一种口服狂犬病病毒样颗粒疫苗及其制备方法与流程

1.本发明属于口服疫苗技术领域，具体涉及一种口服狂犬病病毒样颗粒疫苗及其制备方 法。


背景技术：

2.狂犬病是由狂犬病病毒(rabv)引发的一种嗜神经性人畜共患病，99％的人类狂犬病 死亡案例是由狗介导的，疫苗接种是预防rabv传播的最有效手段(zhang w j,zheng x x, cheng n,et al.isatis indigotica root polysaccharides as adjuvants for an inactivated rabiesvirus vaccine[j].international journal of biological macromolecules,2016,87:7-15.)。控制流 浪狗的数量、对家养犬及野生动物进行大规模或强制性非肠道疫苗接种运动以及野生动物 口服疫苗的进步，已经在几个发达国家成功消灭了陆生食肉动物介导的人类狂犬病。然而， 发展中国家每年仍有数以千计的人死于狂犬病，原因是财政、后勤和其他方面的阻碍，无 法控制狗的数量和实施大规模疫苗接种计划。提供一种更容易管理和更具成本效益的疫苗 可能有助于实现消除狗介导的人类狂犬病(arya j m,dewitt k,garrard m s,et al.rabiesvaccination in dogs using a dissolving microneedle patch[j].journal of controlled release, 2016,239:19-26.)。
[0003]
orv在全球消除狗介导的人类狂犬病中起着决定性作用，应紧急开展具体的实践活 动，以促进具有安全和成本效益的orv的快速和大规模使用。虽然几种自我复制的生物 制品，包括修饰的活病毒、减毒活病毒和重组病毒，都在犬种群中进行了口服评估，但由 于安全性问题，目前仍然没有开发出一种适合的orv(cliquet f,guiot a l,aubert m,et al. oral vaccination of dogs:a well-studied and undervalued tool for achieving human anddog rabies elimination[j].veterinary research,2018,49(1):61.)。
[0004]
口服给药相对于注射给药具有方便、快捷、安全和患者依从性好等优势，且不需要专 业的接种人员。其次，口服疫苗能刺激系统和黏膜免疫反应，建立更广泛和持久的保护。 然而，口服给药是具有挑战性的，尤其是对蛋白药物而言，需要克服恶劣的胃肠道环境， 避免诱导免疫耐受性，以实现有效的保护(renu s,han y,dhakal s,et al. chitosan-adjuvanted salmonella subunit nanoparticle vaccine for poultry delivered throughdrinking water and feed[j].carbohydrate polymers,2020,243:116434.)。
[0005]
蛋白类药物与病毒相比具有绝对安全性，其中vlps比多肽的稳定性和免疫原性都高， 因此是蛋白类药物研发的热点，而合适的递送载体是实现该类药物口服靶向与释放的最佳 手段(chen x y,butt a m,amin m c i m.enhanced paracellular delivery of vaccine byhydrogel microparticles-mediated reversible tight junction opening for effective oralimmunization[j].journal of controlled release,2019,311-312:50-64.)。
[0006]
plga和el100是fda批准的可用于人体的材料。以plga nps为载体在注射疫苗 的递送方面有很多应用(kole s,qadiri s s n,shin s m,et al.plga encapsulatedinactivated-viral vaccine:formulation and evaluation of its protective efficacy against viralhaemorrhagic septicaemia virus(vhsv)infection in olive flounder(paralichthys olivaceus) vaccinated by mucosal delivery routes[j].vaccine,2019,37(7):973-983.umerska a, gaucher c,ampuero f o,et al.polymeric nanoparticles for increasing oral bioavailability ofcurcumin[j].antioxidants(basel),2018,7(4):46.)；eudragit可以保护药物不被酸性条件破 坏，rajasree(rajasree p h,paul w,sharma c p,et al.eudragit encapsulated cationic poly (lactic-co-glycolic acid)nanoparticles in targeted delivery of capecitabine for augmentedcolon carcinoma therapy[j].journal of drug delivery science and technology,2018,46: 302-311.)等用s100涂覆在载药的plga nps表面，作为一种新型靶向给药系统 治疗结肠癌，许(xu b h,zhang w j,chen y l,et al.l100-coated mannosylatedchitosan nanoparticles for oral protein vaccine delivery[j].international journal of biologicalmacromolecules,2018,113:534-542.)等用bsa负载的l100覆盖的甘露糖化壳聚 糖nps进行口服免疫，发现可引起更佳的系统性igg和黏膜iga抗体反应。
[0007]
目前抗狂犬病毒口服疫苗的相关研究较少见，更未见能够应对恶劣的胃肠道环境的相 关口服疫苗。


