一种PPV检测的crRNA引物对、CRISPRCas12a系统及应用方法与流程

技术特征：
1.一种ppv检测的crrna引物对、crisprcas12a系统及应用方法，其特征在于：包括以下步骤：s1、组织样品的处理：将称取约1g的各组织样品，加入1ml pbs后放入研磨钵中研磨成匀浆，转移至无菌离心管中，在离心机中以12000rpm/min离心3min；s2、病毒核酸的提取：使用某生化科技有限公司的病毒基因组dna/rna提取试剂盒对病毒进行核酸提取；s3、引物设计：在genbank中检索猪细小病毒全基因组，通过meglign软件分析比对，确定猪细小病毒全基因组中高度保守片段为vp2基因，使用primer premier 5软件，设计vp2基因的全长引物，根据猪细小病毒全基因组中高度保守片段vp2基因，使用crispr-dt网站中cpf1引物设计软件设计猪细小病毒vp2基因的crrna引物，并委托某生物公司合成生产；s4、pcr扩增：根据猪细小病毒vp2基因全长片段，使用primer premier 5软件设计全长引物，进行pcr扩增，扩增片段为1658bp；s5、pcr产物回收及纯化：根据sanprep柱式dna胶回收试剂盒说明书提取步骤操作，把扩增产物回收备用；s6、标准质粒的构建：根据takara公司的pmd
tm
19t vector cloning kit使用说明书，构建pmd
tm
19t-vp2重组质粒；s7、重组质粒鉴定：取部分培养菌液，委托某生物公司进行测序服务，并在ncbi网站的blast功能和meglign软件与vp2基因全长进行比对分析；s8、质粒dna小量抽提：根据sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒使用说明书，提取构建的pmd
tm
19t-vp2重组质粒备用；s9、crrna纯化s91、双链dna的合成：将上述合成的crrna单链退火成双链，反应体系为50μl，95℃退火5min，自然冷却至室温；s92、转录：将退火得到的双链进行转录，转录体系如下，转录所需dna模板的用量应在0.1-1μg，轻轻混匀各组分，短暂离心，pcr仪37℃孵育2h，程序结束后，加入1μl的dnaseⅰ，37℃水浴消化15min，去除模板dna；s93、crrna纯化：将转录产物进行纯化；s10、猪细小病毒crispr/cas12a可视化体系建立：对设计的四对猪细小病毒crrna引物进行筛选，对比结果；s11、灵敏度试验：测量出重组质粒浓度，根据拷贝数浓度(copies/μl)＝[6.02
×
10
23
×
浓度(ng/μl)
×
10-9
]/[dna长度
×
660]公式，计算拷贝数浓度，以10倍浓度倍比稀释vp2基因重组质粒(pmd
tm
19t-vp2)，稀释浓度为3.75
×
100copies/μl、3.75
×
101copies/μl、3.75
×
102copies/μl、3.75
×
103copies/μl、3.75
×
104copies/μl、3.75
×
105copies/μl、3.75
×
106copies/μl、3.75
×
107copies/μl、3.75
×
108copies/μl、3.75
×
109copies/μl并使用灭菌水(ddh2o)作为实验的阴性对照，反应体系使用本实验建立的体系进行灵敏度验证并将扩增产物在紫外灯下进行观察；s12、特异性试验：使用猪流行性腹泻病毒，猪瘟疫苗病毒，猪蓝耳疫苗病毒，猪伪狂犬病毒，猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的核酸为模板，阴性和阳性对照分别使用ddh2o和ppv的阳性样本，验证该方法的特异性并将扩增产物在紫外灯下进行观察。
2.根据权利要求1所述的一种ppv检测的crrna引物对、crisprcas12a系统及应用方法，其特征在于：所述步骤s2具体过程如下：s21、用移液器将20μl proteinase k加入一个干净的1.5ml离心管；s22、向离心管中加入200μl血清；s23、加入200μl carrier rna工作液，盖上管盖，涡旋振荡15sec混匀；s24、在56℃孵育15min，简短离心以收集附着在管壁及管盖上的液体；s25、加入250μl无水乙醇，此时可能会出现絮状沉淀，盖上管盖并涡旋振荡15sec，彻底混匀，在室温下(15-25℃)放置5min；s26、简短离心以收集附着在管壁及管盖上的液体；s27、仔细将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至rnase-free吸附柱cr2中，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；s28、小心打开吸附柱盖子，加入500μl缓冲液gd，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；s29、小心打开吸附柱盖子，加入600μl漂洗液pw，盖上管盖，静置2min，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；s210、重复步骤s29；s211、小心打开吸附柱盖子，加入500μl无水乙醇，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液；s212、将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心3min，使吸附膜完全变干，弃废液；s213、将吸附柱放入一个rnase-free离心管中，小心打开吸附柱的盖子，室温放置3min，使吸附膜完全变干，向吸附膜的中间部位悬空滴加20-150μl rnase-free ddh2o，盖上盖子，室温放置5min，12000rpm离心1min。3.根据权利要求1所述的一种ppv检测的crrna引物对、crisprcas12a系统及应用方法，其特征在于：所述步骤s4中，pcr体系为20μl，其中mix10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，dna模板1μl，灭菌水7μl；pcr扩增程序为：
①
94℃1.5min；
②
95℃20s；
③
44.5℃30s；
④
72℃90s；
⑤
2-4步反应30个循环；
⑥
72℃5min；
⑦
4℃储存。4.根据权利要求1所述的一种ppv检测的crrna引物对、crisprcas12a系统及应用方法，其特征在于：所述步骤s91中的反应体系为：10
×
buffer 3.1 5μl、上游引物(50μm)10μl、下游引物(50μm)10μl、rnase free ddh2o 25μl。5.根据权利要求1所述的一种ppv检测的crrna引物对、crisprcas12a系统及应用方法，其特征在于：所述步骤s92中的反应体系为：10
×
buffer 3.1 2μl、atp 2μl、gtp 2μl、utp 2μl、ctp 2μl、dna模板xμl、t7 rna polymerase mix 2μl、rnase free ddh2o up to 20μl。6.根据权利要求1所述的一种ppv检测的crrna引物对、crisprcas12a系统及应用方法，其特征在于：所述步骤s93的具体过程如下：s931、将转录产物用rnase free ddh2o补足至100μl，rna用量不要超过100μg；s932、加入300μl buffer rp，涡旋混匀10s，室温静置5min；s933、加入250μl无水乙醇，涡旋混匀15s，若回收小分子rna(＜200nt)，加入600μl无水乙醇；s934、将hipure rna柱子套在收集管中，把上述混合液转移至柱子中，10000
×
g离心
30-60s，当混合液＞700μl时，一次最多转移700μl至柱子中，多余的分次加入；s935、倒弃滤液，把柱子套回收集管中，加入已用无水乙醇稀释的buffer rw2500μl至柱子中，静置2min，10000
×
g离心30-60s；s936、倒弃滤液，把柱子套回收集管中，加入已用无水乙醇稀释的buffer rw2500μl至柱子中，10000
×
g离心30-60s；s937、倒弃滤液，把柱子套回收集管中，13000
×
g离心2min；s938、把柱子套在1.5μl离心管中，加入15-30μl rnase free water至柱子膜中央，放置1min，13000
×
g离心1min；s939、若需获得最高产量，重复上一步进行第二次洗脱；s9310、弃去柱子，将rna保存于-20℃。7.根据权利要求1所述的一种ppv检测的crrna引物对、crisprcas12a系统及应用方法，其特征在于：所述步骤s10中crispr/cas12a可视化荧光检测反应体系为：buffer 2.1 2μl、目的基因6μl、rna抑制剂1μl、探针0.6μl、crrna 1μl、ddh2o 2.5μl、cas12a蛋白0.5μl。

