一种缓释k-卡拉胶寡糖的CS-KOS温敏水凝胶的制备方法与流程

一种缓释k-卡拉胶寡糖的cs-kos温敏水凝胶的制备方法
技术领域
1.本发明属于高分子材料技术领域，本发明涉及一种缓释k-卡拉胶寡糖(kos)的cs-kos温敏水凝胶的制备方法。


背景技术：

2.近几年研究表明kos具有抑制小胶质细胞过度活化，在中枢神经损伤中具有一定的应用前景，但是全身给药不能保证kos在中枢神经损伤处维持足够的药物浓度。虽然生物医用材料是解决局部给药的理想载体，但是多数固体材料不能与损伤充分吻合，会带来二次机械损伤，同时还存在载药量小、缓释速度较快、材料降解速度不可控的问题，不能长时间保证药物的有效浓度的问题，而且目前尚未有缓释kos的生物材料。


技术实现要素：

3.为了克服现有技术的不足，本发明提供一种缓释k-卡拉胶寡糖(kos)的cs-kos温敏水凝胶的制备方法，该凝胶具有温敏性，低温呈现为液态，37度凝固为固态；该凝胶能够缓释kos并具有可控降解性。
4.本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
5.一种缓释k-卡拉胶寡糖(kos)的cs-kos温敏水凝胶的制备方法，将k-卡拉胶寡糖(kos)水溶液和壳聚糖(cs)醋酸溶液混合，该混合物低于37度时，混合物以液态形式存在，温度升至37度时会凝固成固态水凝胶，具有温敏性，k-卡拉胶寡糖(kos)/壳聚糖(cs)的质量比为2.25:1～2.75:1。
6.一种缓释k-卡拉胶寡糖(kos)的cs-kos温敏水凝胶的制备方法，具体步骤为：
7.1)称取脱乙酰度≥90.0％的壳聚糖(cs)一份，充分溶解于0.1mol/l的醋酸水溶液中，制备成2％的壳聚糖(cs)溶液；
8.2)称取k-卡拉胶寡糖(kos)粉末一份，充分溶解于去离子水中，制备成30.0mg/ml～36.6mg/ml的k-卡拉胶寡糖(kos)溶液；
9.3)将2)制备的k-卡拉胶寡糖(kos)溶液缓慢滴加到1)壳聚糖(cs)溶液中，并不断搅拌，制备成k-卡拉胶寡糖(kos)/壳聚糖(cs)的质量比为2.25:1～2.75:1的混合物；
10.4)将3)制备的混合物温度升至37℃，得到k-卡拉胶寡糖(kos)/壳聚糖(cs)的质量比为2.25:1～2.75:1的水凝胶。
11.进一步的，k-卡拉胶寡糖(kos)作为交联剂。
12.制备的水凝胶具有温敏性，在37℃条件下凝胶时间为300～17min，低于37℃混合物不能形成固态水凝胶。
13.制备的水凝胶可缓释k-卡拉胶寡糖(kos)，对k-卡拉胶寡糖(kos)的缓释程度为30.38％～24.24％。
14.上述制备的缓释k-卡拉胶寡糖(kos)的cs-kos温敏水凝胶为天然高分子组成的纤维多孔状聚合物，具有良好的温敏性、溶胀性、生物降解性和细胞相容性。该水凝胶可缓释
k-卡拉胶寡糖(kos)，可作为递送k-卡拉胶寡糖(kos)等药物分子和中枢神经损伤修复的材料。
15.上述制备的缓释k-卡拉胶寡糖(kos)的cs-kos温敏水凝胶具有细胞生物相容性。
16.上述制备的缓释k-卡拉胶寡糖(kos)的cs-kos温敏水凝胶支持小胶质细胞质(n9)的生长、细胞的增殖、具有良好的细胞相容性，可应用于细胞三维培养和药物分子的递送。
17.本发明与现有技术相比的有益效果是：
18.本发明提供的一种缓释k-卡拉胶寡糖(kos)的cs-kos温敏水凝胶的制备方法，以k-卡拉胶寡糖(kos)为交联剂，通过离子交联制备一种缓释k-卡拉胶寡糖(kos)的温敏性水凝胶。本水凝胶不仅具有良好的温敏性，而且可以缓释k-卡拉胶寡糖(kos)，并起到可控降解的作用，因此该温敏凝胶的特点为：kos不仅作为交联剂使cs-kos凝胶形成温敏性水凝胶，而且本身作为药物可以在形成固体凝胶后缓释到凝胶周围，更重要的是随着kos的缓释，水凝胶逐步降解起到可控降解的作用。
19.制作的缓释k-卡拉胶寡糖(kos)的温敏水凝胶表面呈纤维多孔状分布，是天然可降解水凝胶，具有良好的温敏性、溶胀性和细胞相容性。其纤维状多孔状结构，可以为小胶质细胞的生长增殖提供能量和代谢产物交换的必需空间。其温敏特性可进行原位损伤组织的填充和修复；其缓释k-卡拉胶寡糖(kos)的能力可为k-卡拉胶寡糖(kos)药物分子的递送提供候选材料，在医药领域有巨大的应用前景。
附图说明
20.图1是cs-kos温敏水凝胶在37℃凝胶时间与交联剂含量的关系曲线图；
21.图2是cs-kos温敏水凝胶不同质量比体系的溶胀特性曲线图；
22.图3是cs-kos温敏水凝胶不同质量比体系的表面形态扫描电镜图。a为质量比2.25:1.0组，b为质量比2.5:1.0组，c为质量比2.75:1.0组；