技术实现要素：

[0008]
本发明针对上述问题进行，致力于开发一种口服狂犬病病毒样颗粒疫苗，递送蛋白质 类药物的口服提供了一种设计思路。
[0009]
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
[0010]
本发明首先制备口服狂犬病病毒样颗粒疫苗rvlps/eplga mps，对其进行体外表征 后，随后将冷冻干燥的rvlps/eplga mps灌胃小鼠进行免疫原性评价，对疫苗产生的细 胞免疫反应作出初步评价。
[0011]
本发明的第一方面，提供了一种口服狂犬病病毒样颗粒疫苗，包括广谱性狂犬病病毒 样颗粒抗原以及药物载体。其中，广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原包括cvs株狂犬病病毒 糖蛋白rvgp和基质蛋白rvmp，cvs株狂犬病病毒糖蛋白rvgp的多核苷酸序列如seq id no.1所示，所述基质蛋白rvmp的多核苷酸序列如seq id no.2所示，
[0012]
药物载体为由plga与l100组成的混合载体，l100与plga的 质量比1:5～1:1；广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原与plga的浓度比为1:5～1:10。
[0013]
优选的，l100与plga的质量比1:2，广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原与plga 的浓度比为1:10。
[0014]
优选的，广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原的浓度为5mg/ml，plga的浓度为 25～50mg/ml，更优选plga的浓度为50mg/ml。
[0015]
优选的，口服狂犬病病毒样颗粒疫苗中还包括黏膜免疫佐剂ltb，该ltb含量为 20
～100ug/ml。
[0016]
本发明的第二方面，提供了上述口服狂犬病病毒样颗粒疫苗的制备方法，包括如下步 骤：
[0017]
1)将广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原与ltb同时加入到溶解有plga的乙酸乙酯和溶 解有l100的乙醇的混合油相中，涡旋震荡后形成o/w1型初乳，所述广谱性狂 犬病病毒样颗粒抗原的体积与乙酸乙酯以及乙醇的体积比为2:10:5；
[0018]
2)获得的初乳在磁力搅拌作用下滴加到10～12倍体积的1％pva中，形成w2/o/w1 型复乳；
[0019]
3)在4℃下继续搅拌复乳至少4h，挥发有机溶剂，得到固化后的颗粒rvlps/eplga mps；
[0020]
4)固化好的rvlps/eplga mps于4℃，300rpm离心收集，用超纯水清洗，洗净 rvlps/eplga mps表面的pva和未包裹的抗原，并收集所有离心的上清液；
[0021]
5)用适量无菌pbs重悬rvlps/eplga mps，于4℃、-20℃和-80℃梯度冻结实， 真空冷冻干燥24h后，密封好置于-20℃保存备用。
[0022]
优选的，步骤1)中，广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原的浓度为5mg/ml，plga的浓 度为50mg/ml，l100的浓度为25mg/ml。
[0023]
优选的，步骤2)中，磁力搅拌的转速为300～400rpm。
[0024]
优选的，步骤4)中，采用超纯水清洗的次数为3次。
[0025]
该制备条件通过正交实验得到，实验结果表明，当plga浓度为50mg/ml，搅拌转 速为300rpm，1％pva体积为20ml，plga与el100的质量比为2:1时获得最佳包封率 (encapsulation efficieny,ee)，包封率为97.14
±
1.37％。
[0026]
依次对根据上述方法制备的口服狂犬病病毒样颗粒疫苗rvlps/eplga mps进行体 外表征、稳定性分析、体外释放实验以及小鼠肠道滞留时间分析。
[0027]
体外表征结果显示，刚制备好的rvlps/eplga mps呈规则的球形，且大小均一性良 好(图2a)。sem结果表明所制备的rvlps/eplga mps经真空冷冻干燥后，表面平整， 呈相对规则的球形，平均粒径在168.20
±
39.28μm的范围内(图2b)。
[0028]
稳定性结果显示，ltb和rvlps被成功包封在eplga mps中，rvlps粒径与形态 并没有发生改变，并且ltb和rvlps的天然二级结构没有发生改变。在4℃条件下保存 3个月后，形态和包封率均没有明显变化。
[0029]
模拟体内胃(ph1.2)和肠道(ph6.8)环境中的药物释放结果显示，与plga mps相比， eplga mps递送系统具有ph依赖性的药物控释模式，eplga mps有效的实现了大部分 目的蛋白在ph6.8的pbs中缓慢释放，很好的克服了胃的恶劣环境对蛋白的变性作用， 将目的蛋白顺利递送至肠道部位(图4)。
[0030]
小鼠肠道滞留时间分析，给药5h时已累计释放出来约20％的mcherry，其中大约10％ 的mcherry在胃中释放而变性失活，而在肠道中释放出的mcherry也会因为肠道中的蛋 白酶的作用而部分失活；口服给药10h后，剩余没有被降解的微球直接离开小肠到达蛋白 酶含量低的大肠。本发明制备的eplga mps可以克服胃的酸性环境，成功将蛋白递送至 肠道。
[0031]
对balb/c小鼠进行口服免疫的结果表明，rvlps能够诱导机体产生相应的抗原特异 性体液、细胞和黏膜免疫应答，且rvlps和ltb负载在eplga mps中联合给药能诱导 机体
产生更强的免疫应答。免疫应答在第3次免疫达到最高水平。小鼠的体重和主要器官 的he染色结果表明本实验的疫苗成分具有良好的安全性。
[0032]
本发明的有益效果如下：
[0033]
