一种用于极早期诊断骨科植入物相关感染的磁性纳米材料及其制备方法与流程

1.本发明涉及一种用于极早期诊断骨科植入物相关感染的磁性纳米材料及其制备方法，属于医学诊断技术领域。


背景技术：

2.骨科植入物一旦植入体内将面临发生骨科植入物相关感染的风险，这也是关节置换术入失败的主要原因之一。报道的发生率1-2％(初次髋关节及膝关节置换)，二期翻修手术感染再发生率在3-25％不等。虽然骨科植入物相关感染发生率不高，但一旦发生感染，往往是灾难性疾病,往往导致植入物失效,需要全身抗生素联合手术才能根治感染,给医生、患者带来巨大的身心负担。并且假体周围感染和无菌性松动常常难以区别，导致诊断进一步困难，从而影响临床决策。
3.随着关节置换术在我国广泛开展,骨植入物相关感染已成为一个亟需解决的临床问题,如何快速准确诊断植入物相关感染也成为目前国内外研究的热点。迄今为止,临床上尚无早期、特异性诊断植入物相关感染的有效方法，首先，目前临床所用的生化检查，关节液检查和影像学检查并不能早期诊断，从而延误治疗；其次不能定位感染病灶，导致治疗具有盲目性，因为感染周围感染病灶的精确定位将有助于手术方案的选择，如果感染只是局限于关节周围软组织，或许可以进行清创术就可以奏效，但感染一旦发生在骨界面乃至髓腔，将有必要进行关节置换手术；再者骨科植入物相关感染常同时伴有细菌生物膜形成，而生物膜一旦形成将对抗生素产生耐药，导致骨组织感染迁延不愈。因此，研究出一种能够极早期、特异地诊断骨科植入物相关感染的手段，对干预感染及其后的治疗至关重要，可以避免骨植入物相关感染进一步恶化，为目前骨科植入物相关感染诊断治疗提供新的策略，具有很重要的临床意义。
4.目前应用于生物医学领域磁性颗粒通常为表面修饰有二氧化硅的四氧化三铁纳米颗粒fe3o4@sio2，集成了四氧化三铁的磁响应能力以及二氧化硅比表面积大，颗粒大小可控，且表面易于修饰的特性于单个粒子之中，从而使其在成像、诊断，装载目的分子、影像剂和靶向输送药物等应用领域都表现出极大的潜力。磁性氧化铁纳米颗粒具有优异的超顺磁性，可以缩短t2弛豫时间，使其在 t2wi信号减低，体内清除速率快及良好的生物相容性和稳定性等优点，因此被广泛用于t2wi，同时磁性氧化铁纳米粒子被美国fda批准用作mri独特纳米造影剂。当核是具有超顺磁性的四氧化三铁时，进一步赋予材料磁性可用于 t2wi，而介孔二氧化硅外层的存在可以提高磁性材料的稳定性和生物相容性。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是：目前常规的检测方法不能早期、特异性诊断骨科植入物相关感染的问题。
6.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于极早期诊断骨科植入物相关感染
的磁性纳米材料，所述的磁性纳米材料为表面修饰有骨靶向肽和细菌靶向肽的fe3o4@sio2磁性纳米材料。
7.优选地，所述的骨靶向肽为天冬氨酸六肽，其氨基酸序列为：dddddd。
8.优选地，所述的细菌靶向肽为ubi
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，其氨基酸序列为： tgrakrrmqynrr。
9.优选地，所述的骨靶向肽和细菌靶向肽的质量比为1:1。
10.本发明还提供了上述的用于极早期诊断骨科植入物相关感染的磁性纳米材料的制备方法，包括：以核-壳结构的fe3o4@sio2磁性纳米颗粒为原料，再进行胺基修饰得到fe3o4@sio
2-nh2，然后分别加入含有羧基的骨靶向肽纳米粒子和细菌靶向肽纳米粒子，采用edc/nhs耦合的方法，进行缩合反应形成酰胺键，从而制备得到所述的磁性纳米材料。
