吲哚啉酮类化合物及其在心肌损伤中的应用的制作方法

1.本发明涉及化合物应用领域，具体涉及吲哚啉酮类化合物及其在心肌损伤中的应用。


背景技术：

2.缺血性心脏病已成为世界范围内最主要死亡原因。心肌细胞死亡在多种心脏疾病(包括缺血性心脏病)中起着关键作用。由于成年哺乳动物的心肌细胞自我更新能力非常有限，死亡的心肌细胞无法通过活细胞分裂来补充，导致心脏功能下降、心律不齐、心力衰竭和猝死。及时恢复冠状动脉血流，即再灌，是减少心脏缺血性损伤引起的心肌细胞丢失的有效方法。然而，心肌再灌会导致心脏进一步损害，称为缺血/再灌(ischemia/reperfusion,i/r)损伤。目前，临床上心脏的缺血/再灌损伤的药物治疗主要分为以下几类：
3.一、抗心绞痛药物主要包括硝酸酯类，β受体拮抗剂，钙拮抗剂等。硝酸酯类药物可以促进心肌血流的重新分布，改善缺血区的供血供氧。临床上治疗心绞痛急性发作，治疗心肌梗死及难治性心力衰竭。β受体拮抗剂通过阻断β受体，抑制交感神经兴奋作用，改善心肌缺血区的供血供氧及心肌代谢，常用的β受体拮抗剂有普萘洛尔(心得安)、阿替洛尔(氯酰心安)、美托洛尔(美托心安)和吲哚洛尔等。钙拮抗剂通过扩张冠状动脉，增加心肌血供。还可以扩张外周血管，降低心脏前后负荷，抑制交感神经末梢递质释放，降低心肌耗氧量。常见药物包括苯烷胺类、二氢吡啶类、二苯哌嗪类等。
4.二、抗心肌梗死药物主要针对血栓的治疗，目前有血栓溶解药、抗凝血药、抗血小板聚集药等。溶栓药包括链激酶、尿激酶、组织型纤溶酶原激活剂等。抗凝血药肝素及水蛭素等用于治疗血栓，预防心肌梗死和溶栓后的再栓塞。常用的抗血小板聚集药物如阿司匹林、噻氯匹定及阿昔单抗。
5.三、调血脂药主要是指降低血胆固醇水平的药物和降低极低密度脂蛋白的药物。降低血清总胆固醇水平的药物为羟甲基戊二酰辅酶a还原酶抑制剂(他汀类)、胆酸结合树脂(考来烯胺)、普罗布考及多烯不饱和脂肪酸、右旋甲状腺素等。增加vldl清除的药物，如氯贝特类药物和烟酸类及其衍生物药物，后者属于广谱调血脂药。
6.然而，临床上这些药物的使用过程存在耐受性，甚至产生不良反应，如胃肠道反应、肝损害。即使用药后，死亡率依然很高，多种药物的联合使用给患者带来极大精神和经济负担。因此，深入开发基于新颖靶点的药物对于缺血性心脏病的临床治疗至关重要。
7.钙/钙调蛋白激酶ii(camkii)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可调节心脏多种生理和病理过程，包括膜兴奋性、细胞ca
2
稳态、代谢、基因转录和细胞存活等。作为心肌细胞死亡的重要调节因子，camkii的过度活化已被证明与多种心脏病理状况相关，例如缺血/再灌损伤、心肌梗塞、心律不齐、心脏肥大和重塑。在动物模型中，抑制camkii过度活化可显著缓解这些心脏疾病。小分子变构抑制剂kn-93和基于底物的肽抑制剂autocamtide-2相关抑制肽(aip)已被广泛地用于基础研究。然而，由于kn-93也可以直接抑制钾电流ikr和其他电压门控钾离子通道，以及aip的低膜通透性和较差生物利用度，阻碍了它们在临床上的进一
步发展。因此，尽管camkii被认为是有前途的心脏疾病治疗靶标，但迄今为止，还没有靶向camkii的药物可用于心脏病的临床治疗。


技术实现要素：

8.本发明提供了一类吲哚啉酮类化合物及其药用盐，能够作为钙/钙调蛋白依赖性激酶ii抑制剂用于改善心肌损伤，进而达到预防或治疗心肌损伤相关疾病的作用，无毒副作用，治疗效果显著。
9.本发明的一个目的是提供吲哚啉酮类化合物及其药用盐，在制备预防和/或治疗心肌损伤药物中的应用，所述吲哚啉酮类化合物结构式如式i所示：
[0010][0011]
其中，r1，r2选自氢、c
1-c5的烷基、硝基、氟、氯、溴、酯基、羟基、酰氨基、烷氧基中的任意一种；r3选自氢、羟基、酰氨基、烷基磺酰基中的任意一种。
[0012]