本发明以cvs株狂犬病病毒(rabies virus,rabv)的糖蛋白(rabies virus glycoprotein, rvgp)和基质蛋白(rabies virus matrix protein,rvmp)自组装成的rvlps为抗原，利用 l100与plga为主要材料来制备口服耐酸缓微球，可以在肠道缓慢释放出rvlps， 具有纳米结构的rvlps可以很快被肠道m细胞以及其他apc摄取。具有高密度抗原表位 的rvlps与黏膜佐剂ltb连用，能够提高口服rvlps的抗原性，增强免疫效果。
[0034]
本发明通过设计适于经口服递送一直到肠道给药的蛋白类药物载体，使其能够顺利克 服胃肠道的各种生理障碍直接递送至肠道，在肠道ph条件下响应释放抗原。对其引发的 免疫效果进行初步的免疫学评价，结果显示，rvlps能够诱导机体产生相应的抗原特异性 体液、细胞和黏膜免疫应答，且rvlps和ltb负载在eplga mps中联合给药能诱导机体 产生更强的免疫应答；免疫应答在第3次免疫达到最高水平；小鼠的体重和主要器官的he 染色结果表明本实验的疫苗成分具有良好的安全性。
[0035]
本研究制备的到的口服狂犬病病毒样颗粒(rabies virus like particles,rvlps)疫苗可以 提高蛋白类药物的实际利用效率，提高疫苗的治疗或预防效果，有望为我国扩大狂犬病疫 苗接种范围、从动物源头上消灭狂犬病，从而限制和防止rabv在陆地食肉动物种群之间 传播，并降低感染扩散到家畜和人类种群的风险，提高疫苗安全性，为研发新型病毒样颗 粒口服亚单位疫苗奠定重要基础。
附图说明
[0036]
图1为口服狂犬病病毒样颗粒(rvlps)疫苗rvlps(ltb)/eplga mps的制备及其诱导 的黏膜免疫反应机制。
[0037]
图2为rvlps/eplga mps的形貌，倒置显微镜(a)和扫描电镜(b)观察rvlps/eplga 微球的形态。
[0038]
图3为eplga mps中rvlps/ltb蛋白的完整性分析，其中：(a)ftir光谱；(b)cd 光谱；(c)tem。
[0039]
图4为rvlps/eplga mps的存储稳定性分析，其中：不同储存条件下rvlps/eplgamps的包封率(a)和外观(b)。
[0040]
图5为rvlps/eplga mps的体外释放结果。
[0041]
图6为口服mcherry/eplga mps后小鼠胃肠道离体成像图。
[0042]
图7为血清中anti-rvlps igg抗体亚型的含量，其中：(a)igg；(b)igg1；(c)igg2a； (d)igg1/igg2a比值。
[0043]
图8为粪便及肠液中anti-rvlps siga抗体的含量，其中：(a)粪便anti-rvlps siga 抗体；(b)第三次免疫后肠液中anti-rvlps siga抗体。
[0044]
图9为不同给药小鼠血清中inf-γ和il-4的表达水平，其中：(a)inf-γ；(b)il-4。
[0045]
图10为小鼠体重的变化及主要器官的组织学检测结果。
具体实施方式
[0046]
下面结合本发明的附图和实施例对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发 明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护 范围不限于下述的实施例。
[0047]
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本技术中所用的表示用量、百分 比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除 非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会 根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的 有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
[0048]
实施例1口服狂犬病病毒样颗粒疫苗rvlps/eplga mps制备
[0049]
1、口服狂犬病病毒样颗粒疫苗rvlps/eplga mps
[0050]
该口服狂犬病病毒样颗粒疫苗，包括广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原以及药物载体。其 中，广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原包括cvs株狂犬病病毒糖蛋白rvgp和基质蛋白rvmp， cvs株狂犬病病毒糖蛋白rvgp的多核苷酸序列如seq id no.1，基质蛋白rvmp的多 核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0051]
药物载体为由plga与l100组成的混合载体，l100与plga的 质量比1:5～1:1，优选1:2。广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原与plga的浓度比为1:5～1:10， 优选1:10；浓度方面，广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原的浓度为5mg/ml，plga的浓度为 25～50mg/ml。
[0052]
优选的，口服狂犬病病毒样颗粒疫苗中还包括黏膜免疫佐剂ltb，rvlps与黏膜佐 剂ltb连用，能够提高口服rvlps的抗原性，增强免疫效果。
[0053]
2、疫苗制备
[0054]
图1显示了口服狂犬病病毒样颗粒(rvlps)疫苗rvlps(ltb)/eplga mps的制备及 其诱导的黏膜免疫反应机制。上述口服狂犬病病毒样颗粒疫苗的制备流程包括如下步骤：
[0055]
1)将广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原单独或与ltb共同加入到溶解有plga的乙酸乙 酯和溶解有l100的乙醇的混合油相中，涡旋震荡后形成o/w1型初乳；
[0056]
2)获得的初乳在磁力搅拌作用下滴加到10～12倍体积的1％pva中，形成w2/o/w1 型复乳；
[0057]
