一种靶向补体蛋白发挥抗炎作用的PF-HA-diSE水凝胶及其制备方法与应用与流程

一种靶向补体蛋白发挥抗炎作用的pf-ha-dise水凝胶及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种靶向补体蛋白发挥抗炎作用的pf-ha-dise水凝胶及其制备方法与应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.骨关节炎(osteoarthritis,oa)是一种在人群中非常普遍且最常见的退行性关节疾病，导致疼痛和功能丧失，甚至残疾，全世界约有2.5亿人患有这种疾病。然而，该疾病的全球流行率和负担仍在不断增加，其直接和间接成本巨大且持续上升。一般来说，oa是一种全关节疾病，其结构被破坏并无法发挥作用，涉及关节软骨、软骨下骨、韧带、关节囊、滑膜和关节周围肌肉，最终导致关节衰竭。膝关节oa约占oa病例的85％，目前还没有治愈方案，当医疗干预未能充分改善持续性衰弱症状时，甚至需考虑关节置换手术。研究表面补体系统与oa具有一定的相关性，如初始的软骨损伤导致软骨细胞外基质的成分如软骨寡聚基质蛋白等的释放，从而激活补体系统；补体刺激影响oa软骨细胞炎症和降解分子的表达，以及细胞膜攻击复合体(c5b-9)在软骨细胞表面的沉积等。
4.作为细胞外基质的成分，透明质酸(hyaluronic acid,ha)具有保持滑液润滑、促进软骨修复、改善关节功能的作用，具有生物相容性和生物降解性。ha是一种天然存在于关节的线性糖胺聚糖，具有高度亲水性，能与水分子形成氢键，对关节润滑起着重要的作用。在oa中，由于炎性因子渗出等原因，ha浓度会降低33％-50％，从而导致润滑减少、压力增大、软骨损失。其在关节内注射是实现高药物浓度的一种可能的解决方案，也是克服口服药代动力学障碍的一种方法。硫酸软骨素(chondroitin sulfate,cs)是一类由二糖单元组成的糖胺聚糖。研究表明，cs对肿瘤和炎症等具有多种治疗作用，它可作为安全的医药级和营养级产品使用。根据我们以往的工作，cs-e二糖(δua-dise)可以通过与补体成分相互作用，减轻病灶部位的炎症反应，从而缓解oa，通过调节补体系统来达到抗炎作用，然而，δua-dise分子量(mw＝605)较小，在骨关节内代谢速度快，而腹腔注射需大剂量给药，因此对其剂型进行改造具有较强的意义。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明提供一种靶向补体蛋白发挥抗炎作用的pf-ha-dise水凝胶及其制备方法与应用，本发明以pf127、ha为原料，通过酶解法制备鱿鱼来源的δua-dise，将三者配制成水凝胶，在室温时呈流动的液体状态，37℃形成固态凝胶状。可维持δua-dise的缓慢释放。体内外实验表明，含有δua-dise的热敏缓释水凝胶具有一定的补体结合能力，能够抑制炎症，治疗oa，亦为oa的治疗提供了一种新的途径，方法科学性高、可行
c为5％pf127,pf-ha,pf-ha-dise水凝胶的tem图像；图2d为1mg/ml c5蛋白的tem图像；图2e-g为1mg/ml c5补体蛋白与4％pf127、pf-ha、pf-ha-dise孵育后的tem图像；图2h为10％nhs的tem图像；图2i-k为10％nhs与4％pf127、pf-ha、pf-ha-dise共孵育的tem图像。
25.图3为本发明水凝胶对小鼠滑膜细胞的形态及细胞增殖上的影响。图3a为对照组滑膜细胞形态；图3b为pf127水凝胶处理后的滑膜细胞形态；图3c为pf-ha水凝胶处理后的滑膜细胞形态；图3d为pf-ha-dise水凝胶处理后的滑膜细胞形态；图3e-3g为不同浓度的pf127，pf-ha，pf-ha-dise水凝胶处理后的细胞存活率。
