一种预测胶质母细胞瘤免疫微环境、预后及治疗敏感性的基因集及系统和方法与流程

1.本发明属于生物医学专业领域，具体涉及一种预测胶质母细胞瘤免疫微环境、预后及治疗敏感性的基因集及系统和方法。


背景技术：

2.胶质瘤是原发性cns肿瘤中最常见的恶性肿瘤，按其病理学分类可以分为低级别胶质瘤（lgg，who ii-iii级）和高级别胶质瘤（gbm，who iv级）。其中胶质母细胞瘤恶性程度最高，预后最差，具有进展迅速、肿瘤增殖侵袭能力强、易复发的特点。即使患者手术并辅助以标准放化疗，其中位生存期也仅约为14个月。由于肿瘤的发生，肿瘤组织分泌的趋化因子，以及肿瘤组织中血管生成，肿瘤发生破坏血脑屏障等原因，使得胶质瘤中出现了大量的免疫细胞。而这些浸润到肿瘤组织中的免疫细胞，大部分都丧失其原有的肿瘤杀伤功能，甚至高表达抑制性免疫检查点来抑制免疫细胞对于肿瘤细胞的杀伤。
3.不同级别胶质瘤患者之间，同一级别不同胶质瘤患者之间，免疫微环境都存在明显异质性，而针对肿瘤微环境的研究是肿瘤个体化治疗的关键。虽然脑内的主要免疫细胞是巨噬细胞以及小胶质细胞，但是越来越多的研究表明t细胞与胶质瘤的发展存在着密切的联系。t细胞作为重要的免疫细胞主要参与适应性免疫反应，不同亚型的t细胞在胶质瘤中具有不同的作用，例如t-reg细胞以及th2细胞等被认为是抑制抗肿瘤免疫的细胞，而cd8 t细胞、cd4 t细胞是具有细胞毒性的抗肿瘤免疫细胞。事实上，胶质瘤中往往越复杂的免疫微环境预示着更加不良的预后，即便是肿瘤杀伤性t细胞，其免疫功能也可能受到抑制而不具备肿瘤杀伤功能。
4.近年来以抗pd1、pd-l1、ctla4等免疫检查点阻断为治疗靶点的研究不断增多，并且在黑色素瘤、乳腺癌、膀胱癌等一些肿瘤中取得了显著的效果。但由于在gbm中的免疫治疗效果并不明确，且其毒性作用对于大脑的损伤，使得gbm免疫治疗研究受到限制，大多数研究只能局限在基础层面上，因此无法得到大规模的gbm患者的免疫治疗数据。t细胞活化与胶质瘤的肿瘤微环境、免疫治疗、预后有着很密切的联系。很多针对如何激活t细胞杀伤肿瘤功能，以及探究肿瘤中t细胞免疫抑制原因的研究正在开展。但目前gbm中的t细胞整体活化情况与预后，免疫微环境以及免疫治疗敏感性尚不明确。


技术实现要素：

5.鉴于现有技术存在的缺陷，本发明主要提供了一种预测胶质母细胞瘤免疫微环境、预后及治疗敏感性的基因集及系统和方法。通过计算t细胞活化风险评分作为一个独立的不良预后风险因素，能够很好的评价gbm患者的预后。联合风险评分与t细胞启动活化评分得到的免疫治疗评分，可以评价gbm患者免疫治疗的敏感性，为gbm患者免疫治疗提供了辅助性判断工具。
6.为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种预测胶质母细胞瘤免疫微环境、预后及治疗敏感性的基因集，所述基因集包括cd276、il-15、slc11a1、tnfsf4和treml2共5个基因。
7.一种预测胶质母细胞瘤免疫微环境、预后的系统，所述系统包括输入模块、分析模块和输出模块，分析模块数据通信连接输入模块和输出模块；所述输入模块用于输入胶质母细胞瘤样本的转录组表达数据，所述转录组表达数据为胶质母细胞瘤样本的mrna-seq数据。
8.所述分析模块基于胶质母细胞瘤样本的基因表达数据采用式i计算标准化风险评分rs*并根据标准化风险评分的分值预测胶质母细胞瘤样本的免疫微环境、预后情况：rs
*
=(rs-8.7401)/4.4757（i）其中，rs为t细胞活化相关风险评分，采用式ii计算：rs=(0.5258
×ecd276
) (0.1477
×eil-15
) (0.2178
×eslc11a1
) (0.2346
×etnfsf4
) (0.2192
×etreml2
)；（ii）其中，e
cd276
、e
il-15
、e
slc11a1
、e
tnfsf4
和e
treml2
分别为胶质母细胞瘤样本中基因cd276、il-15、slc11a1、tnfsf4和treml2的表达量；所述输出模块用于输出胶质母细胞瘤样本的免疫微环境和预后情况。