3)在4℃下继续搅拌复乳至少4h，挥发有机溶剂，得到固化后的颗粒rvlps(ltb) /eplga mps；
[0058]
4)固化好的rvlps(ltb)/eplga mps于4℃，300rpm离心收集，用超纯水清洗， 洗净rvlps/eplga mps表面的pva和未包裹的抗原，并收集所有离心的上清液；
[0059]
5)用适量无菌pbs重悬rvlps(ltb)/eplga mps，于4℃、-20℃和-80℃梯度冻 结实，真空冷冻干燥24h后，密封好置于-20℃保存备用。
[0060]
3、组分优化
[0061]
以包封率(encapsulation efficieny,ee)为标准，对plga的浓度、plga和el100质量 比、1％pva的体积以及磁力搅拌器的搅拌转速进行优化，设计4因素3水平的正交实验 (表1)。利用bca法检测上清中游离rvlps的浓度，ee的计算公式如下：
[0062]
ee(％)＝(投放rvlps总量-上清中rvlps量)/投放rvlps总量
×
100％
[0063]
表2表明最优实验组合为a3b3c2d2，即当plga浓度为50mg/ml，搅拌转速为 300rpm，1％pva体积为20ml，plga与el100的质量比为2：1时获得最佳ee。优化 后rvlps/eplga mps包封率为97.14
±
1.37％。
[0064]
当plga浓度为12.5mg/ml时，无论其他条件如何，ee都很低，可能是因为低浓度 的plga无法和蛋白水溶液相互饱和；当1％pva的体积过大时，得到的ee也不理想， 可能是过多的外水相大大降低了plga的浓度；当plga与el100的质量比为1时，ee 不高可能是因为过量el100加入后，会与plga一起成膜析出，使得油相和水相不能相 互饱和。
[0065]
表1正交设计的因素和水平
[0066][0067]
注：保持plga总量和搅拌时间不变。
[0068]
表2正交实验l9(34)结果
[0069][0070]
实施例2 rvlps/eplga mps体外表征
所示，rvlps/eplga mps在37℃存储1周后就出现明显的皱缩与聚集，说明37℃不适 合rvlps/eplga mps的存储，而在4℃和25℃下保存3个月后，其形态基本保持不变。 故取4℃和25℃不同储存时间段的rvlps/eplga mps各10mg，pbs裂解后，用bca 试剂盒测定蛋白含量并计算ee。结果如图4a所示，rvlps/eplga mps在4℃存储3个 月后，ee仅有轻微下调，且与第0天没有统计学差异。但是，rvlps/eplga mps在25℃ 存储过程中，ee随时间的延长而逐渐降低，直至3个月，ee下降了约15％。因此，4℃ 更适合rvlps/eplga mps的保存。
[0081]
实施例3 rvlps/eplga mps体外释放实验
[0082]
取10mg rvlps/eplga mps加入1ml释放介质中，并在100rpm，37℃中孵育，按 照预定的时间间隔以12000rpm，10min收集上清，补充等体积的新鲜pbs，测定上清液 中rvlps的量。
[0083]
由于rvlps/eplga mps以灌胃的方式进行给药，因此有必要模拟体内胃(ph1.2)和 肠道(ph6.8)环境中的药物释放。如图5所示，与plga mps相比，eplga mps递送系统 具有ph依赖性的药物控释模式，rvlps/eplga mps和ltb/eplga mps在ph1.2时2h 内仅释放不到10％的目的蛋白，而rvlps/plga mps在ph1.2时2h内突释了接近70％的 目的蛋白。虽然在模拟肠液中两种mps在24h内累积释放了约95％的目的蛋白，但eplgamps有效的实现了大部分目的蛋白在ph6.8的pbs中缓慢释放，很好的克服了胃的恶劣 环境对蛋白的变性作用，将目的蛋白顺利递送至肠道部位。
[0084]
实施例4 rvlps/eplga mps小鼠肠道滞留时间
[0085]
制备负载樱桃红荧光蛋白(mcherry)(激发/发射波长为580nm/610nm)的eplga mps ——mcherry/eplga mps。灌胃前将balb/c小鼠禁食12h但正常供水，然后用pbs重悬 mcherry/eplga mps(100μl)进行灌胃，并在灌胃后第0.5、1.5、3、5、10h分别解剖小鼠， 剥离胃肠道器官，利用kodak活体动物成像系统进行拍照观察。
[0086]
将mcherry/eplga mps灌胃小鼠后，在特定的时间点解剖小鼠取出胃肠道拍照。如 图6所示，当给药0.5h后，mcherry/eplga mps都集中在胃部，1.5h后，mcherry/eplgamps开始由胃缓慢向十二指肠流动，直至3h，微球全部离开胃，到达小肠，并逐渐从十 二指肠向回肠流动。由于肠道的偏中性环境，会使得mcherry/eplga mps被降解，释放 mcherry并被m细胞摄取，所以在5h时，位于空肠和回肠的荧光强度会稍有减弱。5h 时已累计释放出来约20％的mcherry，其中大约10％的mcherry在胃中释放而变性失活， 而在肠道中释放出的mcherry也会因为肠道中的蛋白酶的作用而部分失活，口服给药10h 后，剩余没有被降解的微球直接离开小肠到达蛋白酶含量低的大肠。本研究所制备的 eplga mps可以克服胃的酸性环境，成功将蛋白递送至肠道。
[0087]
实施例5 rvlps(ltb)/eplga mps疫苗免疫效果
[0088]
1、实验方法
[0089]
(1)将rvlps/eplga mps灌胃接种6-8周龄的spf级雌性balb/c小鼠。将小鼠按照 表3进行随机分组，做好标记。小鼠适应一周后，免疫前12h禁食但自由饮水，于第7、 第21和第35天进行灌胃免疫，并对其产生的免疫应答进行评价。
[0090]
(2)小鼠体重的测定：免疫前称量1次体重，之后每7天在固定时间称量1次，直至 第3次免疫结束共记录6次，分析小鼠体重变化情况。
[0091]
(3)小鼠粪便的收集以及抗原特异性siga的检测。
[0092]
(4)小鼠血清的收集以及抗原特异性igg、igg1和igg2a抗体、细胞因子ifn-γ和il-4 以及小鼠外周血中cd4