作为一种可实施方式，本发明的吲哚啉酮类化合物可选自如下s1-s10化合物：
[0013][0014]
本发明中所述的心肌损伤包括但不限于心肌缺血再灌注损伤，心肌梗死所致的损伤以及心衰所致的损伤。经实验证明，本发明的吲哚啉酮类化合物可有效降低心肌缺血再灌小鼠、心肌梗死小鼠以及心衰小鼠的心肌梗塞面积，修复心肌指标，减轻心脏功能障碍，可显著降低心脏tunel阳性细胞比例、血清ldh水平以及心肌细胞dna损伤分子γh2ax阳性细胞，提示化合物对心肌细胞死亡的改善作用。
[0015]
本发明中所述吲哚啉酮类化合物作为钙/钙调蛋白激酶ii抑制剂起到预防和/或治疗心肌损伤的作用。经实验证明，本发明提供的吲哚啉酮类化合物可有效抑制钙/钙调蛋白激酶ii的活性，其活性强于阳性对照药kn-93。
[0016]
在上述技术方案中，所述药物通过口服、胃肠内给药、注射、喷射、物理或化学介导等方法给药，或是被其他物质混合或包裹后给药。
[0017]
本发明的另一个目的，是提供上述结构的吲哚啉酮类化合物及其药用盐。由于s1-s4化合物结构已经公开，因此排除在本发明要保护吲哚啉酮类化合物之外。在某些实施方式中，本发明的吲哚啉酮类化合物及其药用盐可以通过有机合成获得。本领域技术人员可以使用任意公知的有机合成技术制备并且可以根据多种可能的合成途径合成本发明的化合物，包括其盐、酯、水合物或溶剂化物。作为一种可实施方式，本发明的上述s5-s10化合物的合成路线如下：
[0018][0019]
本发明的化合物可以在适宜的溶剂中进行制备合成，有机合成领域的技术人员能够较容易地对溶剂进行选择。适宜的溶剂能够在反应进行的温度下(例如可以是从溶剂的冷冻温度至溶剂的沸腾温度的温度范围)基本上不与初始原料(反应物)、中间体或产物反应。可以在一种溶剂或一种以上溶剂的混合物中进行给定的反应。根据特定反应步骤，本领域技术人员能够针对特定反应步骤选择适宜的溶剂。本发明化合物的制备可能涉及各种化学基团的保护和去保护。本领域技术人员能够容易地确定是否需要保护和去保护以及选择适宜的保护基团。保护基团化学可以参见例如t.w.greene and p.g.m.wuts,protective groups in organic synthesis,3rd ed.,wiley&sons,inc.,new york(1999)，其全部内容通过引用并入本发明。
[0020]
本发明在反应过程中可以根据本领域公知的任意适宜方法对反应进行监测。例如，可以利用光谱法，如核磁共振光谱(例如1h或
13
c)、红外光谱、分光光度法(例如uv-可见)、质谱，或者利用色谱法，如高效液相色谱(hplc)、液相色谱-质谱(lcms)或薄层层析(tlc)对产物的形成进行监测。本领域技术人员可以利用多种方法对化合物进行纯化，包括高效液相色谱(hplc)(例如参见“preparative lc-ms purification:improvedcompound specific method optimization”karl f.blom,brian glass,richard sparks,andrew p.combs j.combi.chem.2004,6(6),874-883，其全部内容通过引用并入本发明)和正相硅胶柱层析。
[0021]
在某些实施方式中，本发明的吲哚啉酮类化合物可以通过商业途径购买获得。在某些实施方式中，本发明的吲哚啉酮类化合物可以是商业可获得的化合物库，例如美兰的pubchem数据库和英国的chemspider数据库。
[0022]
本发明的再一个目的，是提供一种钙/钙调蛋白激酶ii抑制剂，所述抑制剂包括上述吲哚啉酮类化合物及其药用盐中的任意一种或几种。
[0023]
本发明的再一个目的，是提供一种预防和/或治疗心肌损伤的药物，所述药物包括
上述吲哚啉酮类化合物及其药用盐中的任意一种或几种，以及药学上可接受的辅料。
[0024]