26.图4为本发明elisa方法测定pf127水凝胶，pf-ha水凝胶，pf-ha-dise水凝胶，δua-dise与nhs共孵育后与游离补体成分的结合。图4a-g分别为c3-c9补体蛋白，图4h为c5a，图4i为sc5b9，图4j为bf。
27.图5为本发明elisa方法检测水凝胶及δua-dise对细胞培养液中补体成分含量的影响。图5a为c5a，图5b-e分别为c6-c9补体蛋白，图5f为sc5b-9。
28.图6为本发明水凝胶及δua-dise对c5b-9形成的影响。图6a-d为流式细胞术检测细胞表面形成的c5b-9的结果图；图6e为检测结果的统计分析图。
29.图7为本发明水凝胶及δua-dise对cox2,mmp13,peg2,il-1β和tnf-α的表达的影响。图7a为免疫荧光检测细胞表面cox2表达的结果图；图7b为cox2表达的统计分析图；图7c为elisa方法检测il-1β的表达；图7d为elisa方法检测mmp13的表达；图7e为elisa方法检测peg2的表达；图7f为elisa方法检测tnf-α的表达。
30.图8为本发明水凝胶及δua-dise及对小鼠oa模型的体内治疗作用。图8a为骨关节ct成像图；图8b为骨赘的表面积；图8c为骨赘的体积。
具体实施方式
31.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
32.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
33.本发明的一种典型具体实施方式中，提供一种pf-ha-dise水凝胶，所述水凝胶为热敏缓释水凝胶，其包含凝胶载体材料pf127，以及负载于凝胶载体材料上的ha以及δua-dise。
34.其中，所述pf127即f127是聚环氧丙烷(polypropylene oxide,ppo)和聚环氧乙烷(polyethylene oxide,peo)的共聚物，由于其良好的生物相容性和无毒性，已被fda批准为用于递送治疗药物的安全生物材料。pf127水溶液作为一种广泛使用的热敏药物载体，经过简单的局部注射，即可在体温下由溶液转化为水凝胶，从而实现负载药物的原位缓释。热敏水凝胶是一种新型的给药系统，在给药时是液体，在给药部位根据温度转换成凝
胶。它们的缓释和局部给药特性可以帮助实现高局部药物浓度，同时最小化全身毒性和降低给药频率。
35.本发明将上述三者配制成水凝胶，在室温时呈流动的液体状态，37℃形成固态凝胶状，同时本发明通过体外实验意外发现pf127具有一定的补体结合能力，并且能够抑制c5b-9的形成，抑制mmp13、tnf-α、il-1β等炎症因子的表达，发挥抑制炎症的作用。因此，本发明依托具有一定的补体结合能力的pf127，结合具有高亲水性和润滑作用的ha，将具有补体蛋白靶向性的小分子δua-dise复配于材料之中，形成pf-ha-dise热敏缓释水凝胶，经体内外实验验证，该水凝胶具有较好的oa治疗作用。
36.其中，所述δua-dise可通过cs-e酶解(如采用硫酸软骨素abc内切酶酶解)获得，其具有c5蛋白靶向性；具体的，cs可选自鱿鱼；
37.所述ha其分子量可为100-200kda，优选为140kda。
38.本发明的又一具体实施方式中，所述水凝胶中，
39.pf127的质量分数为10-30％，优选为20％；
40.所述ha的浓度为1-5mg/ml(室温)，优选为3mg/ml；
41.所述δua-dise的浓度为1-5mg/ml(室温)，优选为3mg/ml。
42.本发明的又一具体实施方式中，提供上述pf-ha-dise水凝胶的制备方法，所述制备方法包括：将pf127与水混合，向其中加入ha和δua-dise搅拌后即得。
43.其中，pf127的质量分数为10-30％，优选为20％；
44.所述ha的浓度为1-5mg/ml，优选为3mg/ml；
45.所述δua-dise的浓度为1-5mg/ml，优选为3mg/ml。
46.上述制备过程，可在室温条件下进行，此时制备得到的水凝胶为液态。
