不饱和共轭双键，会导致虾青素分子价电子的偏移，大量淬灭活性氧(reactive oxygen species，ros)，赋予虾青素强抗氧化性，因此虾青素是一种出色的活性氧清除剂。然而，在食品加工和存储过程中，游离虾青素在光、热和氧气等环境下极不稳定，从而降低其外观和营养价值。为提高游离虾青素的稳定性可合成得到不同分子结构虾青素衍生物。与f-asta相比，asta-e具有更高的生物利用度、稳定性和更强的抗氧化作用。
3.已知生物体内炎症或癌症部位往往蓄积大量ros而导致氧化应激并产生一系列的细胞和组织损伤，加重炎症反应，刺激生物体促炎细胞因子的产生从而加重炎症的症状。因此，抑制炎症因子的产生对抗炎治疗同样具有重要意义。虾青素可以有效的抑制炎症因子产生，但由于其水溶性差，生物利用度低而降低其功能发挥。
4.基于上述内容，提供一种具有良好抗炎效果、ros响应型的新型抗炎虾青素衍生物具有重大意义。


技术实现要素：

5.基于上述内容，本发明提供一种新型抗炎虾青素衍生物的制备方法。通过虾青素两端的羟基与琥珀酸酐进行酯化反应得到astad，所得astad可改善虾青素的水分散性，并作为中间体，为构建特殊功能虾青素衍生物提供基础。在此基础上，进一步连接ros响应官能团，构建具有ros响应性的虾青素，使其在生物体内有更好的抑制炎症以及抗氧化效果。
6.本发明的技术方案之一，一种新型抗炎虾青素衍生物，以游离虾青素为主体骨架，经琥珀酸酐进行酯化后接枝ros响应官能团得到所述新型抗炎虾青素衍生物。
7.进一步地，所述新型抗炎虾青素衍生物具体为氨基苯硼酸虾青素琥珀酸二酯。
8.本发明是技术方案之二，上述新型抗炎虾青素衍生物的制备方法，包括以下步骤：
9.(1)游离虾青素、琥珀酸酐(丁二酸酐)、催化剂a置于有机溶剂a中混合，氮气氛围下反应得到虾青素琥珀酸二酯(astad)；
10.(2)虾青素琥珀酸二酯和3-氨基苯硼酸、催化剂b置于有机溶剂b中混合，氮气氛围下反应得到所述新型抗炎虾青素衍生物(astad-pba)。
11.具体反应过程如下：
[0012][0013]
进一步地，所述步骤(1)中：
[0014]
游离虾青素为化学合成虾青素或者天然来源的虾青素；
[0015]
所述催化剂a选自n,n-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶、十二烷硫酸和乙基二硫酸中的一种或多种；
[0016]
三乙胺对酸酐进行亲和进攻，可以与酸酐反应生成季铵盐形式的酰胺结构，这个四级胺的结构不稳定，容易被一级胺亲核进攻脱去三乙胺生成酰胺，因此三乙胺起到催化作用。
[0017]
所述有机溶剂a选自二氧六烷、丙酮、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、二甲基亚砜和四氢呋喃中的一种或多种；
[0018]
所述游离虾青素、琥珀酸酐的摩尔比为1：10，所述游离虾青素在有机溶剂a中的浓度为1g/100ml；
[0019]
所述反应条件：20-50℃，6-24h；
[0020]
所述反应结束后还包括依次进行的减压旋蒸至干、有机溶剂a复溶、盐酸洗涤、无水硫酸钠除水、二次减压旋蒸至干、硅胶分离纯化、梯度洗脱步骤。
[0021]
进一步地，所述盐酸溶液浓度1mol/l，所述硅胶分离纯化使用的硅胶为200-300目的正相硅胶，所述梯度洗脱程序为：
[0022][0023]
进一步地，所述步骤(2)中：
[0024]
所述催化剂b选自4-二甲氨基吡啶、n,n-二异丙基乙胺、碳二亚胺盐酸盐的一种或多种；
[0025]
所述有机溶剂b选自二氧六烷、丙酮、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、二甲基亚砜和四氢呋喃中的一种或多种；
[0026]
所述虾青素琥珀酸二酯和3-氨基苯硼酸的摩尔比为4.5:1，所述虾青素琥珀酸二酯在有机溶剂b中的浓度为1g/30ml；
[0027]
所述反应条件：20-30℃，10-24h；
[0028]
所述反应结束后还包括在500da的透析膜中透析48-72h。
[0029]
本发明的技术方案之三，上述新型抗炎虾青素衍生物在抗氧化、抗炎、抗癌产品中的应用，所述产品为药物或保健品。
[0030]
本发明的技术方案之四，上述新型抗炎虾青素衍生物在抗氧化、抗炎、抗癌产品中的应用，所述产品为外敷产品。
[0031]