t和cd8

t细胞的检测。
[0093]
(5)小鼠肠液的收集以及抗原特异性siga抗体的检测。
[0094]
(6)小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾和小肠)的病理组织学检测。
[0095]
表3动物实验分组及给药剂量
[0096][0097]
取样操作方面：
[0098]
步骤(3)中小鼠粪便中的收集包括如下步骤：
[0099]
①
收集：免疫前和每次免疫后1周，使用洁净的镊子随机采集15粒小鼠粪便，放入 灭菌的ep管中，做好标记，置于-80℃保存备用，一式三份；
[0100]
②
处理：从-80℃取出小鼠粪便，用注射器芯碾碎粪便后，加入500μl灭菌pbs不断 吹打至充分溶解，在4℃，12000rpm离心5min，收上清，做好标记，-80℃保存，用于 rvlps特异性siga分析。
[0101]
步骤(4)中，小鼠血液的收集包括如下步骤：
[0102]
①
收集：免疫前和前两次免疫后1周，用毛细玻璃管刺入小鼠眼眶内收集血液；第3 次免疫后1周，使用灭菌的镊子快速摘取眼球收集血液；
[0103]
②
处理：将血液样品于4℃静置12h，随后在4℃，1000rpm离心30min，吸取血清 到灭菌的ep管中，做好标记，于-80℃保存，用于rvlps特异性抗体igg、igg1和igg2a 的分析，第3次免疫后1周的血清还要用于il-4和ifn-γ分析，以及第3次免疫后1周 的小鼠外周血中cd4 t和cd8 t细胞的检测。
[0104]
步骤(5)中，小鼠肠液的收集包括如下步骤：
[0105]
①
收集：第3次免疫后1周，用75％的酒精对颈椎脱臼法处死的小鼠进行消毒，无菌 截取小肠肠段，手术刀划开使肠内壁暴露，置于无菌ep管中；
[0106]
②
处理：向装有小肠的ep中加入1ml无菌pbs溶液，涡旋振荡15min，并在4℃， 12000rpm离心10min，收集上清，于-80℃保存，用于rvlps特异性siga分析。
[0107]
检测方面：
[0108]
rvlps特异性抗体igg、igg1、igg2a和siga的检测，方法如下：
[0109]
①
包被：用pbs将rvlps稀释到5μg/ml，向96孔板中加入稀释后的rvlps(100μl/ 孔)，4℃包被过夜；
[0110]
②
封闭：向反应孔中加入200μl 1％bsa，37℃孵育2h；
[0111]
③
加样：分别加入100μl粪便提取液和肠液和用1％bsa稀释(1：100)的血清，37℃ 孵育2h；
[0112]
④
加酶标二抗：向反应孔中加入100μl用1％bsa稀释(1：10000)的偶联hrp的山 羊抗小鼠多克隆抗体，37℃孵育1h；
[0113]
⑤
加底物液显色：加入100μl显色液，37℃避光孵育20min；
[0114]
⑥
终止反应：加入100μl 1m h2so4混匀后检测od值(490nm)。
[0115]
⑦①‑④
步每次结束后都用pbst洗涤6次。
[0116]
细胞因子ifn-γ或il-4的检测，根据il-4和ifn-γ试剂盒的说明书，方法如下：
[0117]
①
使用前，将所有试剂充分混匀，避免产生泡沫；
[0118]
②
根据实验孔(空白和标准品)数量，确定所需的板条数目。样本(含标准品)和空白都 应做复孔；
[0119]
③
加样：100μl/well加入稀释后的cytokine standard至标准品孔，100μl/well加入 样本至样本孔，100μl/well加入dilution buffer r(1
×
)至空白对照孔；
[0120]
④
加检测抗体：50μl/well加入biotinylated antibody工作液。混匀后，盖上封板膜， 37℃温育90min；
[0121]
⑤
洗板：扣去孔内液体，300μl/well加入1
×
washing buffer工作液；停留1min后 弃去孔内液体。重复4次，每一次在滤纸上扣干；
[0122]
⑥
加酶：100μl/well加入streptavidin-hrp工作液。盖上封板膜，37℃温育30min；
[0123]
⑦
洗板：重复步骤5；
[0124]
⑧
显色：100μl/well加入tmb，37℃避光温育5-30min，根据孔内颜色的深浅(深蓝 色)来判定终止反应；
[0125]
⑨
终止反应：100μl/well迅速加入stop solution终止反应。
[0126]
2、结果分析
[0127]
2.1血清特异性igg抗体亚型
[0128]
不同特异性抗体亚型可在一定程度上反应机体所响应的免疫应答水平。结果如图7 所示，与saline组相比，eplga mps和ltb/eplga mps在免疫后均不会产生抗原特异 性抗体。
[0129]
第1次免疫后，所有组的血清中均没有检测到特异性igg抗体(图7a)。加强免疫后， 除了rabisin(i.g.)组检测不到特异性igg抗体外，其他组均诱导显著增强的特异性igg抗 体反应。其中，rvlps组igg抗体含量是saline组的2.27倍(p《0.001)；rvlps ltb、 rvlps/eplga mps和rvlps ltb/eplga mps 3组之间的igg抗体含量没有统计学差异， 但分别是rvlps组的1.43、1.56和1.66倍(p《0.001)；rvlps ltb/eplga mps和 (rvlps ltb/eplga mps)
×