技术总结
本发明涉及病毒检测技术领域，且公开了一种PPV检测的crRNA引物对、CRISPRCas12a系统及应用方法，包括以下步骤：S1、组织样品的处理：将称取约1g的各组织样品，加入1mL PBS后放入研磨钵中研磨成匀浆，转移至无菌离心管中，在离心机中以12000rpm/min离心3min；S2、病毒核酸的提取：使用某生化科技有限公司的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒对病毒进行核酸提取；S3、引物设计：在GenBank中检索猪细小病毒全基因组(GenBank ID:NC_001718.1)，通过Meglign软件分析比对，确定猪细小病毒全基因组中高度保守片段为VP2基因，使用Primer Premier 5软件，设计VP2基因的全长引物，根据猪细小病毒全基因组中高度保守片段VP2基因，使用CRISPR-DT网站中Cpf1引物设计软件设计猪细小病毒VP2基因的crRNA引物，并委托某生物公司合成生产。并委托某生物公司合成生产。并委托某生物公司合成生产。


技术研发人员：宋祥军 涂健 李雅男 祁钊 邵颖 杨侃侃 刘红梅 姬凯元 朱良强 吴昊 王立 刘发全
受保护的技术使用者：安徽省动物疫病预防与控制中心 安徽省兽药饲料监察所
技术研发日：2022.01.04
技术公布日：2022/4/5