47.本发明的又一具体实施方式中，提供上述pf-ha-dise水凝胶、pf127热敏水凝胶和pf-ha水凝胶中的任意一种或多种在如下中的应用：
48.a)补抗体或制备补抗体的产品；
49.b)抑制炎症或制备抑制炎症的产品；
50.c)治疗骨关节炎或制备治疗骨关节炎的产品。
51.其中，所述产品可以为药物，所述药物可以为注射剂剂型。通过注射将上述水凝胶释放于患处。
52.其中，所述pf127热敏水凝胶、pf-ha水凝胶的制备方法与pf-ha-dise水凝胶的制备方法类似，如pf127热敏水凝胶即是将pf127与水混合后即得，pf127的质量分数为10-30％，优选为20％；
53.而pf-ha水凝胶即是将pf127与水混合，向其中加入ha搅拌后即得，其中，pf127的质量分数为10-30％，优选为20％；所述ha的浓度为1-5mg/ml，优选为3mg/ml。
54.以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，δua-dise，其制备方法：配制60mg/ml的cs-e溶液(鱿鱼来源)，加硫酸软骨素abc内切酶酶解24h，反应结束后将酶灭活，0.22μm的滤膜过滤。使用bio-gel p10柱及akta对酶解产物进行分离(流动相：1mol/l氯化钠，10％乙醇)，收集δua-dise。
55.实施例1水凝胶的制备
56.对于pf127水凝胶：将2g pf127和8g超纯水混合，在4℃下搅拌12h，得到无色透明溶液。对于pf-ha水凝胶和pf-ha-dise水凝胶，在制备过程中加入一定量的ha(140kda,30mg)和δua-dise(30mg)，并相应减少水的量，以保持总质量不变。最后,制备了具有良好凝胶性能的pf127水凝胶(20％pf127)、pf127-ha(20％pf127 3mg/ml ha)水凝胶和pf127-ha-dise水凝胶(20％pf127 3mg/ml ha 3mg/ml dise)(图1a，1b)。
57.实施例2流变性质测试
58.通过流变仪(mars60，thermo scientific)的椎板测量系统测试水凝胶的流变性质。应变幅值为1％，频率为1hz，升温速率为3℃/min，扫描温度范围为15-45℃，考察储能模量(g')和复合粘度(η)。为了考察凝胶时间，将水凝胶从4℃快速移至37℃水浴，记录凝胶不再流动的时间，如表1所示。
59.表1
60.水凝胶pf127pf-hapf-ha-dise凝胶时间(s)61
±
3.65160.25
±
1.65259
±
1.581
61.结果表明，与pf127水凝胶相比，pf-ha水凝胶和pf-ha-dise水凝胶的η不同，pf127水凝胶的复合粘度的突跃温度高于其他两种水凝胶，约高1℃，而pf-ha水凝胶和pf-ha-dise水凝胶几乎没有差异。三种凝胶的凝胶时间均在60s左右，随着ha和δua-dise的加入，凝胶时间减少，约在1s左右。三种凝胶的凝胶时间都比较短，注射后容易凝胶快速停留在局部注射位置。
62.实施例3δua-dise的溶出度和体外释放的研究
63.水凝胶的溶解度和负载活性分子的释放速率是水凝胶缓释效果的关键。在这项研究中，将3g水凝胶分离到离心管中，并在37℃下完全凝胶化。然后，在凝胶上轻轻加入5ml pbs(预热至37℃)作为释放介质。体系在37℃下振荡，从第二天开始测量水凝胶的高度，并按下式计算溶出度：溶出率(％)＝(h
0-h
t
)/h0×
100，h0表示初始凝胶高度，h
t
表示实时凝胶高度。为了计算δua-dise的释放量，从第二天开始，每天取出500μl释放介质，并通过hplc测定δua-dise的含量。取出释放介质后，将等量的pbs添加到体系中。δua-dise的释放量按下式计算：释放量(％)＝累计释放量/总量
×
100％。