11.优选地，所述的fe3o4@sio2磁性纳米颗粒是以油酸修饰的磁性fe3o4纳米晶为内核，在其表面制备二氧化硅层后得到。
12.优选地，所述的氨基修饰为采用3-氨丙基三乙氧基硅烷进行胺基化从而得到 fe3o4@sio
2-nh2。
13.优选地，所述的含有羧基的骨靶向肽纳米粒子为修饰有羧基和骨靶向肽的两亲性聚合物；所述的含有羧基的细菌靶向肽纳米粒子为修饰有羧基和细菌靶向肽的两亲性聚合物。
14.优选地，所述的两亲性聚合物为聚乙二醇，所述聚乙二醇的分子量为3000～5000g/mol。
15.优选地，所述的含有羧基的骨靶向肽纳米粒子为cooh-peg-d6；所述的含有羧基的细菌靶向肽纳米粒子为cooh-peg-ubi。
16.本发明还提供了一种磁性纳米材料在制备用于极早期诊断骨科植入物相关感染的试剂和/或试剂盒中的应用，所述的磁性纳米材料为上述技术方案中的用于极早期诊断骨科植入物相关感染的磁性纳米材料。
17.本发明的技术原理：
18.本发明以油酸修饰的磁性fe3o4纳米晶(20nm左右)为内核，在其表面包裹一层致密氧化硅，得到核壳结构的纳米复合材料(fe3o4@sio2)，通过缩合反应将 aptes引入到fe3o4@sio2的表面，得到具有氨基修饰的fe3o4@sio
2-nh2。然后用edc/nhs耦合的方法，将表面具有羧基官能团修饰同时改性带有骨靶向、细菌靶向的聚乙二醇通过与fe3o4@sio
2-nh2材料表面的氨基缩合形成酰胺键，即在其表面进行骨靶向(d6)和细菌靶向(ubi
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)修饰，赋予其骨靶向(骨靶向靶头d6)与细菌靶向(细菌靶向靶头ubi
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)功能以使得其能够富集在感染部位。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
20.本发明通过相关体内外实验表明，所合成的磁性纳米材料在体外具有良好的骨靶向和细菌靶向性能；本发明的磁性纳米材料在动物骨科植入物相关感染动物模型中能够特异性定位并实现极早期诊断感染，弥补了临床检测方法的不足。
附图说明
21.图1为fe3o4和fe3o4@d&u的透射电镜图；
22.图2为fe3o4和fe3o4@d&u的细胞毒性检测结果；
23.图3为fe3o4和fe3o4@d&u的溶血活性检测结果；
24.图4为fe3o4和fe3o4@d&u的体外骨靶向性能测试结果；其中，a是荧光标记的fe3o4和fe3o4@d&u对于羟基磷灰石(hap)的结合能力；b是对a (荧光标记的fe3o4和fe3o4@d&u对于羟基磷灰石(hap)的结合能力)的统计分析；
25.图5为fe3o4和fe3o4@d&u的体外细菌靶向性能测试结果；其中，a是通过流式细胞仪检测荧光标记的fe3o4和fe3o4@d&u对于细菌的靶向能力；b 是对a的统计分析；
26.图6为fe3o4和fe3o4@d&u的体外核磁共振的结果；其中，a是不同浓度的fe3o4和fe3o4@d&u的t2加权mri图像及其伪彩图，b是fe3o4和 fe3o4@d&u在不同浓度下的t2弛豫率；
27.图7为fe3o4和fe3o4@d&u的体内核磁共振定位诊断骨科植入物相关感染的结果；其中，a是fe3o4和fe3o4@d&u尾静脉注射sd大鼠的t2加权 mri图像及其伪彩图，b是受感染的大鼠左股骨的roi的t2*值的信号强度，c是来自大鼠的组织包括股骨、心脏、肾脏、心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏中的fe浓度。
具体实施方式
28.为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
