一种PPV检测的crRNA引物对、CRISPRCas12a系统及应用方法与流程

一种ppv检测的crrna引物对、crisprcas12a系统及应用方法
技术领域
1.本发明涉及病毒检测技术领域，具体为一种ppv检测的crrna引物对、crisprcas12a系统及应用方法。


背景技术：

2.猪细小病毒(porcine parvovirus，ppv)是猪细小病毒科的一种病毒，是一种可以自主复制的病毒，是造成母猪繁殖障碍性疾病的主要病原体之一。母猪感染该病毒后可导致流产、木乃伊胎及死胎等症状，引起猪母体繁殖失败，给养猪业带来一个严重问题。受感染母猪(特别是初产母猪)的感染特点为死产、胎儿畸形和木乃伊化，但感染也可导致新生仔猪死亡和仔猪疾病，包括腹泻和皮炎。各种猪都能感染猪细小病毒，如家猪、野猪、新生仔猪、育肥猪等。怀孕母猪感染猪细小病毒后，一般会表现出繁殖障碍性症状，然而，其他阶段的感染猪没有明显的临床症状，通常表现为隐形感染。
3.猪细小病毒是dna病毒，呈现为单股线状，其病毒粒子具有二十面体对称结构，基因组全长约为5kb，含有2个主要的开放阅读框(orf)，其中orf1编码3个非结构蛋白ns1、ns2、ns3；orf2编码2个结构蛋白vp1、vp2，vp2可进一步水解为vp3。组成核衣壳的主要结构蛋白是vp2，其分子大小为64kd，由579个氨基酸构成vp2具有良好的抗原性，在病毒的致病性方面起着重要重要，并且可以诱导动物机体产生保护性免疫反应。
4.猪细小病毒为细小病毒科细小病毒属成员，可造成繁殖母猪木乃伊胎、不孕不育及死胎等繁殖障碍性疾病，在世界各地的猪群中均有发现，是造成全球养猪业经济损失的重要传染病之一。经典的猪细小病毒病是由猪细小病毒1型感染引起的。上世纪80年代，在我国多个地方都出现了该病，预防、控制并从根本上根除该病是一项巨大的挑战。因此，急需一种能够快速诊断该病的方法。