64.如图1e所示，pf127水凝胶在第12天完全溶解，而pf-ha水凝胶和pf-ha-dise水凝胶均在第11天完全溶解。添加ha加速了水凝胶的溶解。如图1f所示，前两天δua-dise的释放速率最高，之后逐渐下降，直到第10天几乎完全释放。水凝胶成功实现了δua-dise的缓释。
65.实施例4水凝胶、补体蛋白、nhs，分别混合孵育后，在透射电子显微镜(transmission electron microscope,tem)下的形态研究
66.用将磷钨酸钠(2g)溶解在98ml h2o中并加入氢氧化钠溶液以将ph值调节至7.0。采用悬滴法进行负染色。用细滴吸管将一滴悬浮液吸在带膜的铜网上，然后静置几分钟。接下来，滴下阴性染色液，染色1-2min。然后用蒸馏水洗涤铜网并干燥。使用jeol jem-1230在80kv的加速电压下获得tem图像。
67.如图2a所示，5％的pf127在电镜下呈小片状，大小约为20nm，同时有一些链状结构。电镜观察，5％pf-ha和5％pf-ha-dise中有许多小球状结构，有的团聚成大球状结构，分布比较均匀(图2b、2c)。图2d显示了补体蛋白的电子显微镜图像。可以观察到蛋白片聚集在
一起，呈现出不规则的团块状结构。与水凝胶孵育后，结构发生了显着变化(图2e-2g)。具体来说，在pf127存在下，补体蛋白呈现规则的球状结构，分布均匀。此外，pf-ha-dise的存在补体蛋白团聚更强，并被小分子结构包围，因此我们认为水凝胶和蛋白质之间存在吸引力。nhs中的成分是复杂的，如图2h所示，视野中有各种不同大小和不规则的结构。加入水凝胶后，nhs中的成分趋于规则排列，形成许多球形结构。
68.实施例5水凝胶对小鼠滑膜细胞的毒性研究研究
69.将滑膜细胞以每孔8
×
103的密度接种在96孔板中。培养24h后，加入水凝胶，水凝胶的浓度为5％、10％和20％(v/v)。48h后，通过cck8法评估细胞存活率，用倒置荧光显微镜观察10％水凝胶处理的细胞形态。
70.如图3a-3d所示,经不同水凝胶处理后,细胞形态与对照组相比没有明显差异。如图2e-2g所示，在一定浓度范围内水凝胶处理的细胞生长良好。20％pf127、20％pf-ha和10％、20％pf-ha-dise对细胞生长有轻微的抑制作用，细胞存活率约为80％。综上所述，我们制备的水凝胶具有良好的生物相容性，且后续研究选用5％水凝胶。
71.实施例6水凝胶及δua-dise与nhs中游离补体成分的结合研究
72.通过elisa测定水凝胶对nhs中补体含量的影响，包括c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、c5a、sc5b9和bf。首先，将水凝胶(40μl/孔)和nhs(40μl/孔)加入样品孔中，然后将混合物混合并在37℃下孵育30min。弃去液体，用洗涤液洗涤5次。之后，加入hrp偶联试剂(50μl/孔)并在37℃下再孵育30min。弃去液体，再用洗涤液洗涤5次。加入显色试剂后，在37℃显色10min，加入终止液，反应终止后在450nm处测定od值。相对含量采用归一化法计算。
73.研究发现pf127可以显着降低elisa检测到的nhs中各种补体成分的含量(p《0.05)。从图4可以看出pf127、pf-ha、pf-ha-dise和δua-dise都可以降低elisa法检测到的补体含量。与δua-dise相比，pf127的存在使得游离补体的含量进一步明显降低。简而言之，pf127表现出降低elisa检测到的游离补体含量的能力，此外，这种效果随着ha和δua-dise的添加而增强。
74.实施例7水凝胶与细胞培养液中游离补体成分的结合研究
75.滑膜细胞以每孔3
×
105的密度接种在6孔板中。培养24h后，将10％nhs添加到具有pf127、pf127-ha-dise水凝胶或δua-dise(浓度)的孔中。然后，将细胞再培养48h，收集孔的上清液。随后，通过elisa方法检测上清液中c5a、c6、c7、c8、c9和sc5b-9的含量。