在上述技术方案中，所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂和缓释剂中的任意一种或几种。
[0025]
在上述技术方案中，所述抑制剂或药物为注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、丸剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂或喷剂，可以根据本领域中的已知做法制备。
[0026]
与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0027]
本发明的吲哚啉酮类化合物可有效降低心肌缺血再灌小鼠、心肌梗死小鼠以及心衰小鼠的心肌梗塞面积，修复心肌指标，减轻心脏功能障碍，可显著降低心脏tunel阳性细胞比例、血清ldh水平以及心肌细胞dna损伤分子γh2ax阳性细胞，提示化合物对心肌细胞死亡的改善作用。
[0028]
本发明的吲哚啉酮类化合物可有效抑制钙/钙调蛋白激酶ii的活性，其活性强于阳性对照药kn-93。
[0029]
本发明的吲哚啉酮类化合物安全无毒副作用，给药后不会引起任何明显的脱靶不良反应，能够安全有效的发挥保护心肌损伤的作用，用于心肌损伤相关疾病的预防和治疗中。
具体实施方式
[0030]
下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0031]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0032]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0033]
下述实施例中，化合物s1-s4为商业购买，购买途径如下：
[0034]
化合物名称厂家货号s1sellecks1529s2aurora fine chemicalsa67.481.999s3aurora fine chemicalsa67.482.092s4aurora fine chemicalsa67.482.090
[0035]
实施例1、式s5-s10所示化合物的合成
[0036]
式s5-s10所示化合物的合成路线如下：
[0037][0038]
其中，r1、r2分别表示化合物s5-s10中对应的取代基。合成路线中所涉及的各化合物的取代基结构如表1所示：
[0039]
表1不同化合物的取代基结构
[0040][0041]
化合物s5-s10(即化合物8)的具体合成方法如下：
[0042]
合成化合物3：向化合物1(15.0mmol)的无水thf溶液(15ml)中加入化合物2(18mmol)的乙醚溶液5ml，回流，搅拌8小时。用饱和氯化铵(20ml)稀释随后用乙酸乙酯(30ml)萃取三次，合并有机层用水与盐水萃取，硫酸钠干燥。真空浓缩后浸膏利用硅胶柱层析(正己烷/乙酸乙酯，10：1)得到化合物3。
[0043]
合成化合物5：向化合物4(10mmol)的无水吡啶溶液(30ml)中加入三乙胺(1.5mmol)，回流，搅拌12小时后，真空浓缩，浸膏利用快速硅胶柱层析(正己烷/乙酸乙酯，10：1)，得到化合物5。
[0044]
合成化合物6：向化合物5(4g，5mmol)的乙酸乙酯：甲醇混合液(1：1，50ml)中加入raney-ni催化剂，通入氢气，体系在加热回流状态下搅拌12小时，随后冷却至0℃，真空浓缩后浸膏利用硅胶柱层析(正己烷/乙酸乙酯，10：1)得到化合物6。
[0045]
合成化合物7：向化合物6(3mmol)的dmf溶液(10ml)中加入化合物3(3mmol)的dmf溶液(5ml)，体系在90℃下搅拌6小时，过滤后真空浓缩后浸膏利用硅胶柱层析(正己烷/乙酸乙酯，10：1)得到化合物7。
[0046]
合成化合物8：向化合物7(3mmol)的二氯甲烷：甲醇混合液(1：1，10ml)中加入