29.以下实施例中所用到的骨靶向肽纳米粒子cooh-peg-d6购买于吉尔生化 (上海)有限公司，货号：766170，细菌靶向肽纳米粒子cooh-peg-ubi购买于吉尔生化(上海)有限公司，货号：659445。
30.实施例1
31.磁性纳米材料的制备：
32.(1)前驱体的合成：fe3o4的前驱体(铁-油酸酯复合物)主要是通过使金属氯化物与油酸钠反应，从而制备出金属油酸酯络合物。在三口烧瓶中称取 10.8g氯化铁(fecl3·
6h2o)和36.5g油酸钠溶解于由80ml乙醇，60ml 蒸馏水和140ml正己烷组成的混合溶剂中。将所得溶液加热至70℃并在该温度下保持4小时。反应完成后，将30ml蒸馏水均分成3份，取上层有机层含有油酸铁络合物的溶液在分液漏斗中洗涤3次。洗涤后，在真空烘箱中以 80℃干燥过夜以蒸发掉正己烷，得到蜡状固体形式的油酸铁络合物。
33.(2)fe3o4纳米晶的合成：室温下在能耐300℃以上高温的三口烧瓶中将9 g油酸铁络合物，2.13g油酸溶解在50ml 1-十八碳烯中。真空条件下将反应混合物在加热套中恒定加热至50℃后恒温保持20min，随后升高温度至 90℃，在该温度下恒定20min，这之后再将其温度加热至120℃，并在该温度下保持30min，通入氮气，然后关闭真空泵。当反应温度达到320℃时，发生剧烈反应，初始透明溶液变得混浊和棕黑色，在此温度下恒温30min，并随时观察是否有爆沸现象发生。然后将所得的包含纳米晶体的溶液在搅拌状态下冷却至室温，并依次向该溶液中加入正己烷，乙醇和异丙醇以沉淀纳米晶体。最后，以3000rpm的转速离心分离纳米晶体。
34.(3)fe3o4@sio2核-壳结构的合成:收集合成好的fe3o4纳米晶加入到60 ml水中，随后加入6g ctab和0.18g三乙醇胺超声处理30min，温和搅拌 2h。将2ml teos以10wt％分散到环己烷中，形成均匀混合溶液，并用蠕动泵控制速度为5rpm加入至上层溶液，室温下机械搅拌48h。得到的纳米粒子 fe3o4@sio2用乙醇和水各洗3次。
35.(4)fe3o4@sio2纳米颗粒表面氨基化:将1g fe3o4@sio2加入100ml 甲苯中搅拌均
匀，5min后加入1ml aptes(3-氨丙基三乙氧基硅烷， c9h
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no3si)，在80℃条件下回流20h，然后用无水乙醇在11000rpm转速下离心、洗涤，冷冻干燥36h后得到fe3o4@sio
2-nh2粉末。
36.(5)羧基活化：称取9.6mg edc(n-羟基琥珀酰亚胺，c4h5no3)，5.8 mg nhs(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，c8h
18
cln3)以及0.5 mg cooh-peg-d6(d6为天冬氨酸六肽，dddddd)，0.5mg cooh-peg-ubi (ubi为细菌靶向肽ubi
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，tgrakrrmqynrr)加入pbs(0.2m，ph＝6.1)，常温下搅拌0.5小时以活化羧基。
37.(6)酰胺化反应：取100mg fe3o4@sio
2-nh2粉末与40ml pbs(0.2m， ph＝7.4)混合均匀后加入上述溶液，ph提高到7以上，常温搅拌12小时。在11000rpm转速下用蒸馏水反复离心洗涤多次，得到骨靶向 细菌靶向的磁性纳米材料fe3o4@sio
2-peg-d6&ubi，缩写为fe3o4@d&u。
38.以上所有的材料冷冻干燥得到的粉末都在4℃条件下储存。