2组的igg抗体含量也没有统计学差异，但(rvlps ltb /eplga mps)
×
2组是rvlps/eplga mps组的1.21倍(p《0.01)；rabisin(i.m.)组的igg抗 体含量最高，是(rvlps ltb/eplga mps)
×
2组的1.67倍(p《0.001)。第3次免疫后， rvlps ltb/eplga mps和(rvlps ltb/eplga mps)
×
2组特异性igg抗体含量最高，但 是这两组没有统计学差异。(rvlps
1.26和1.23倍(p《0.01)；rvlps ltb/eplga mps组的siga含量是rvlps/eplga mps 组的1.22倍(p《0.01)；(rvlps ltb/eplga mps)
×
2组的siga含量则分别是 rvlps ltb/eplga mps和rabisin(i.g.)组的1.33和1.54倍(p《0.001)。第2次免疫后， rvlps、rvlps ltb和rvlps/eplga mps组的siga含量没有差异，但是saline组的1.8、 2.03和2.39倍(p《0.001)；rvlps/eplga mps和rvlps ltb/eplga mps组没有差异， rvlps ltb/eplga mps组是rvlps ltb组的1.46倍(p《0.01)；rvlps ltb/eplga mps 组和(rvlps ltb/eplga mps)
×
2组也没有差异，(rvlps ltb/eplga mps)
×
2组是 rvlps/eplga mps和rabisin(i.g.)组的1.32和1.35倍(p《0.01)。第3次免疫后，rvlps 和rvlps ltb组的siga含量没有统计学差异，但分别是saline组的2.1和2.16倍 (p《0.001)；而rvlps/eplga mps组是rvlps ltb组的1.44倍(p《0.001)， rvlps ltb/eplga mps组是rvlps/eplga mps组的1.73倍(p《0.001)， (rvlps ltb/eplga mps)
×
2组是rvlps ltb/eplga mps和rabisin(i.g.)组的1.87和 4.07倍(p《0.001)。
[0137]
第3次免疫后，所有实验组肠液中的特异性siga抗体水平都显著增强(p《0.001)，其 中(rvlps ltb/eplga mps)
×
2组诱导的特异性黏膜免疫应答最显著，是 rvlps ltb/eplga mps和rabisin(i.g.)组的1.16(p《0.01)和1.70倍(p《0.001)(图8b)。
[0138]
以上实验结果表明口服rvlps可以激起机体产生黏膜特异性siga抗体，ltb佐剂可 以增强抗原诱导的黏膜免疫应答水平，经eplga mps包裹后产生的免疫效果更好。当 rvlps/eplga mpa和ltb/eplga mps以2倍剂量共同口服递送时，可以产生最佳的免 疫效果，分析是由于eplga mps的缓释作用，可以实现抗原的持续刺激，从而产生更持 久的免疫应答，所以其产生的黏膜免疫应答要显著高于rabisin(i.g.)组。
[0139]
2.3血清中inf-γ和il-4检测
[0140]
第3次免疫后，小鼠血清中的inf-γ和il-4趋势基本一致(图9)。eplga mps与 ltb/eplga mps相比于saline组也能诱导显著增强的ifn-γ和il-4水平(p《0.001)。其中 rabisin(i.m.)与rabisin(i.g.)组的ifn-γ水平没有差异，但rabisin(i.m.)组il-4水平是rabisin(i.g.)组的1.78倍(p《0.001)。虽然rvlps和rvlps ltb诱导机体产生的ifn-γ是 ltb/eplga mps组的1.44和1.46倍(p《0.001)，但是它们诱导机体产生的il-4水平与 ltb/eplga mps组没有统计学差异。rvlps/eplga mps组的ifn-γ和il-4水平分别是 rvlps ltb组的1.15(p《0.01)和1.17倍(p《0.001)。rvlps ltb/eplga mps和 (rvlps ltb/eplga mps)
×
2组诱导机体产生最高水平的ifn-γ和il-4，但是这两组之间 没有显著差异。(rvlps ltb/eplga mps)
×
2组的inf-γ水平分别是rvlps/eplga mps、 rabisin(i.m.)和rabisin(i.g.)组的1.14(p《0.01)、1.18(p《0.001)和1.14倍(p《0.001)； (rvlps ltb/eplga mps)
×
2组的il-4水平则是rvlps/eplga mps组的1.43倍(p《0.001)， 而与rabisin(i.m.)组没有差异，是rabisin(i.g.)组的1.78倍(p《0.001)。
[0141]
以上结果表明，rvlps可以增强血清细胞因子的表达水平，当rvlps/eplga mpa 和ltb/eplga mps联合给药时，其刺激机体产生的细胞因子水平没有剂量依赖性，但 ifn-γ和il-4水平比rabisin(i.g.)组高(p《0.001)，虽然其产生il-4水平与rabisin(i.m.)组没 有统计学差异，但ifn-γ水平显著高于rabisin(i.m.)组(p《0.001)。
[0142]
2.4外周血cd4