raney-ni催化剂，通入氢气；随后加入etso2cl的吡啶溶液(10ml)，回流搅拌2小时，当体系中出现暗橙色胶状物时，冷却至室温并加入naoh-cao，在室温状态下搅拌1小时。将温度降至0℃并用1n hcl(100ml)稀释随后用乙醚(200ml)萃取三次，合并有机层用水与盐水萃取，硫酸钠干燥。真空浓缩后浸膏利用硅胶柱层析(正己烷/乙酸乙酯，10：1)得到化合物8。
[0047]
实施例2、式s1-s10所示化合物的体外抑制钙/钙调蛋白激酶ii活性实验
[0048]
1.实验材料
[0049]
adp-glo激酶活性检测试剂盒(promega,v6930)，substrate(biorbyt，orb364283)，cam(sigma，c4874)，caspase-assay(promega，g8981)，kn-93(selleck，s6787)，mgcl2、cacl2等有机试剂购于国药集团。
[0050]
2.实验方法
[0051]
1)筛选化合物浓度：初筛时，化合物选取10μm初浓度；复筛时，将先导化合物设置浓度梯度，8个梯度，5倍梯度稀释。
[0052]
2)配制蛋白激酶：camkii-δ9纯蛋白用10mm dtt-tris buffer 30倍稀释。
[0053]
3)配制反应buffer：以1ml体系为例，各试剂添加量及反应体系终浓度如下：
[0054][0055]
配制blank buffer：除了不加10mm atp，其余同上。
[0056]
4)每个药物设置两个阴性对照孔、两个空白对照孔，这些孔内加入tris-hcl 3μl，从1号浓度～8号浓度依次加入药物，每孔3μl。另将kn-93作为阳性对照。
[0057]
5)每个孔内都加入2μl camkii蛋白。加入后置于摇床15min混合均匀。
[0058]
6)阴性对照组和实验组加入反应buffer，每孔5μl；空白对照加入blank buffer，每孔5μl。加入后放置摇床室温反应30min。
[0059]
7)每孔加入reagents buffer(promega,v6930)10μl。摇床上室温反应50min。
[0060]
8)每孔加入detection buffer(promega,v6930)20μl，避光、接触空气慢摇床反应40min。
[0061]
9)酶标仪检测化学发光值，所得的数值与激酶活性成正相关。
[0062]
10)数据处理：通过graphpad prism绘制ic
50
曲线，得到化合物ic
50
值。
[0063]
表2 s1-s10所示化合物的钙/钙调蛋白激酶ii抑制活性检测结果
[0064][0065]
由表2可见，s1-s10所示化合物均有钙/钙调蛋白激酶ii抑制活性，其活性强于阳性对照药kn-93。
[0066]
实施例3、式s1-s10所示化合物对急性心肌缺血再灌注损伤小鼠的影响
[0067]
1.实验材料
[0068]
8周龄的c57/6j雄性小鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。
[0069]
2.实验方法
[0070]
取雄性健康c57/6j雄性小鼠，25
±
4g，小鼠适应性饲养一周后进行实验，随机分为11组(control,s1-s10)，每组8只。各组小鼠分别腹腔注射给于100μl的500ng/ml化合物溶液(相当于2.5μg/kg)，对照组给予等量的生理盐水。给药1小时后进行心肌缺血/再灌造模，按照以下步骤对小鼠使用30分钟的心脏局部缺血伴随24小时的再灌。
[0071]
1)随机选取c57/6j，6周雄鼠，使用3％戊巴比妥钠(80mg/kg)腹腔注射。
[0072]
2)小鼠麻醉后，将其四肢固定在手术台，使用75％酒精消毒。
[0073]
3)分离气管后，采用小动物呼吸机，进行气管插管，保证呼气顺畅。
[0074]