9.一种预测胶质母细胞瘤治疗敏感性的系统，所述系统包括输入模块、分析模块和输出模块，分析模块数据通信连接输入模块和输出模块；所述输入模块用于输入胶质母细胞瘤样本的基因表达数据；所述分析模块基于胶质母细胞瘤样本的基因表达数据采用式iii计算免疫治疗评分is并根据免疫治疗评分预测胶质母细胞瘤样本的治疗敏感性：is=z-score(x)=(x-μ)/δ（iii）其中，x=ps
*-rs
*
，μ为0.0925，δ为0.1571；ps
*
为标准化活化评分，采用式iv计算ps
*
=(ps-0.0502)/0.4357（iv）其中，ps为t细胞启动活化评分，以go:0002291作为基因集，将胶质母细胞瘤样本测序数据在r3.6.3中采用ssgsea算法计算得到，go:0002291基因集包含lilrb1、hla-dmb、icam1、itgal、lgals3、lgals9、apbb1ip和havcr2共八个基因。
10.rs
*
为胶质母细胞瘤样本的标准化风险评分rs*，采用式i计算。
11.所述输出模块用于输出胶质母细胞瘤样本的治疗敏感性。
12.一种胶质母细胞瘤免疫微环境、预后及治疗敏感性的基因集预测方法，采用如下步骤：a）获得胶质母细胞瘤样本，并对胶质母细胞瘤样本进行rna测序得到胶质母细胞瘤患者的转录组表达数据，即对胶质母细胞瘤样本进行mrna测序，得到mrna表达谱，将得到的mrna表达谱用fpkm格式表示。
13.b）计算胶质母细胞瘤样本的标准化风险评分rs*：rs
*
=(rs-8.7401)/4.4757（i）其中，rs为t细胞活化相关风险评分，采用下式计算：rs=(0.5258
×ecd276
) (0.1477
×eil-15
) (0.2178
×eslc11a1
) (0.2346
×etnfsf4
) (0.2192
×etreml2
)（ii）；
其中，e
cd276
、e
il-15
、e
slc11a1
、e
tnfsf4
和e
treml2
分别胶质母细胞瘤样本中基因cd276、il-15、slc11a1、tnfsf4和treml2的表达量；c）计算胶质母细胞瘤样本的免疫治疗评分is：is=z-score(x)=(x-μ)/δ（iii）其中，x=ps
*-rs
*
，μ为0.0925，δ为0.1571；ps
*
为标准化活化评分，采用式iv计算ps
*
=(ps-0.0502)/0.4357（iv）其中，ps为t细胞启动活化评分，以go:0002291作为基因集，将胶质母细胞瘤样本测序数据在r3.6.3中采用ssgsea算法计算得到；rs
*
为标准化风险评分rs*，采用式i计算；d）根据标准化风险评分rs*和免疫治疗评分is计算结果预测胶质母细胞瘤样本的免疫微环境、预后及治疗敏感性。
14.所述基因集用于预测胶质瘤患者的免疫微环境、预后及治疗敏感性。
15.所述的输入模块、分析模块和输出模块采用计算机可操作设备，包括但不限于计算机存储器、计算机处理器、计算机输出显示终端、用于输入数据的键盘、用于导入和提取数据的接口及实现所述功能的任何硬件和软件部分。
16.本发明相对现有技术，具有如下的优点及有益效果：首次在胶质母细胞瘤中建立了t细胞活化相关的基因集和标准风险评分公式，根据标准风险评分公式建立了一种预测胶质母细胞瘤免疫微环境、预后的系统，可以很好的评价gbm患者的预后及免疫微环境。该系统的建立可以对患者的生存时间进行预测，并且在其他数据库中得到了很好的验证，具有临床转化价值。进一步根据t细胞活化相关风险评分和t细胞启动活化评分建立胶质母细胞瘤的免疫治疗评分is计算公式，根据免疫治疗评分is建立一种预测胶质母细胞瘤治疗敏感性的系统，该系统可以很好的预测gbm患者免疫治疗的效果，结果在多个数据库中得到稳定验证。对于gbm患者的免疫治疗敏感性具有预测价值，为gbm免疫治疗提供了理论依据。通过风险评分和免疫治疗评分建立的两个预测系统分别只用了5个和13个基因来评价gbm患者的预后以及对免疫治疗反应性进行预测，与上百个基因相比大大降低了基因的数量，具有极高的应用价值。
附图说明
17.图1a-1e是t细胞活化风险评分与tcga数据库中样本预后关系图。其中，a为高低风险评分组的生存曲线图，b为单因素回归分析图，c为多因素回归分析图，d为样本的0.5-2年的生存率列线图，e为预测生存概率与实际生存率对比图。