和cd8

t细胞含量的变化
[0143]
第3次免疫后，对小鼠外周血中cd4

和cd8

t细胞含量进行分析(表4)，当cd4

和cd8

t的比值升高，说明记性t淋巴细胞免疫应答被激活(wahlin b,sander b, christensson b,b,et al.entourage:the immune microenvironment followingfollicular lymphoma[j].blood cancer journal,2012,2(1):e52.)。
[0144]
本发明中，saline、eplga mps、ltb/eplga mps、rvlps与rabisin(i.g.)组的外 周血中cd4

t与cd8

t比值不具有统计学差异，说明口服rvlps和rabisin不能刺激 机体产生显著的细胞免疫应答。虽然rvlps ltb组的cd4

和cd8

t比值与rvlps组没 有差异，但比saline组高1.06倍(p《0.01)。rvlps ltb组和rvlps/eplga mps组的cd4

和cd8

t比值也不具有统计学差异，但是rvlps组的1.02和1.08倍(p《0.01)。 rvlps/eplga mps与rvlps ltb/eplga mps组也没有统计学差异，但cd4

和cd8

t 比值是rvlps ltb组的1.06和1.11倍(p《0.01)，说明rvlps经eplga mps包裹后能够 刺激机体产生显著的细胞免疫应答，且佐剂ltb具有增强细胞免疫应答的能力。 (rvlps ltb/eplga mps)
×
2组的cd4

和cd8

t比值增加最显著，是 rvlps ltb/eplga mps组的1.09倍(p《0.01)，表明两倍剂量的抗原和佐剂以eplgamps包裹共同给药能诱导更强的细胞免疫应答。然而，rabisin(i.m.)组诱导的细胞免疫应 答最显著，是(rvlps ltb/eplga mps)
×
2组的1.14倍(p《0.001)。
[0145]
表4免疫后cd4