4)小鼠状态平稳后，剖开胸部皮肤，钝性分离肌肉并从中线切开胸骨。暴露心脏，开胸结扎冠状动脉左前降支(lad)30min,缺血30min后松开动脉夹，恢复血流，分两层缝合胸部及气管开口。
[0075]
5)观察小鼠状态正常后，将呼吸机拔出，撤下手术台。置于取暖灯下，防止小鼠失温。
[0076]
6)待小鼠清醒后，将其放回洁净笼具后放回饲养室饲养，观察小鼠状态及死亡情况并做好记录。
[0077]
7)假手术组小鼠不做缺血处理，其他操作相同。
[0078]
8)缺血30min，再灌24小时后牺牲取材。
[0079]
在指标检测中，利用以下步骤进行tunel染色：
[0080]
1)将组织切片于60℃烘片机上进行脱蜡，约1h后立即取出放入二甲苯中。
[0081]
2)组织切片于二甲苯中，每次5min，共3次。
[0082]
3)依次放入100％乙醇，每次2min，2次；95％乙醇，每次2min，2次；85％乙醇，每次2min，1次；pbs，每次2min，3次。
[0083]
4)将微波修复液用微波炉大火煮沸后，组织切片置于修复液中。中低火力煮15min，取出后冷却至室温。
[0084]
5)pbs洗3次,每次2min。利用吸水纸，吸干玻片上的剩余液体。
[0085]
6)使用3％bsa和20％fbs的0.1m tris-hcl(ph 7.5)封闭，室温30min。
[0086]
7)pbs洗3次，每次2min。利用吸水纸，吸干玻片上的剩余液体。
[0087]
8)每个样本加50μl tunel反应液，置于湿盒内，暗处避光，37℃孵育1h。
[0088]
9)pbs洗3次，每次2min。利用吸水纸，吸干玻片上的剩余液体。
[0089]
10)参考免疫荧光步骤，对细胞骨架actin进行染色。
[0090]
11)用dapi封片，干燥后于激光共聚焦显微镜下观察。
[0091]
3.实验结果
[0092]
经过治疗后，s1-s10均可有效降低心肌缺血再灌引起的心肌梗塞面积(表3)。此外，s1-s10可显著降低心脏tunel阳性细胞比例以及血清ldh水平，提示了s1-s10对心肌细胞死亡的改善作用。此外，我们发现，s1-s10可以降低急性心肌缺血再灌损伤导致的心脏dna损伤分子γh2ax阳性细胞比例(表3)。
[0093]
表3 s1-s10所示化合物的心肌急性缺血再灌注损伤的保护作用
[0094][0095]
实施例4、式s1-s10所示化合物对心肌梗死小鼠的影响
[0096]
1.实验材料
[0097]
8周龄的c57/6j雄性小鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。
[0098]
2.实验方法
[0099]
取雄性健康c57/6j雄性小鼠，25
±
4g，小鼠适应性饲养一周后进行实验，随机分为11组(control,s1-s10)，每组8只进行永久结扎冠状动脉造模手术。造模期间，各组小鼠分别腹腔注射给于100μl的500ng/ml化合物溶液(相当于2.5μg/kg/天)，连续4周，对照组给予等量的生理盐水，给药4周后进行牺牲取材。心脏永久结扎冠状动脉造模方法如下：
[0100]
1)3％戊巴比妥钠80mg/kg腹腔注射麻醉，用小鼠剃毛器剃除小鼠胸部及腋下毛发(充分暴露手术区)，用碘酒和75％乙醇手术区消毒。
[0101]
2)气管插管：麻醉后，夹趾检测无反应即可进行mi手术。打开外置光源、显微镜开关，打开呼吸机，设置好各参数(呼吸频率110bpm)，将气管插管沿声门插入气管，取下小鼠接上呼吸机，观察小鼠呼吸状况，胸廓起伏与呼吸机频率一致表示插管成功，即可进行mi手术。
[0102]
3)小鼠采用右侧卧位，用眼科剪在左前肢腋下，用显微剪于三、四肋间打开胸腔充分暴露心脏，显微直镊轻轻夹起少量心包并于左心耳下撕开少许心包，充分暴露左冠状动脉前降支(lad)或所在区域。
[0103]