18.图2a-2c是免疫治疗评分与tcga数据库中样本免疫治疗敏感性的关系图。其中，a为启动活化评分、风险评分与免疫治疗敏感性的相关性曲线图，b为启动活化评分、风险评分高低不同分组与免疫治疗敏感性的柱形图，c为高、低免疫治疗评分组患者的免疫治疗反应性对比图。
19.图3a-3h是t细胞活化风险评分与验证组数据库中gbm样本的预后关系图。其中，a为cgga325数据库样本的单因素回归分析图，b为cgga325数据库样本的多因素回归分析图，c为cgga693数据库样本的单因素回归分析图，d为cgga693数据库样本的多因素回归分析
图，e为gse16011数据库样本的单因素回归分析图，f为gse16011数据库样本的多因素回归分析图，g为cgga325 数据库的预测生存概率与实际生存率对比图，h为cgga693数据库的预测生存概率与实际生存率对比图。
20.图4a-4f是tcga数据库gbm样本t细胞活化相关风险评分与免疫微环境之间的关系图。其中，a为t细胞活化相关风险评分与肿瘤纯度关系图，b为t细胞活化相关风险评分与基质评分的关系图，c为t细胞活化相关风险评分与免疫评分的关系图，d为t细胞活化相关风险评分与免疫细胞数量的关系图，e为t细胞活化相关风险评分与抗肿瘤免疫评分和促肿瘤免疫抑制评分的关系图，f为t细胞活化相关风险评分与免疫细胞含量的关系图。
21.图5a-5f是免疫治疗评分与验证组数据库中样本免疫治疗敏感性的关系图。其中，a为cgga325数据库启动活化评分、风险评分与免疫治疗敏感性的相关性曲线图，b为cgga693数据库启动活化评分、风险评分与免疫治疗敏感性的相关性曲线图，c为cgga325数据库启动活化评分、风险评分与免疫治疗敏感性的柱形图，d为cgga693数据库启动活化评分、风险评分与免疫治疗敏感性的柱形图，e为cgga325数据库高、低免疫治疗评分组患者的免疫治疗反应性对比图，f为cgga693数据库高、低免疫治疗评分组患者的免疫治疗反应性对比图。
具体实施方式
22.下面通过具体实施例和附图对本发明做进一步详细说明。以下实施例仅对本发明进行进一步说明，不应理解为对本发明的限制。以下实施例中的实验方法如无特殊规定，均为常规方法，所涉及的实验试剂及材料如无特殊规定均为常规生化试剂和材料。具体实施例中采用的数据库包含：
①
发现组：tcga rna-seqcohort(https://tcga-data.nci.nih.gov)数据库的149例样本。
②
验证组：cgga325 rna-seq cohort(http://www.cgga.org.cn)数据库的137例样本，cgga693 rna-seq cohort (http://www.cgga.org.cn)数据库的237例样本，gse16011 microarray (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)数据库的149例样本，包含了每列样本的生存、年龄、级别、idh1突变状态等临床特征信息。
23.实施例1：建立预测胶质母细胞瘤免疫微环境、预后及治疗敏感性的基因集及系统通过文献阅读结合gsea数据库中的t细胞活化基因集，得到一个与gbm肿瘤相关的t细胞活化基因集包含262个基因（如表1所示），应用r survival package,graphpad prism 7对tcga和cgga325两个数据库中样本的上述262个基因进行单因素cox回归分析，选出具有生存价值的基因(p《0.05)，并在tcga和cgga325两个数据库中取交集，得到5个对胶质母细胞瘤具有稳定预后价值的基因：cd276、il-15(interleukin-15)、slc11a1(solute carrier family 11 member 1)、tnfsf4(tnf superfamily member 4)、treml2(triggering receptor expressed on myeloid cells like 2)。这5个基因均为hr》1预后不良的风险基因。
24.表1 gbm肿瘤相关的t细胞活化基因集
seq），得到样本20000个左右的基因的mrna表达谱，将得到的表达量用fpkm格式表示。然后从20000个基因的表达谱中找到：cd276、il-15、slc11a1、tnfsf4 和treml2这5个基因的表达量，测序过程采用现有测序仪器或委托专业公司进行测序。