t与cd8

t细胞含量的平均值及比率
[0146][0147]
3、小鼠生物安全性评价
[0148]
为了评价疫苗成分是否会对小鼠的正常生命活动产生影响，我们在免疫前以及免疫后 对小鼠的体重进行了测量与记录。如图10a所示，各组小鼠体重均保持正常增长，部分 小鼠体重出现下降可能是因为灌胃对小鼠食道造成了一定的损伤，使小鼠减少了食物的摄 入，但是体重很快就恢复正常增长，说明所制备的疫苗不会对小鼠的正常生长产生显著影 响。免疫结束后，无菌取出各组小鼠的主要器官，通过he染色观察主要器官的形态。相 比于saline组，各给药组小鼠的主要器官没有明显的组织形态学变化(图10b)，充分说明 疫苗成分不会对小鼠的正常生命活动产生不良影响。
[0149]
综上，在研究中，我们利用eplga mps分别负载rvlps和ltb，对它们联合给药 后产生的黏膜和系统免疫效果进行评价。制备得到的rvlps/eplga mps为表面光滑、大 小均一
(168.20
±
39.28μm)的球形或椭圆形。mcherry/eplga mps经灌胃后，在不同时间点 取出小鼠肠道进行成像，荧光分布表明所制备的eplga mps能够顺利离开胃到达肠道并 释放抗原。体外释放实验表明，eplga mps具有ph响应性，在ph1.2条件下2h内基本 完整，仅释放不到10％的抗原，而在ph6.8条件下缓慢裂解并释放出rvlps，24h内累积 释放率约为95％。最重要的是，ftir和cd光谱结果表明，eplga mps负载的rvlps 和ltb的天然结构不会改变，而且至少能在4℃条件下稳定保存3个月。
[0150]
对balb/c小鼠进行口服免疫的结果表明，rvlps能够诱导机体产生相应的抗原特异 性体液、细胞和黏膜免疫应答，且rvlps和ltb负载在eplga mps中联合给药能诱导 机体产生更强的免疫应答。免疫应答在第3次免疫达到最高水平。首先， rvlps ltb/eplga mps和(rvlps ltb/eplga mps)
×
2组诱导的抗原特异性igg含量 没有统计学差异，但是显著高于其他实验组，且是rabisin(i.m.)组的1.36和1.35倍(p《0.001)。 其次，(rvlps ltb/eplga mps)
×
2组的抗原特异性igg1和igg2a抗体含量显著高于其 他实验组和rabisin(i.g.)组(p《0.001)，且igg1与igg2a比值大于1，说明倾向th2型免疫 应答；而rabisin(i.m.)组的igg1和igg2a抗体含量是(rvlps ltb/eplga mps)
×
2组的 1.59和2.01倍(p《0.001)。此外，(rvlps ltb/eplga mps)
×
2组的cd4 与cd8 t比值 比其他实验组和rabisin(i.g.)组显著增加(p《0.001)，但是rabisin(i.m.)组免疫后的cd4 与 cd8 t比值是(rvlps ltb/eplga mps)
×
2组的1.14倍(p《0.001)。说明 (rvlps ltb/eplga mps)
×
2在所有实验组中能诱导最强的细胞免疫应答，虽然低于 rabisin(i.m.)组，但是显著高于rabisin(i.g.)组。
[0151]
第3次免疫后，除了rabisin(i.m.)组，所有实验组和rabisin(i.g.)组的siga含量都显 著增高，其中(rvlps ltb/eplga mps)
×
2组的粪便和肠液中抗原特异性siga效价最高。 (rvlps ltb/eplga mps)
×
2组粪便中siga含量是rvlps ltb/eplga mps和 rabisin(i.g.)组的1.87和4.07倍(p《0.001)，而肠液中siga抗体含量是rvlps ltb/eplgamps和rabisin(i.g.)组的1.16(p《0.01)和1.70倍(p《0.001)。以上结果表明口服rvlps可以 刺激机体产生黏膜特异性siga抗体，当rvlps/eplga mpa和ltb/eplga mps以两倍 剂量共同口服递送时，可以产生最佳的免疫效果。其次，相比于其他实验组， rvlps ltb/eplga mps和(rvlps ltb/eplga mps)
×
2组诱导机体产生最高水平的 ifn-γ和il-4(p《0.001)。rvlps ltb/eplga mps和(rvlps ltb/eplga mps)
×
2组的 inf-γ水平分别是rvlps/eplga mps和rabisin(i.m.)组的1.11倍(p《0.01)和1.14倍 (p《0.001)，il-4水平分别是rvlps/eplga mps和rabisin(i.g.)的1.40倍(p《0.001)和1.43 倍(p《0.001)，而与rabisin(i.m.)组没有差异。以上结果表明，口服rvlps ltb/eplga mps 能强机体细胞因子的表达水平，其效果要高于市售疫苗，但是不具有剂量依赖性。最后， 小鼠的体重和主要器官的he染色结果表明本实验的疫苗成分的良好安全性。
[0152]
本发明中，rvgp的氨基酸序列(seq id no.1)
[0153]
mvpqallfvpllvfplcfgkfpiytipdklgpwspidihhlscpnnlvvedegctnlsgfs ymelkvgyilaikmngftctgvvteaetytnfvgyvtttfkrkhfrptpdacraayn wkmagdpryeeslhnpypdyhwlrtvkttkeslviispsvadldpydrslhsrvfpsgk cpgvavsstycstnhdytiwmpenprlgmscdiftnsrgkraskgsetcgfvderglyk slkgacklklcgvlglrlmdgtwvamqtsnetkwcppdqlvnlhdfrsdeiehlvve elvrkreecldalesimttksvsfrrlshlrklvpgfgkaytifnktlmeadahyksvr twneilpskgclrvgg
rchphvngvffngiilgpdgnvlipemqssllqqhmellessvi plvhpladpstvfkdgdeaedfvevhlpdvhnqvsgvdlglpnwgkyvllsagalta lmliiflmtccrrvnrseptqhnlrgtgrevsvtpqsgkiissweshksggqtrl
[0154]
rvmp的氨基酸序列(seq id no.2)
[0155]
mnflrkivkncrdedtqkpspvsaplddddlwlpppeyvplkeltskknmrnfcidgg vkvcspngysfrilrhilksfdeiysgnhrmiglvkvviglalsgspvpegmnwvyklr rtfifqwadsrgplegeeleysqeitwdddtefvglqirviakqchiqgriwcinmnpra cqlwsdmslqtqrseedkdssllle
[0156]
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施 例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型 或替换，这些等同的变型或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。