4)结扎冠状动脉：于显微镜下找到lad走向或可能所在位置,持针器持取7-0带针缝合线，于左心耳下缘2mm处进针，缝线穿过lad，以完全阻断lad血流。
[0104]
5)关胸：结扎完成后，6-0缝线完全缝合胸腔开口(保证无缝隙、无错位)关闭胸腔，由内向外逐层缝合各层肌肉和皮肤。
[0105]
6)术后管理：术后密切关注小鼠状态，有无呼吸异常等。待小鼠自然苏醒后将小鼠从呼吸机上取下并取下气管插管，正常饲养。
[0106]
3.实验结果
[0107]
经过治疗后，s1-s10均可一定程度地改善各项心肌功能指标，包括左心室射血分数(ef)、缩短分数(fs)、舒张期左心室内径(lvidd)，收缩期左心室内径(lvids)(表4)。此外，s1-s10可显著降低心脏tunel阳性细胞比例、血清ldh水平以及心肌细胞dna损伤分子γh2ax阳性细胞，提示了s1-s10对心肌细胞死亡的改善作用。此外，我们发现，s1-s10可以有效缓解心力衰竭导致的心脏dna损伤(表4)。
[0108]
表4 s1-s10所示化合物的心肌梗塞的保护作用
[0109][0110][0111]
实施例5、式s1-s10所示化合物对心衰小鼠的影响
[0112]
1.实验材料
[0113]
8周龄的c57/6j雄性小鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。
[0114]
2.实验方法
[0115]
取雄性健康c57/6j雄性小鼠，25
±
4g，小鼠适应性饲养一周后进行实验，随机分为11组(control,s1-s10)，每组8只进行心肌缺血/再灌造模。造模期间，各组小鼠分别腹腔注射给于100μl的500ng/ml化合物溶液(相当于2.5μg/kg/天)，连续4周，对照组给予等量的生理盐水。给药4周后进行取材。按照以下步骤对小鼠使用30分钟的心脏局部缺血伴随4周的再灌。
[0116]
1)随机选取c57/6j，6周雄鼠，使用3％戊巴比妥钠(80mg/kg)腹腔注射。
[0117]
2)小鼠麻醉后，将其四肢固定在手术台，使用75％酒精消毒。
[0118]
3)分离气管后，采用小动物呼吸机，进行气管插管，保证呼气顺畅。
[0119]
4)小鼠状态平稳后，剖开胸部皮肤，钝性分离肌肉并从中线切开胸骨。暴露心脏，开胸结扎冠状动脉左前降支(lad)30min，缺血30min后松开动脉夹，恢复血流，分两层缝合胸部及气管开口。
[0120]
5)观察小鼠状态正常后，将呼吸机拔出，撤下手术台。置于取暖灯下，防止小鼠失温。
[0121]
6)待小鼠清醒后，将其放回洁净笼具后放回饲养室饲养，观察小鼠状态及死亡情况并做好记录。
[0122]
7)假手术组小鼠不做缺血处理，其他操作相同。
[0123]
8)缺血30min，再灌4周后牺牲取材。
[0124]
在指标检测中，tunel染色步骤同实施例2。
[0125]
3.实验结果
[0126]
经过治疗后，s1-s10均可减轻心脏功能障碍，左心室射血分数(ef)、缩短分数(fs)均有一定程度提高(表5)。此外，s1-s10可显著降低心脏tunel阳性细胞比例、血清ldh水平以及心肌细胞dna损伤分子γh2ax阳性细胞，提示了s1-s10对心肌细胞死亡的改善作用。此外，我们发现，s1-s10可以有效缓解心力衰竭导致的心脏dna损伤(表5)。
[0127]
表5 s1-s10所示化合物的心力衰竭的保护作用
[0128][0129]
实施例6、式s1-s10所示化合物对小鼠长期毒性实验
[0130]
1.实验材料
[0131]
10周龄的c57/6j小鼠，90只，雌雄各半，体重20-22g，购自北京维通利华实验动物有限公司。
[0132]
2实验方法
[0133]
1)化合物的配制
[0134]
精密称取s1-10所示的化合物，用0.5％cmc-na配制浓度为0.2g/ml的溶液。
[0135]
2)动物分组与给药
[0136]