技术实现要素：

5.(一)解决的技术问题
6.针对现有技术的不足，本发明提供了一种ppv检测的crrna引物对、crisprcas12a系统及应用方法，解决了上述背景技术中所提出的问题。
7.(二)技术方案
8.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种ppv检测的crrna引物对、crisprcas12a系统及应用方法，包括以下步骤：
9.s1、组织样品的处理：将称取约1g的各组织样品，加入1ml pbs后放入研磨钵中研磨成匀浆，转移至无菌离心管中，在离心机中以12000rpm/min离心3min；
10.s2、病毒核酸的提取：使用某生化科技有限公司的病毒基因组dna/rna提取试剂盒对病毒进行核酸提取；
11.s3、引物设计：在genbank中检索猪细小病毒全基因组，通过meglign软件分析比对，确定猪细小病毒全基因组中高度保守片段为vp2基因，使用primer premier 5软件，设
计vp2基因的全长引物，根据猪细小病毒全基因组中高度保守片段vp2基因，使用crispr-dt网站中cpf1引物设计软件设计猪细小病毒vp2基因的crrna引物，并委托某生物公司合成生产；
12.s4、pcr扩增：根据猪细小病毒vp2基因全长片段，使用primer premier5软件设计全长引物，进行pcr扩增，扩增片段大小为1658bp；
13.s5、pcr产物回收及纯化：根据sanprep柱式dna胶回收试剂盒说明书提取步骤操作，把扩增产物回收备用；
14.s6、标准质粒的构建：根据takara公司的pmd
tm
19t vector cloning kit使用说明书，构建pmd
tm
19t-vp2重组质粒；
15.s7、重组质粒鉴定：取部分培养菌液，委托某生物公司进行测序服务，并在ncbi网站的blast功能和meglign软件与vp2基因全长进行比对分析；
16.s8、质粒dna小量抽提：根据sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒使用说明书，提取构建的pmd
tm
19t-vp2重组质粒备用；
17.s9、crrna纯化
18.s91、双链dna的合成：将上述合成的crrna单链退火成双链，反应体系为50μl，95℃退火5min，自然冷却至室温；
19.s92、转录：将退火得到的双链进行转录，转录体系如下，转录所需dna模板的用量应在0.1-1μg，轻轻混匀各组分，短暂离心，pcr仪37℃孵育2h，程序结束后，加入1μl的dnaseⅰ，37℃水浴消化15min，去除模板dna；
20.s93、crrna纯化：将转录产物进行纯化；
21.s10、猪细小病毒荧光检测体系建立：对设计的四对猪细小病毒crrna引物进行筛选，对比结果；
22.s11、灵敏度试验：测量出重组质粒浓度，根据拷贝数浓度(copies/μl)＝[6.02
×
10
23
×
浓度(ng/μl)
×
10-9
]/[dna长度
×
660]公式，计算拷贝数浓度，以10倍浓度倍比稀释vp2基因重组质粒(pmd
tm
19t-vp2)，稀释浓度为3.75
×
100copies/μl、3.75
×
101copies/μl、3.75
×
102copies/μl、3.75
×
103copies/μl、3.75
×
104copies/μl、3.75
×
105copies/μl、3.75
×
106copies/μl、3.75
×
107copies/μl、3.75
×
108copies/μl、3.75
×
109copies/μl并使用灭菌水(ddh2o)作为实验的阴性对照，反应体系使用本实验建立的体系进行灵敏度验证并与将扩增产物在紫外灯下进行观察；
[0023]
s12、特异性试验：使用猪流行性腹泻病毒，猪瘟疫苗病毒，猪蓝耳疫苗病毒，猪伪狂犬病毒，猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的核酸为模板，阴性和阳性对照分别使用ddh2o和ppv的阳性样本，验证该方法的特异性并将扩增产物在紫外灯下进行观察。
[0024]
优选的，所述步骤s2具体过程如下：
[0025]
s21、用移液器将20μl proteinase k加入一个干净的1.5ml离心管；
[0026]
s22、向离心管中加入200μl血清；
[0027]
s23、加入200μl carrier rna工作液，盖上管盖，涡旋振荡15sec混匀；
[0028]
s24、在56℃孵育15min，简短离心以收集附着在管壁及管盖上的液体；
[0029]
s25、加入250μl无水乙醇，此时可能会出现絮状沉淀，盖上管盖并涡旋振荡15sec，彻底混匀，在室温下(15-25℃)放置5min；
[0030]
s26、简短离心以收集附着在管壁及管盖上的液体；
[0031]
s27、仔细将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至rnase-free吸附柱cr2，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
[0032]
s28、小心打开吸附柱盖子，加入500μl缓冲液gd，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
[0033]
s29、小心打开吸附柱盖子，加入600μl漂洗液pw，盖上管盖，静置2min，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