进一步地，所述抗炎具体为抗溃疡性结肠炎。
[0032]
与现有技术相比，本发明的有益效果：
[0033]
本发明将虾青素与琥珀酸酐进行合成可制得虾青素琥珀酸二酯(astad)，astad作为一种中间体，相比较于游离虾青素极性增大，其暴露的羧基端可用于合成其他高水溶性虾青素衍生物，为扩展虾青素的应用范围、提高虾青素的生物利用度等提供基础。
[0034]
苯硼酸易被过氧化氢氧化，导致碳硼键断裂，生成硼酸和苯酚。因此，本发明将苯硼酸作为ros(活性氧)响应性触发基团，构建具有ros响应性的虾青素，使其在生物体内有更好的抑制炎症效果。
[0035]
本发明以化学合成的游离虾青素或者天然来源的游离虾青素为主体骨架，琥珀酸酐进行酯化后接枝ros响应官能团(3-氨基苯硼酸，pba)制备了一种新型抗炎虾青素衍生物——氨基苯硼酸虾青素琥珀酸二酯(astad-pba)。所制得的astad-pba可极其显著的降低生物体内活性氧含量，减少ros对细胞的损伤，抑制生物体内炎症的发展。目前针对游离虾青素的修饰多以接枝不同种类脂肪酸链构造不同分子结构虾青素酯以提高其稳定性和生物利用度。本发明基于虾青素酯的构建，接枝ros响应官能团，使其在生物体内ros过量产生部位富集，进而使虾青素更好更持续的发挥抗氧化及抗炎功能。
[0036]
本发明通过构建c57bl/6j小鼠溃疡性结肠炎模型验证了新型抗炎虾青素衍生物对小鼠溃疡性结肠炎有显著的改善效果。总之，本发明所构建的新型抗炎虾青素衍生物可用于新型虾青素功能食品或外敷商品(如虾青素饮品、虾青素抗炎精华等)，实现虾青素的高效、稳定应用。
[0037]
本发明所提供的新型抗炎虾青素衍生物适应性更强、稳定性好，合成步骤简单，反应条件温和，工艺简单。
附图说明
[0038]
图1为astad-pba对溃疡性结肠炎c57bl/6j小鼠体重降低的缓解效果图；
[0039]
图2为astad-pba抗溃疡性结肠炎对c57bl/6j小鼠结肠长度改善效果图；
[0040]
图3为astad-pba对溃疡性结肠炎c57bl/6j小鼠结肠部位病理改善效果图；
[0041]
图4为astad-pba对c57bl/6j小鼠肠道菌群的稳态维持效果图。
具体实施方式
[0042]
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0043]
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0044]
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
[0045]
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
[0046]
关于本发明中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
[0047]
本发明以下实施例中，所使用的游离虾青素为市场购买的天然来源虾青素。
[0048]
实施例1
[0049]
ros响应型虾青素酯(astad-pba)的制备：
[0050]
(1)称取游离虾青素(1g)、丁二酸酐(1.9g)、催化剂(三乙胺0.25g)加入到200ml棕色血清瓶中，加入100ml二氧六烷搅拌溶解。
[0051]
(2)向步骤(1)混合填充氮气，并置于恒温培养箱中50℃震荡反应15h。
[0052]
(3)反应结束后，步骤(2)反应混合物减压旋蒸至干，加入200ml二氯甲烷复溶。
[0053]
(4)200ml盐酸溶液(1mol/l)清洗3次。
[0054]
(5)无水硫酸钠除水，减压旋蒸至干得到astad粗产物1.3g。
[0055]
(6)取步骤(5)得到的astad粗产物，二氯甲烷溶解上样，300目正相硅胶分离纯化，梯度洗脱(程序见表1)，得到游离虾青素400mg、虾青素琥珀酸二酯(astad)600mg、虾青素琥珀酸单酯300mg。
[0056]
(7)将纯化后的虾青素琥珀酸二酯(0.5g)、3-氨基苯硼酸(0.39g)、催化剂(n,n-二异丙基乙胺0.20g)加入到50ml棕色血清瓶中，加入30ml二氯甲烷搅拌溶解，体系充入氮气后30℃反应20h。
[0057]
(8)将反应后的反应混合物置于500da透析膜中透析48h后得到ros响应型虾青素酯300mg，溶于甲醇。
[0058]
表1
[0059][0060]
实施例2