将小鼠适应性饲养3-5天后，实验前一天晚6点禁食，自由饮水。实验时，将小鼠按体重随机分成对照组和实验组，每组10只，共9组。每20g小鼠体重给100μl的500ng/ml化合物溶液，即给药剂量为2.5μg/kg/天。对照组给予同等剂量的0.5％cmc-na。腹腔注射给药，连续4周。
[0137]
3)评价指标
[0138]
给药期间观察动物一下几个方面的指标：一般状况，如外观、行为、对刺激的反应；饮食量、饮水量、分泌物及排泄物；运动情况和能量消耗；学习记忆能力等。记录异常现象发生时间，观察有无死亡发生。如有死亡记录死亡发生时间，并尸检观察有无异常现象。
[0139]
给药期末经腹腔注射戊巴比妥钠(80mg/kg)，麻醉并采血检测血生化和血常规等指标。然后解剖动物，检查动物体型、毛色、皮肤、外生殖器和腔道等；剖开动物胸腹部皮肤，观察皮下组织变化；并按照顺序打开腹腔、盆腔、胸腔、颅腔，检查各腔内脏器组织的在体位置、颜色、大小。
[0140]
4)血生化与血常规实验
[0141]
使用小鼠血浆100μl进行血生化检测，具体如下：通过测定血浆谷丙转氨酶(alt)
和谷草转氨酶(ast)活性来评价肝功能；通过血浆尿素(尿素)和cre(尿素)评估肾功能。所有检测均由日立7600-110自动分析仪及罗氏公司的试剂盒进行检测。
[0142]
使用小鼠全血200μl进行血常规检测，具体如下：使用idexx procyte dx血液分析仪及idexx公司试剂盒，通过红细胞(rbc)、血红蛋白(hgb)、白细胞(wbc)和血小板(plt)等参数评估血象。
[0143]
5)小鼠代谢率分析实验
[0144]
代谢率分析是将老鼠被单独放置在12小时的光/暗循环中，使用一个全面的动物代谢监测系统评估各组小鼠的食物摄入、能量消耗和运动功能。在72小时内持续评估耗氧量(v
o2
)和二氧化碳产量(v
co2
)。能量消耗的计算公式如下:
[0145]
energy expenditure＝(3.815 1.232v
o2
/v
co2
)
×vo2
[0146]
6)morris水迷宫(mwm)实验
[0147]
采用水迷宫对小鼠进行空间学习记忆实验。小鼠每天接受4次不同起点的训练，连续5天。记录寻找平台的潜伏期(至少停留3秒)，以60秒为截止值。在第6天移除平台，允许动物从第三象限开始自由搜索1分钟。记录逃脱次训练次数，到平台区间时间，花在第一象限的总时间和延迟到达平台时间。
[0148]
3实验结果
[0149]
1)给药后均未发现明显异常现象，各组小鼠体重正常，除s6组小鼠的体重略有减轻。第29天后将小鼠牺牲后尸检，均未发现明显异常现象；
[0150]
2)给药后对各组小鼠的进食量没有影响，各实验组小鼠进食量与对照组相比无差异；
[0151]
3)给药后对各组小鼠的运动量和能量消耗没有影响，各实验组小鼠与对照组相比无差异；
[0152]
4)给药后对各组小鼠的学习记忆能力没有影响，各实验组小鼠与对照组相比无差异；
[0153]
5)给药后对各组小鼠的血常规和血生化指标没有影响，各实验组小鼠与对照组相比无差异；
[0154]
6)给药后对各组小鼠的组织器官形态学没有影响，各实验组小鼠与对照组相比无差异。
[0155]
表6 s1-s10所示化合物的长期毒性检测指标(一)
[0156][0157]
表7 s1-s10所示化合物的长期毒性检测指标(二)
[0158][0159][0160]
如表6、7所示，对小鼠进行化合物s1-s10的为期4周腹腔注射给药，给药期间及给药结束后未引起任何明显的脱靶不良反应，包括体重、食物摄入、能量消耗、空间学习和记忆的异常。此外，肝、肾功能，血象和主要器官的形态也未呈现异常，表明在化合物s1-s10发挥保护心肌缺血再灌注损伤、心衰及心肌梗死的同时没有引起明显的毒副作用。
[0161]
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含
在本发明的保护范围之内。