一种测定利格列汀杂质RBP-1含量的方法与流程

一种测定利格列汀杂质rbp-1含量的方法
技术领域
1.本发明属于药物分析技术领域。更具体地，涉及一种测定利格列汀杂质rbp-1含量的方法。


背景技术：

2.利格列汀(linagliptin)是利格列汀原料药的主要成分，化学名为8-[(3r)-3-氨基-1-哌啶基]-7-(2-丁炔基-1)-3,7-二氢-3-甲基-1-[(4-甲基-2-喹唑啉基)甲基]-1h-嘌呤-2,6-二酮，是一种有效的选择性二肽基肽酶-4(dpp-4)抑制剂，可用于治疗2型糖尿病。然而，药物的有效成分含量是反映药物纯度的重要标志，药物中存在的合成起始物料、中间体等杂质均可能会对药物的疗效产生影响，甚至导致毒副作用的产生，因此，杂质的测定对药物的安全评价至关重要。
[0003]
孙著叶等提供了一种测定利格列汀原料药合成过程中杂质含量的方法，用于检测8-[(3r)-哌啶-3-氨基]-7-(2-丁炔基)-3,7-二氢-3-甲基-1-[(4-甲基-2-喹唑啉基)甲基]-1h-嘌呤-2,6-二酮、8-[(3r)-3-氨基-1-哌啶基]-7-(3-溴-2-丁烯基)-3,7-二氢-3-甲基-1-[(4-甲基-2-喹唑啉基)甲基]-1h-嘌呤-2,6-二酮等杂质(孙著叶.hplc测定利格列汀的有关物质[j].中国现代应用药学,2016,33(04):451-455.)，但并不能检测利格列汀杂质rbp-1(cas号：no.168466-84-0)。


技术实现要素：

[0004]
本发明针对现有利格列汀杂质测定方法的不足，提供一种测定利格列汀杂质rbp-1含量的方法((r)-3-氨基-1-苄基哌啶)含量的方法，以有效控制利格列汀原料药的质量。
[0005]
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
[0006]
本发明提供了一种测定利格列汀杂质rbp-1含量的方法，通过高效液相色谱法对利格列汀原料药进行分析，获得色谱图，从而确定所述利格列汀杂质rbp-1的含量，结构式如下所示：
[0007][0008]
所述高效液相色谱法的色谱条件为：
[0009]
检测波长：190～200nm；
[0010]
流速：0.8～1.2ml/min；
[0011]
进样体积：3～7μl；
[0012]
柱温：25～35℃；
[0013]
以乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱；流动相乙腈在梯度洗脱过程中体积分数变化为：0～5min，10％～30％；5.1～13min，80％～95％；13.1～20min，10％～
30％；
[0014]
运行时间：10～30min。
[0015]
优选地，所述高效液相色谱法的色谱条件为：
[0016]
检测波长：194nm；
[0017]
流速：1.0ml/min；
[0018]
进样体积：5μl；
[0019]
柱温：30℃；
[0020]
以乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱；流动相乙腈在梯度洗脱过程中体积分数变化为：0～5min，20％；5.1～13min，90％；13.1～20min，20％；
[0021]
运行时间：20min。
[0022]
优选地，所述高效液相色谱的色谱柱为phenomenex kinetex xb-c18、4.6
×
100mm、2.6μm。
[0023]
优选地，所述高效液相色谱的检测器为dad。
[0024]
优选地，所述利格列汀原料药以供试品溶液的形式提供。
[0025]
进一步优选地，所述供试品溶液的溶剂为dmf：甲醇＝1：3～5(v：v)。
[0026]
最优选地，所述供试品溶液的溶剂为dmf：甲醇＝1：4(v：v)。
[0027]
优选地，所述高效液相色谱的空白溶液为dmf：甲醇＝1：3～5(v：v)。
[0028]
最优选地，所述高效液相色谱的空白溶液为dmf：甲醇＝1：4(v：v)。
[0029]
优选地，所述方法具体包括如下步骤：
[0030]
s1.设置色谱条件：
[0031]
色谱柱：phenomenex kinetex xb-c18、4.6
×
100mm、2.6μm；
[0032]
检测器：dad；
[0033]
检测波长：190～200nm；
[0034]
流速：0.8～1.2ml/min；
[0035]
进样体积：3～7μl；
[0036]
柱温：25～35℃；
[0037]
以乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱；流动相乙腈在梯度洗脱过程中体积分数变化为：0～5min，10％～30％；5.1～13min，80％～95％；13.1～20min，10％～30％；
[0038]
运行时间：10～30min；
[0039]
s2.溶液的配制：
[0040]
空白溶液：dmf：甲醇＝1：4(v：v)；
[0041]
供试品溶液：将利格列汀原料药用空白溶液稀释至1mg/ml，即得；
[0042]
对照品储备液1：将利格列汀杂质rbp-1用空白溶液稀释至1mg/ml，即得；
[0043]
对照品储备液2：将对照品储备液1用空白溶液稀释至0.01mg/ml，即得；
[0044]
对照品溶液：将对照品储备液2用空白溶液稀释至0.001mg/ml，即得；
[0045]
检测限溶液：将对照品储备液2用空白溶液稀释至0.05mg/ml，即得；
[0046]
s3.将上述溶液按顺序注入色谱仪中，记录色谱图，根据色谱图分析检测结果。
[0047]
进一步优选地，所述分析检测结果的判断方法如下：
[0048]
a为对照品溶液中利格列汀杂质rbp-1峰面积的平均值；
[0049]
b为检测限溶液中利格列汀杂质rbp-1峰面积；
[0050]
若供试品溶液中利格列汀杂质rbp-1峰面积的平均值大于a，则报告大于0.1％，即代表供试品溶液中利格列汀杂质rbp-1的含量(质量比)大于0.1％；
[0051]
若供试品溶液中利格列汀杂质rbp-1峰面积的平均值等于a，则报告0.1％，即代表供试品溶液中利格列汀杂质rbp-1的含量(质量比)为0.1％；
[0052]
若供试品溶液中利格列汀杂质rbp-1峰面积的平均值大于或等于b且小于a，则报告小于0.1％，即代表供试品溶液中利格列汀杂质rbp-1的含量(质量比)小于0.1％；
[0053]
若供试品溶液中利格列汀杂质rbp-1峰面积的平均值小于b，则报告未检出，即代表供试品溶液中不含利格列汀杂质rbp-1。
[0054]
作为一种优选地可实施方式，所述方法包括如下步骤：
[0055]
s1.设置色谱条件：
[0056]
色谱柱：phenomenex kinetex xb-c18、4.6
×
100mm、2.6μm；
[0057]
检测器：dad；
[0058]
检测波长：194nm；
[0059]
流速：1.0ml/min；
[0060]
进样体积：5μl；
[0061]
柱温：30℃；
[0062]
以乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱；流动相乙腈在梯度洗脱过程中体积分数变化为：0～5min，20％；5.1～13min，90％；13.1～20min，20％；
[0063]
运行时间：20min；
[0064]
s2.溶液的配制：
[0065]
空白溶液：dmf：甲醇＝1：4(v：v)；
[0066]
供试品溶液：将利格列汀原料药用空白溶液稀释至1mg/ml，即得；
[0067]
对照品储备液1：将利格列汀杂质rbp-1用空白溶液稀释至1mg/ml，即得；
[0068]
对照品储备液2：将对照品储备液1用空白溶液稀释至0.01mg/ml，即得；
[0069]
对照品溶液：将对照品储备液2用空白溶液稀释至0.001mg/ml，即得；
[0070]
检测限溶液：将对照品储备液2用空白溶液稀释至0.05mg/ml，即得；
[0071]
s3.将上述溶液按顺序注入色谱仪中，记录色谱图，根据色谱图分析检测结果；
[0072]
其中，所述分析检测结果的判断方法如下：
[0073]
a为对照品溶液中利格列汀杂质rbp-1峰面积的平均值；
[0074]
b为检测限溶液中利格列汀杂质rbp-1峰面积；
[0075]
若供试品溶液中利格列汀杂质rbp-1峰面积的平均值大于a，则报告大于0.1％，即代表供试品溶液中利格列汀杂质rbp-1的含量大于0.1％；
[0076]
若供试品溶液中利格列汀杂质rbp-1峰面积的平均值等于a，则报告0.1％，即代表供试品溶液中利格列汀杂质rbp-1的含量为0.1％；
[0077]
若供试品溶液中利格列汀杂质rbp-1峰面积的平均值大于或等于b且小于a，则报告小于0.1％，即代表供试品溶液中利格列汀杂质rbp-1的含量小于0.1％；
[0078]
若供试品溶液中利格列汀杂质rbp-1峰面积的平均值小于b，则报告未检出，即代
表供试品溶液中不含利格列汀杂质rbp-1。
[0079]
本发明具有以下有益效果：
[0080]
本发明提供了一种测定利格列汀杂质rbp-1((r)-3-氨基-1-苄基哌啶)含量的方法，可简单、快速、准确地测定利格列汀原料药中杂质的含量，该方法适用性和专属性均较佳，适用于对利格列汀原料药质量的检测和控制。
附图说明