23.图4是cs-kos温敏水凝胶的降解曲线图；
24.图5是卡拉胶寡糖(kos)的缓释曲线图；
25.图6是cs-kos温敏水凝胶对小胶质细胞生物相容性的评价图；
26.图7是小胶质细胞在温敏水凝胶上生长的状态，a为培养板，b为cs-kos温敏水凝胶。
具体实施方式
27.下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。
28.实施例1
29.一种缓释k-卡拉胶寡糖(kos)的cs-kos温敏水凝胶的制备方法，
30.制作放下按以下步骤进行：
31.1)称取脱乙酰度≥90.0％的壳聚糖(cs)一份，充分溶解于0.1mol/l的醋酸水溶液中，制备成2％的壳聚糖(cs)溶液；
32.2)称取k-卡拉胶寡糖(kos)粉末一份，充分溶解于去离子水中，制备成30.0mg/ml～36.6mg/ml的k-卡拉胶寡糖(kos)溶液；
33.3)将步骤2)制备的k-卡拉胶寡糖(kos)溶液缓慢滴加到步骤1)制备的壳聚糖(cs)溶液中，并不断剧烈搅拌，制备成k-卡拉胶寡糖(kos)/壳聚糖(cs)的质量比分别为4.5:2、5:2和5.5:2的混合物；
34.4)将步骤3)制备的混合物温度升至37℃，得到k-卡拉胶寡糖(kos)/壳聚糖(cs)的质量比为4.5:2、5:2和5.5:2的的水凝胶。
35.对比例1
36.步骤1)、步骤2)同实施例1；
37.步骤3)为将步骤2)制备的k-卡拉胶寡糖(kos)溶液缓慢滴加到步骤1)制备的壳聚糖(cs)溶液中，并不断剧烈搅拌，制备k-卡拉胶寡糖(kos)/壳聚糖(cs)的质量比为4.0:2.0、3.5:2.0、3.0:2.0的混合物，温度升至37℃仍然为溶胶状态，不具温敏性。
38.对比例2
39.步骤1)、步骤2)同实施例1；
40.步骤3)为将步骤2)制备的k-卡拉胶寡糖(kos)溶液缓慢滴加到步骤1)制备的壳聚糖(cs)溶液中，并不断剧烈搅拌，制备k-卡拉胶寡糖(kos)/壳聚糖(cs)的质量比为6.0：2.0、6.5：2.0、7.0：2.0混合物，混合物发生急剧絮凝，凝胶过程与温度影响无关，不具温敏性。
41.本发明制备的cs-kos水凝胶具有温敏性，凝固时间可由k-卡拉胶寡糖(kos)的含量控制(图1)。该水凝胶具有较高的溶胀度(图2)，k-卡拉胶寡糖(kos)的含量越高，水凝胶溶胀度越高。表面结构扫描电镜观察为纤维多孔状结构(图3)，a组表面以片状纤维为主，孔径较为均匀；b组表面网状纤维变细，孔径不规则；c组表面网状纤维变厚，孔径不规则。该水凝胶具有良好的降解性，降解程度受时间和k-卡拉胶寡糖(kos)的含量的控制(图4)，降解性具有可控的特点。该水凝胶可对k-卡拉胶寡糖(kos)起缓释作用(图5)。在该水凝胶上培养小胶质细胞，与对照组(细胞培养板)相比，凝胶上的细胞数量和对照组没有明显差别，表明该水凝胶能够支持小胶质细胞很好的生长(图6)。
42.应用例1
43.步骤1)、步骤2)同实施例1；
44.步骤3)为将步骤2)制备的k-卡拉胶寡糖(kos)溶液缓慢滴加到步骤1)制备的壳聚糖(cs)溶液中，并不断剧烈搅拌，制备k-卡拉胶寡糖(kos)/壳聚糖(cs)的质量比为5.0：2.0的混合物。
45.步骤4)将步骤3)制备的混合物注入24孔板，温度升至37℃，得到k-卡拉胶寡糖(kos)/壳聚糖(cs)的质量比为5.0：2.0的水凝胶，除酸灭菌备用。
46.步骤5)在步骤4)制备的水凝胶上接入小胶质细胞，24h后观察细胞形态。
47.本发明制备的cs-kos水凝胶具有良好的细胞相容性，在该水凝胶上培养小胶质细胞，与对照组(细胞培养板)相比，凝胶上的细胞形态(图7b)和对照组(图7a)没有明显差别，均呈长梭形。
48.本发明利用kos带有多硫酸基团和壳聚糖带有多氨基的结构特点，使kos的硫酸基团与壳聚糖的氨基发生离子交联作用，制备出新型可控的cs-kos温敏性水凝胶，从而解决了kos在sci处药物传递和缓释速度可控的问题。在低温下该材料保持为液态状态，注射动物体内可交联成固态，能够与神经损伤处充分吻合，避免了手术和固型材料的二次损伤；由
于kos的硫酸基与壳聚糖的氨基相互作用，随着kos的缓慢释放，cs-kos结构发生变化，材料逐渐降解，从而确保kos缓释时间与材料降解时间相匹配，达到温敏可控的要求，从而在中枢神经损伤处长时间保持kos的有效浓度，充分发挥kos对小胶质细胞炎症反应的抑制作用，起到改善中枢神经炎症微环境、促进sci修复的作用。
49.以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。