[0061]
ros响应型虾青素酯(astad-pba)的制备：
[0062]
同实施例1，区别在于步骤(7)使用0.30g碳二亚胺盐酸盐作为催化剂，体系充入氮气后30℃反应16h。最终得到ros响应型虾青素酯315mg。
[0063]
实施例3
[0064]
ros响应型虾青素酯(astad-pba)的制备：
[0065]
同实施例1，区别在于步骤(7)使用催化剂(4-二甲氨基吡啶0.15g、碳二亚胺盐酸盐0.15g)，体系充入氮气后20℃反应10h。最终得到ros响应型虾青素酯306mg。
[0066]
实施例4
[0067]
(1)构建c57bl/6j小鼠溃疡性结肠炎模型并验证实施例1-3制备的新型抗炎虾青素衍生物(产物相同)对小鼠溃疡性结肠炎的改善效果：
[0068]
饲养6周龄无特殊病原体(spf)雌性c57bl/6j小鼠。将小鼠维持在24
±
1℃和12小时的明暗周期进行1周的驯化，在此期间，用标准饮食(ain-93m)喂养小鼠。1周后，将小鼠随机分为5组(n＝8)，分别为正常组(normal)、模型组(model)、物理混合组(astad pba)、astad-pba组和游离虾青素组(f-asta)组。模型组(model)、物理混合组(astad pba)、astad-pba组和游离虾青素(f-asta)组动物自由饮用添加3％dss的纯净水，正常组每日口服200μl pbs，连续7天；过程中astad-pba组和f-asta组分别灌胃虾青素当量50mg/kg
·
体重的astad-pba和f-asta，物理混合组(astad pba)灌胃虾青素当量50mg/kg
·
体重的astad
和50mg/kg
·
体重的pba。
[0069]
在口服给药7天过程中，重点关注小鼠体重变化。对比发现(图1)，除正常组以外，dss诱导的肠炎小鼠体重均有所下降，其中模型组体重显著降低。受试游离虾青素和astad-pba组小鼠体重减少缓慢，尤其是astad-pba可以有效缓解dss诱导的结肠炎小鼠的体重减少。
[0070]
astad-pba对溃疡性结肠炎c57bl/6j小鼠结肠长度改善效果结果见图2；结果显示dss处理小鼠的结肠长度比对照小鼠短，而astad-pba组小鼠的结肠长度比模型组小鼠显著改善。作为对溃疡性结肠炎改善效果的直观表征，初步验证astad-pba对小鼠炎症的改善功能。
[0071]
(2)实施例1-3(产物相同)制备的新型抗炎虾青素衍生物改善溃疡性结肠炎组织病理效果验证：
[0072]
新鲜结肠组织在多聚甲醛溶液(4％pbs)中固定至少36h，然后石蜡包埋。将结肠石蜡切成5μm切片，苏木精、伊红染色。倒置显微镜观察结肠病理。
[0073]
比较正常组(图3)，模型组小鼠(对应图中肠炎小鼠)结肠隐窝、上皮细胞和杯状细胞被严重破坏，表现出明显的炎症。经过受试astad-pba，小鼠结肠部位结肠上皮细胞结构排列较紧密、规则，杯状细胞和隐窝保持完整，肠道屏障破坏得以改善。
[0074]
实施例5
[0075]
(1)构建c57bl/6j小鼠溃疡性结肠炎模型并验证实施例1-3(产物相同)制备的新型抗炎虾青素衍生物对小鼠溃疡性结肠炎肠道菌群的影响：
[0076]
采用ctab法提取样品总微生物基因组dna。用1％琼脂糖凝胶电泳检测dna的浓度和纯度。使用稀释的dna(1.0ng/ml)扩增16s rrna基因的v4-v5区域，扩增引物，纯化扩增物后定量。然后在illumina hiseq平台上对清理后的扩增产物进行测序。使用qiime软件包对原始序列进行处理。astad-pba对溃疡性结肠炎c57bl/6j小鼠结肠肠道菌群类型影响结果见图4；通过多维标度(nmds)分析小鼠肠道菌群的β多样性，以评估在小鼠溃疡性结肠炎发生之前和之后并用astad-pba灌胃的小鼠全群落结构。如图4所示，dss诱导的溃疡性结肠炎小鼠组的肠道微生物组(模型组)与正常组的肠道微生物菌群群落明显分离；f-asta组和astad-pba受试组菌群群落距离很近，区别于模型组，独立成簇。表明溃疡性结肠炎的发生显著改变小鼠肠道微生物的稳态，受试astad-pba后可有效缓解溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群的紊乱。
[0077]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。