[0081]
图1是实施例1利格列汀杂质rbp-1原料的hplc图谱。
[0082]
图2是实施例1利格列汀原料药的hplc图谱。
[0083]
图3是实施例1空白溶液的hplc图谱。
[0084]
图4是实施例1检测限溶液的hplc图谱。
[0085]
图5是实施例1对照品溶液1的hplc图谱。
[0086]
图6是实施例1对照品溶液2的hplc图谱。
[0087]
图7是实施例1对照品溶液3的hplc图谱。
[0088]
图8是实施例1供试品溶液1的hplc图谱。
[0089]
图9是实施例1供试品溶液2的hplc图谱。
[0090]
图10是实施例2对照品溶液1的hplc图谱。
[0091]
图11是实施例2对照品溶液2的hplc图谱。
[0092]
图12是实施例2对照品溶液3的hplc图谱。
[0093]
图13是实施例3空白溶液的hplc图谱。
[0094]
图14是实施例3供试品溶液的hplc图谱。
[0095]
图15是实施例3对照品溶液的hplc图谱。
[0096]
图16是实施例3加标溶液的hplc图谱。
[0097]
图17是实施例4检测限溶液1的hplc图谱。
[0098]
图18是实施例4检测限溶液2的hplc图谱。
[0099]
图19是实施例4检测限溶液3的hplc图谱。
具体实施方式
[0100]
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0101]
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0102]
实施例1利格列汀杂质rbp-1含量测定
[0103]
1、检测样本
[0104]
利格列汀杂质rbp-1：cas号no.168466-84-0。
[0105]
利格列汀原料药：购自乳源东阳光药业有限公司。
[0106]
2、检测方法
[0107]
s1.色谱条件
[0108]
色谱柱：phenomenex kinetex xb-c18，4.6
×
100mm，2.6μm或类似填料(需加在限
过滤器)；
[0109]
检测波长：194nm；流速：1.0ml/min；进样体积：5μl；柱温：30℃；
[0110]
运行时间：20min；
[0111]
流动相a、b按表1中梯度进行洗脱：
[0112]
表1流动相梯度洗脱
[0113]
时间(min)a(％)＝0.1％h3po4b(％)＝acn08020580205.1109013109013.18020208020
[0114]
s2.溶液的配制
[0115]
空白溶液：dmf：甲醇＝1：4(v：v)；
[0116]
供试品溶液：精密称定20.0mg利格列汀原料药，置于20ml量瓶中，加空白溶液稀释至20ml，摇匀，再平行配制成2份，分别为供试品溶液1、供试品溶液2；
[0117]
对照品储备液1：精密称定20.0mg利格列汀杂质rbp-1，置于20ml量瓶中，加空白溶液稀释至20ml，摇匀即得；
[0118]
对照品储备液2：移取1.0ml对照品储备液1，置于100ml量瓶中，加空白溶液稀释至100ml，摇匀即得；
[0119]
对照品溶液：移取5.0ml对照品储备液2，置于50ml量瓶中，加空白溶液稀释至50ml，摇匀；
[0120]
检测限溶液：移取1.0ml对照品储备液2，置于20ml量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀即得；
[0121]
s3.将上述溶液按顺序注入色谱仪中，进样量如表2所示，记录色谱图。
[0122]
表2相应溶液的进样量
[0123]
溶液名称进样针数空白溶液1～2针检测限溶液1针对照品溶液3针空白溶液1～2针供试品溶液11针供试品溶液21针
[0124]
3、检测结果
[0125]
利格列汀杂质rbp-1原料中rbp-1的出峰时间为3.919min，在时间为1.5左右有一个明显的峰(图1)；利格列汀原料药与利格列汀杂质rbp-1相比，在时间为7.5左右出现新的峰(图2)；空白溶液在时间为1.5左右有一个明显的峰(图3)；检测限溶液中rbp-1的出峰时间为3.919min，峰面积为7.89(图4)；对照品溶液1中rbp-1的出峰时间为3.929min，峰面积为16.90(图5)，对照品溶液2中rbp-1的出峰时间为3.941min，峰面积为16.70(图6)，对照品
溶液3中rbp-1的出峰时间为3.932min，峰面积为17.12(图7)，3针对照品溶液的峰面积平均值为16.91；供试品溶液1中rbp-1的出峰时间为3.921min，峰面积为4.41(图8)；供试品溶液2中rbp-1的出峰时间为3.940min，峰面积为4.51(图9)。详细含量检测结果的数据如表3所示：