39.上述制备所得的磁性纳米材料fe3o4@d&u的透射电镜图如图1所示，从图 1可以看出，磁性纳米材料fe3o4@d&u大小均一，分散良好，粒径范围在50
±ꢀ
2nm。
40.将上述制备所得的磁性纳米材料fe3o4@d&u分别进行细胞毒性检测、溶血活性检测、体外骨靶向性能检测、体外细菌靶向性能检测、体外核磁共振检测和体内核磁共振定位诊断骨科植入物相关感染，如实施例2～7所示。
41.实施例2
42.fe3o4和fe3o4@d&u的细胞毒性检测：
43.从大鼠胫骨和股骨收集的骨髓间充质干细胞(rat bone mesenchymal marrowstem cell，rbmsc)，将细胞悬浮于含10％胎牛血清的基本必需培养基中，并在 5％co2和95％空气的潮湿培养箱中于37℃培养。每三天更换生长培养基，并将第三代rbmsc用于实验。
44.利用cck-8检测纳米颗粒对rbmscs的毒性，96孔板中每孔加100μl上述传代3次以上的rbmscs，使最终细胞量为5
×
103个/孔,将96孔板放入恒温培养箱37℃、5％co2条件下培养24h后，小心吸去上清，每孔加入不同浓度的纳米颗粒(1000，500，250，100，50，10，5μg/ml)100μl，新鲜培养液作为阴性对照。在预设的时间点(1d，3d，5d)，吸去孔中液体，向每孔加cck-8工作液100μl，96孔板放回培养箱孵育2h，测量450nm的吸光度(od)值。检测结果如图2所示，由图2可知，与不加纳米颗粒的对照组相比，在第五天 fe3o4@d&u浓度高达500μg/ml的情况下未显示任何明显的生长抑制作用。证明了实施例1制备所得的磁性纳米材料fe3o4@d&u在体外具有良好的生物相容性。
45.实施例3
46.fe3o4和fe3o4@d&u的溶血活性检测：
47.将新鲜收集人血用肝素离心以除去血沉棕黄层，并将获得的红细胞用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤三次，以1,000g离心10分钟，并在pbs中重悬至4％(v/v)。用pbs(35mm磷酸盐缓冲液，0.15m nacl，ph 7.4)洗涤新鲜人红细胞(hrbc) 三次，并以1000g离心5分钟。将pbs中磁性纳米材料的两倍连续稀释液(浓度测试范围为10,20,50,100,200,500,1000μg/ml)加入到96孔板的每个孔中 (总体积：100μl)。将等体积(100μl)的4％w/v hrbc的pbs悬浮液加入到每个孔中以达到200μl的最终体积。将板在37℃下孵育1小时，然后通过以 1000g离心5分钟使细胞沉淀。将上清液(100μl)转移至透明的96孔板中。通过测量414nm处的吸光度
来检测血红蛋白(molecular devices，sunnyvale， ca，usa)。使用pbs(apbs)测定零溶血的值(阴性对照)，而使用0.1％(v/v)triton x-100
(a
triton
)确定100％溶血(阳性对照)。溶血百分比计算采用如下公式：
48.溶血％＝(a
sample-a
pbs
)/(a
triton-a
pbs
)
×
100；
49.磁性纳米材料的溶血活性检测结果如图3所示，图中结果表明，即使在浓度高达500μg/ml时，fe3o4@d&u均没有显示任何明显的溶血活性，说明实施例1制备的磁性纳米材料没有溶血活性。
50.实施例4
51.fe3o4和fe3o4@d&u的体外骨靶向性能检测：