76.我们研究了pf127水凝胶、pf127-ha-dise水凝胶或δua-dise对滑膜细胞补体成分分泌的影响。如图5a、5d、5e和5f所示，在水凝胶存在的情况下，滑膜细胞分泌的c5a、c8、c9、sc5b-9的含量如我们预期的那样减少，并且在所选浓度条件下pf127水凝胶的效果优于δua-dise。但其他补体成分在对照组和水凝胶组之间没有显示出显着差异，可能是由于细胞分泌的量较少。此外，我们还可以看到，在滑膜细胞存在的情况下，pf127还可以减少细胞上清液中的补体成分。
77.实施例8流式细胞实验研究水凝胶对c5b-9形成的影响
78.滑膜细胞以每孔3
×
105的密度接种在6孔板中。培养24h后，将10％hns添加到具有pf127水凝胶、pf127-ha-dise水凝胶或δua-dise的孔中。然后，将细胞再培养48h，收集并用pbs洗涤两次，然后重悬于pbs中。加入稀释的抗c5b-9抗体(ae11，abcam)，将细胞在室温下4℃孵育2h，然后用pbs洗涤并重悬。然后加入二抗，室温避光孵育1h。pbs洗涤3次后，通过
流式细胞仪(cytoflex s)检测。
79.如图6所示，10％nhs诱导了c5b-9的形成，而pf127水凝胶与δua-dise均可以有效地阻断这一进程，而pf-ha-dise水凝胶更加促进了这一效果。
80.实施例9流式细胞实验研究水凝胶对炎症因子表达的影响
81.将滑膜细胞以每孔1
×
105的密度接种在12孔板中。培养24h后，将10％hns添加到具有pf127水凝胶、pf127-ha-dise水凝胶或δua-dise的孔中。然后，将细胞再培养48h，用pbs洗涤并在室温下用4％甲醛固定15min。用pbs洗涤后，用封闭缓冲液封闭细胞1h，加入一抗(cox2)并在4℃下孵育过夜。在加入二抗之前，弃去液体，再次用pbs洗涤细胞。用dapi染色细胞核。通过激光共聚焦高内涵成像分析系统(perkinelmer)捕获图像，并通过激光共聚焦高内涵成像分析系统软件(perkinelmer)计算相对荧光强度。
82.水凝胶对mmp13,peg2,il-1β和tnf-α的影响通过elisa方法检测，具体步骤见实施例6。
83.如图7a和7b所示，10％nhs促进cox2表达。与nhs组相比，水凝胶降低了cox2的表达。此外，elisa测定证实，水凝胶也降低了nhs刺激产生的细胞外培养基上清液中mmp13、peg2、il-1β和tnf-α的含量(图7c-7f)。
84.实施例10水凝胶对oa模型的治疗研究
85.适应性喂养一周后，将c57bl/6雄性小鼠随机分为5组，每组6只。术前注射4％水合氯醛10ml/kg进行麻醉。随机选取4组小鼠进行dmm手术，根据以往手术切除内侧半月板胫骨韧带，构建oa模型，其余组进行假手术，即只打开关节囊，不打开关节囊。切断内侧半月板的胫骨韧带。一周后，将水凝胶注入关节腔，每只小鼠10μl，对比注射生理盐水。每10天注射一次，共注射5次。给药后处死小鼠，分离膝关节并用4％多聚甲醛固定。小动物体内显微ct成像系统(perkinelmer，日本)用于ct扫描。扫描条件：电压90kv，电流88μa，剂量716mgy，旋转角度360
°
，扫描模式，高分辨率4min。
86.如图8a所示，假手术组关节面光滑，而模型组骨赘增生严重，骨磨损严重。此外，软骨表面变粗糙，出现裂纹，半月板弧形边缘发生改变，并伴有局部突起。相比之下，在用pf127水凝胶、pf127-ha-dise水凝胶或δua-dise治疗后，骨赘的面积和体积都减少了。pf127不仅可以与补体成分结合或抑制其分泌，而且在本研究中单独使用时局部注射对体内oa表现出良好的治疗效果。当然，其与ha和δua-dise配制的复合水凝胶的治疗效果更有效(图8b，8c)。总之，针对补体的pf-ha-dise水凝胶对oa效果很好。
87.应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。