[0126]
表3利格列汀杂质rbp-1含量检测结果
[0127][0128][0129]
检测结果评判依据：
[0130]
a为连续3针对照品溶液中利格列汀杂质rbp-1峰面积的平均值，即16.91。
[0131]
b为检测限溶液中利格列汀杂质rbp-1峰面积，即7.89。
[0132]
若供试品溶液中利格列汀杂质rbp-1峰面积的平均值大于a，则报告大于0.1％，即代表供试品溶液中利格列汀杂质rbp-1的含量大于0.1％。
[0133]
若供试品溶液中利格列汀杂质rbp-1峰面积的平均值等于a，则报告0.1％，即代表供试品溶液中利格列汀杂质rbp-1的含量为0.1％。
[0134]
若供试品溶液中利格列汀杂质rbp-1峰面积的平均值大于或等于b且小于a，则报告小于0.1％，即代表供试品溶液中利格列汀杂质rbp-1的含量小于0.1％。
[0135]
若供试品溶液中利格列汀杂质rbp-1峰面积的平均值小于b，则报告未检出，即代表供试品溶液中不含利格列汀杂质rbp-1。
[0136]
由表3可知，供试品溶液中利格列汀杂质rbp-1峰面积的平均值小于b，即小于检测限溶液中利格列汀杂质rbp-1的峰面积，说明本实验中检测的利格列汀杂质rbp-1含量为未检出。
[0137]
实施例2利格列汀杂质rbp-1检测方法适用性验证
[0138]
步骤s1、s2与实施例1相同；
[0139]
s3.待基线平衡后，取上述各溶液按方法描述中的色谱条件，空白溶液进样1～2针、对照品溶液连续进样3针，记录色谱图，报告对照品溶液1～3中待测物质的峰面积及其rsd值(图10～12)，由图可知，对照品溶液1～3中待测物质的峰面积分别为21.99、22.22和21.83，其相对标准偏差(rsd)值为0.9％。
[0140]
详细数据如表4所示：
[0141]
表4利格列汀杂质rbp-1检测方法适用性结果
[0142][0143][0144]
由表4所示，对照品溶液主峰峰面积rsd为0.9％，小于10.0％，说明该检测方法的系统适应性结果良好，满足检测要求。
[0145]
实施例3利格列汀杂质rbp-1检测方法专属性验证
[0146]
步骤s1、s2与实施例1相同，区别在于，步骤s2还配制：
[0147]
加标溶液：精密称定20mg利格列汀原料药，置于20ml量瓶中，加对照品溶液稀释至刻度，摇匀即得；
[0148]
s3.待系统平衡后，取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液、加标溶液各进样1针，记录色谱图。报告对照品溶液和加标溶液中rbp-1与dmf的峰分离度、保留时间。
[0149]
空白溶液的杂质检测不受干扰(图13)；供试品溶液未检出rbp-1(图14)；对照品溶液的保留时间为3.919，峰面积为21.78，与dmf的分离度为7.65(图15)；加标溶液的保留时间为3.932，峰面积为22.78，与dmf的分离度为7.74(图16)。详细检测结果数据如表5所示：
[0150]
表5利格列汀杂质rbp-1检测方法专属性结果
[0151][0152]
由表5可知，空白溶液在rbp-1出峰位置无干扰；对照品溶液出峰保留时间与加标溶液中一致；与对照品溶液相比，加标溶液的rbp-1峰面积明显增强；加标溶液中rbp-1与dmf的分离度≥1.5，表明该检测方法的分离能力达到了检测要求。因此，所有检测结果均符合专属性要求。
[0153]
实施例4利格列汀杂质rbp-1检测方法检测限验证
[0154]
步骤s1、s2与实施例1相同；
[0155]
s3.待系统平衡后，取空白溶液进样1针、检测限溶液进样3针，记录色谱图。报告检
测限溶液连续进样3针的rbp-1峰面积、信噪比、rsd。
[0156]
检测限溶液1的峰面积为10.67，信噪比s/n为14.3(图17)；检测限溶液2的峰面积为10.55，信噪比s/n为12.3(图18)；检测限溶液3的峰面积为11.26，信噪比s/n为11.5(图19)；检测限溶液1～3中待测物质的峰面积相对标准偏差(rsd)值为3.52％。可见，检测限溶液连续进样3针的信噪比s/n均大于10，说明该方法对利格列汀杂质rbp-1的检测能力良好。
[0157]
详细检测结果数据如表6所示：
[0158]
表6利格列汀杂质rbp-1检测方法检测限结果
[0159][0160]
由表6可知，检测限溶液连续进样3针的信噪比s/n均≥3，表明该检测方法的检测限验证结果合格。
[0161]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。