26.我们应用r survival package,graphpad prism 7对tcga数据库中的gbm患者进行了单因素和多因素cox回归分析。发现风险评分区别于级别、idh1突变、mgmt启动子甲基化、放疗、年龄等临床特征是独立的不良预后指标（如图1中b和c所示）。
27.为了评估t细胞活化风险评分的预后价值，我们计算了tcga数据库中胶质母细胞瘤样本的风险评分，并以风险评分的中位值10.7567为参考值，风险评分高于10.7567的样本作为高风险组，风险评分低于10.7567的样本作为低风险组，通过r survival绘制了生存曲线图，用log-rank检验，比较两组患者的生存差异。通过比较我们发现tcga数据库中高风险评分组gbm患者总体生存时间显著低于低风险评分组的患者(如图1中a所示)。
28.同样的，我们计算了tcga 数据库中gbm患者的标准化风险评分rs
*
，通过标准化风险评分预测gbm患者的0.5-2年生存概率，应用r nomogram绘制了胶质母细胞瘤患者的0.5-2年生存率列线图(如图1中d所示)，通过r nomogram绘制calibration plot检验图，检验结果显示预测生存概率与实际生存率具有非常好的一致性（如图1中e所示）。
29.进一步地，根据标准化风险评分建立了一种预测胶质母细胞瘤免疫微环境、预后的系统：该系统通过式i和式ii计算胶质母细胞瘤的标准化风险评分rs*，并根据评分预测：标准化风险评分大于中位值0.4506的样本具有较短的预后生存期和复杂的免疫微环境，小于中位值0.4506的样本具有较长的预后生存期和简单的免疫微环境。
30.我们从gsea数据库中得到t细胞活化第一信号相关基因集(t cell activation via t cell receptor contact with antigen bound to mhc molecule on antigen presenting cell,go:0002291)，以go:0002291作为基因集，将胶质母细胞瘤样本测序数据在r 3.6.3中采用ssgsea算法计算得到t细胞启动活化评分。我们将风险评分和t细胞启动活化评分联合分析来评价数据库tcga中不同gbm患者对于免疫治疗敏感性是否存在差异，采用r3.6.3中的spearman相关性分析以及卡方检验，分析启动活化评分与风险评分的相关性以及二者与免疫治疗敏感性之间的关系。如图2中a和b所示，在数据库tcga中t细胞启动活化评分与风险评分二者显著正相关，并且tide分析结果显示，在启动活化评分高风险评分低组对于免疫治疗敏感的患者比例最高，相反在启动活化评分低风险评分高组对于免疫治疗敏感的患者比例最低，差异具有统计学意义。go:0002291基因集包含lilrb1、hla-dmb、icam1、itgal、lgals3、lgals9、apbb1ip和havcr2共八个基因。
31.根据上述分析，我们将标准化的t细胞启动活化评分与风险评分相减并进行z-score标准化建立一个胶质母细胞瘤免疫治疗评分is的计算公式：is=z-score(x)=(x-μ)/δ（iii）其中，x= ps
*-rs
*
，μ为样本数据的均值0.0925，δ样本数据的标准差0.1571ps
*
为标准化活化评分，采用式iv计算ps
*
=(ps-min)/(max-min)（iv）其中，ps为t细胞启动活化评分，以go:0002291作为基因集，将胶质母细胞瘤样本测序数据在r 3.6.3中采用ssgsea算法计算得到；rs
*
为胶质母细胞瘤样本的标准化风险评分，采用式i计算。
32.以tcga数据库的胶质母细胞瘤样本的基因表达数据为输入，采用式iii和式iv计算tcga数据库中gbm样本的免疫治疗评分is，以tcga数据库样本免疫治疗评分的中位值0.0303将患者分为高低两组（评分高于中位值的患者作为高分组，低于中位值的患者作为低分组）。我们发现tcga数据库的gbm患者中，我们的免疫治疗评分对tide预测的免疫治疗敏感与不敏感的患者能够有很好的区分，免疫治疗评分高的患者主要为tide预测免疫治疗敏感的患者，而免疫治疗评分低的患者主要为tide预测免疫治疗不敏感的患者，既免疫治疗评分高组患者的免疫治疗反应率显著高于治疗评分低组，差异具有统计学意义(如图2中c所示)。