52.羟基磷灰石(hap)与骨组织成分类似，因此在体外可以利用hap来模拟骨组织，进行骨组织亲和力检测。将含有羟基磷灰石(0.75mg/ml)的20ml 去离子(di)水中的50μg/ml fitc标记的纳米颗粒在550转下于37℃连续搅拌4h。在预定时间点，将200μl等分试样用1.0ml去离子水稀释，然后以1,000 g离心5分钟以除去羟基磷灰石和结合的纳米颗粒。通过测量fitc荧光强度定量上清液中的纳米颗粒的浓度，并通过标准曲线计算。通过从总纳米颗粒中减去未结合的纳米颗粒来计算结合的纳米颗粒。
53.体外骨靶向性能测试结果如图4所示。由图4可知，与单纯的fe3o4相比， fe3o4@d&u的骨靶向能力有明显的提升。结果证明了实施例1制备的磁性纳米材料粒fe3o4@d&u在体外具有良好的骨靶向性能。
54.实施例5
55.fe3o4和fe3o4@d&u的体外细菌靶向性能检测：
56.磁性纳米材料的细菌结合效率通过流式细胞仪进行检测。简而言之，将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa,atcc 43300)在胰酪胨大豆肉汤培养基(tsb)中培养至对数生长中期(od600＝0.5)，麦氏比浊法调整细菌浓度为1
×
106cfu/ml。将mrsa的对数中期悬浮液与fitc标记的纳米颗粒(10μg/ml)在37℃孵育 30分钟。最后，通过流式细胞术定量材料在细菌细胞上的定位。
57.体外细菌靶向性能测试结果如图5所示。由图5可知，与单纯的fe3o4相比， fe3o4@d&u的细菌靶向能力有明显的提升。结果证明了实施例1制备的磁性纳米材料fe3o4@d&u在体外具有良好的细菌靶向性能。
58.实施例6
59.fe3o4和fe3o4@d&u的体外核磁共振检测：
60.将磁性纳米材料以浓度梯度(0、10、20、50、100μg/ml)置于1.5ml的 ep管中。并用7.0t mr光谱仪(美国马萨诸塞州billerica的布鲁克公司)测量 t2加权mr图像。
61.磁性纳米材料的体外骨核磁共振测试结果如图6所示。由图6可知，磁性纳米材料粒的浓度越大，核磁共振下的t2弛豫时间越短，信号衰减越明显，并且 t2弛豫时间与纳米颗粒浓度的变化呈现线性关系(相关度r2》0.99)，说明了实施例1制备的磁性纳米材料在体外具有良好的磁性，并且能够降低核磁共振t2 相的弛豫时间。
62.实施例7
63.fe3o4和fe3o4@d&u的体内核磁共振定位诊断骨科植入物相关感染：
64.将聚醚醚酮(peek)植入物样品(江苏省，南通市君华特种材料有限公司) 加工成
直径为1.5毫米，高度为20毫米的棒。通过超声波清洗去除表面污渍。使用12只雌性sprague-dawley，指定无病原体(spf)的12周龄大鼠(上海，杰思捷公司)。将大鼠分为2组：fe3o4组和fe3o4@d&u组。peek棒样品被耐甲氧西林金黄色葡萄球菌细菌污染(浓度：108cfu/ml，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，atcc 43300)。然后，将四组(n＝6)的peek棒通过植入大鼠的左股骨。简而言之，将大鼠的膝盖张开以暴露股骨髁，并通过电穿孔扩大骨腔，直至其大小足以容纳peek棒。植入peek棒后，用骨蜡密封股骨的开口，逐层封闭手术部位。将大鼠关在单独的笼子里，随意进食。术后24小时，将各实验组大鼠的左侧股骨暴露于外部磁场，之后，按照组别通过大鼠静脉注射200μl fe3o4或fe3o4@d&u后再次将左侧股骨暴露于外部磁场。在给定时间内，用7.0t mr 光谱仪(美国马萨诸塞州billerica的布鲁克公司)记录t2加权mr图像。
65.实验结果如图7所示，从图中可以看出，在注射fe3o4纳米颗粒前后t2相信号变化微乎其微，相反注射磁性纳米材料fe3o4@d&u后，感染组织的信号衰减都可以清楚地观察到。
66.上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。