33.根据免疫治疗评分建立了一种预测胶质母细胞瘤治疗敏感性的系统：该系统通过式iii和式iv计算胶质母细胞瘤的免疫治疗评分is，并根据评分预测：免疫治疗评分大于中位值0.0303的样本免疫治疗敏感，小于中位值0.0303的样本免疫治疗抵抗。中位值0.0303是根据数据库tcga中样本的免疫治疗评分计算得到。
34.实施例2：验证组中t细胞活化风险评分与预后的关系我们应用r survival package,graphpad prism 7对验证组（cgga325，cgga693和gse16011）中的gbm患者进行了单因素和多因素cox回归分析。发现风险评分同样的区别于级别、idh1突变、mgmt启动子甲基化、放疗、年龄等临床特征是独立的不良预后指标(如图3中a-f所示)，这些结果表明t细胞活化相关风险评分是一个独立的预后指标。参照实施例1 的方法采用r nomogram绘制了验证组（cgga325和cgga693）的0.5-2年生存期曲线图，我们得到同样的结论，在cgga325 和 cgga693数据库中标准化风险评分同样具有很高的生存预测准确性(如图3中的g和h所示)。这些结果说明标准化风险评分具有很高的生存预测准确性和临床转化价值。
35.实施例4：t细胞活化风险评分与免疫微环境的关系利用r estimate计算tcga数据库中gbm样本的肿瘤纯度、基质评分和免疫评分，发现t细胞活化风险评分与肿瘤纯度成明显正相关，与肿瘤免疫评分和基质评分负相关(如图4中a-c所示)。可以看出，对于胶质母细胞瘤样本t细胞活化风险评分越高，肿瘤的纯度越低，肿瘤中的免疫微环境越复杂。
36.在rstudio r 3.6.3中通过metagenes方法对tcga数据库中的gbm肿瘤中的各类免疫细胞进行相对定量的计算，并将免疫细胞分为抗肿瘤效应、促肿瘤免疫抑制以及中间型三类。应用r gsva包进行ssgsea分析发现随着t细胞活化风险评分的升高，肿瘤中免疫活化和免疫抑制细胞同时增高(如图4中d所示)。根据每个gbm患者各类细胞含量的多少计算出抗肿瘤免疫活化评分和促肿瘤免疫抑制评分，发现在gbm中抗肿瘤免疫促进评分与促肿瘤免疫抑制评分存在明显正相关，且两种作用均随着t细胞活化风险评分的升高而增强(如图4中e所示)。接着我们应用mcp counter免疫微环境成分分析工具对上述的结果进行验证，发现肿瘤中的免疫细胞含量随着t细胞活化风险评分的升高而升高(如图4中f所示)。可见，t细胞活化风险评分高的胶质母细胞瘤患者具有更复杂的免疫微环境。对验证组（cgga325，cgga693和gse16011）中的样本进行了同样的分析，得到了相同的结论。
37.实施例5：验证组中用免疫治疗评分is评价gbm免疫治疗的敏感性采用实施例1的方法对验证组（cgga325、cgga693）的启动活化评分与风险评分进行相关性分析，并对二者与免疫治疗敏感性的关系进行卡方检验，我们得到了同样的结果，
即启动活化评分高风险评分低的患者免疫治疗反应率要显著高于启动活化评分低风险评分高的患者(如图5中a-d所示)，对gse16011数据库进行了同样的分析，该数据库的样本的启动活化评分高风险评分低的患者免疫治疗反应率要也显著高于启动活化评分低风险评分高的患者。
38.以cgga325、cgga693两个数据库的胶质母细胞瘤样本的基因表达数据为输入，采用式iii和式iv计算三个数据库中gbm样本的免疫治疗评分is，以tcga数据库样本免疫治疗评分的中位数0.0303将患者分为高低两组（评分高于0.0303的患者作为高分组，低于0.0303的患者作为低分组），我们的免疫治疗评分对tide预测的免疫治疗敏感与不敏感的患者能够有很好的区分，既免疫治疗评分高组患者的免疫治疗反应率显著高于治疗评分低组，差异具有统计学意义(如图5中e和f所示)，同样的计算了gse16011数据库样本的免疫治疗评分is，我们得到了相同的结论，gse16011数据库样本的免疫治疗评分高组患者免疫治疗反应率显著高于治疗评分低组。因此，免疫治疗评分可以很好的评价胶质母细胞瘤的免疫治疗敏感性，免疫治疗评分高的患者更能从免疫治疗中获益。
39.对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。