[0034]
s210、重复步骤s29；
[0035]
s211、小心打开吸附柱盖子，加入500μl无水乙醇，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液；
[0036]
s212、将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心3min，使吸附膜完全边干，弃废液；
[0037]
s213、将吸附柱放入一个rnase-free离心管中，小心打开吸附柱的盖子，室温放置3min，使吸附膜完全变干，向吸附膜的中间部位悬空滴加20-150μl rnase-free ddh2o，盖上盖子，室温放置5min，12000rpm离心1min。
[0038]
优选的，所述步骤s4中，pcr体系为20μl，其中mix 10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，dna模板1μl，灭菌水7μl；pcr扩增程序为：
①
94℃1.5min；
②
95℃20s；
③
44.5℃30s；
④
72℃90s；
⑤
2-4步反应30个循环；
⑥
72℃5min；
⑦
4℃∞。
[0039]
优选的，所述步骤s91中的反应体系为：10
×
buffer 3.15μl、上游引物(50μm)10μl、下游引物(50μm)10μl、rnase free ddh2o 25μl。
[0040]
优选的，所述步骤s92中的反应体系为：10
×
buffer 3.12μl、atp 2μl、gtp 2μl、utp 2μl、ctp 2μl、dna模板xμl、t7 rna polymerase mix2μl、rnase free ddh2o up to 20μl。
[0041]
优选的，所述步骤s93的具体过程如下：
[0042]
s931、将转录产物rnase free ddh2o补足至100μl，rna用量不要超过100μg；
[0043]
s932、加入300μl buffer rp，涡旋混匀10s，室温静置5min；
[0044]
s933、加入250μl无水乙醇，涡旋混匀15s，若回收小分子rna(＜200nt)，加入600μl无水乙醇；
[0045]
s934、将hipure rna柱子套在收集管中，把上述混合液转移至柱子中，10000
×
g离心30-60s，当混合液＞700μl时，一次最多转移700μl至柱子中，多余的分次加入；
[0046]
s935、倒弃滤液，把柱子套回收集管中，加入已用无水乙醇稀释的buffer rw2500μl至柱子中，静置2min，10000
×
g离心30-60s；
[0047]
s936、倒弃滤液，把柱子套回收集管中，加入已用无水乙醇稀释的buffer rw2500μl至柱子中，10000
×
g离心30-60s；
[0048]
s937、倒弃滤液，把柱子套回收集管中，13000
×
g离心2min；
[0049]
s938、把柱子套在1.5μl离心管中，加入15-30μl rnase free water至柱子膜中央，放置1min，13000
×
g离心1min；
[0050]
s939、若需获得最高产量，重复上一步进行第二次洗脱；
[0051]
s9310、弃去柱子，将rna保存于-20℃。
[0052]
优选的，所述步骤s10中crispr/cas12a可视化荧光检测反应体系为：buffer 2.12
μl、目的基因6μl、rna抑制剂1μl、探针0.6μl、crrna 1μl、ddh2o 2.5μl、cas12a蛋白0.5μl。
[0053]
(三)有益效果
[0054]
本发明提供了一种ppv检测的crrna引物对、crisprcas12a系统及应用方法，具备以下有益效果：
[0055]
本发明提高了分子生物学的检测效率，并且降低了检测门槛，同时大大节省了检测时间。
附图说明
[0056]
图1为本发明中pmd
tm
19t-vp2质粒基因pcr扩增结果图；
[0057]
图2为本发明中crispr-cas12a crrna引物筛选图；
[0058]
图3为本发明中crispr-cas12a可视化荧光检测灵敏度试验结果图；
[0059]
图4为本发明中crispr-cas12a可视化荧光检测特异性分析结果图。
具体实施方式
[0060]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0061]
本发明提供一种技术方案：一种ppv检测的crrna引物对、crisprcas12a系统及应用方法，包括以下步骤：
[0062]
s1、组织样品的处理：将称取约1g的各组织样品，加入1ml pbs后放入研磨钵中研磨成匀浆，转移至无菌离心管中，在离心机中以12000rpm/min离心3min；
[0063]
s2、病毒核酸的提取：使用某生化科技有限公司的病毒基因组dna/rna提取试剂盒(离心柱型)对病毒进行核酸提取；
[0064]
s21、用移液器将20μl proteinase k加入一个干净的1.5ml离心管；
[0065]
s22、向离心管中加入200μl血清；
[0066]
s23、加入200μl carrier rna工作液，盖上管盖，涡旋振荡15sec混匀；
[0067]
s24、在56℃孵育15min，简短离心以收集附着在管壁及管盖上的液体；
[0068]
s25、加入250μl无水乙醇，此时可能会出现絮状沉淀，盖上管盖并涡旋振荡15sec，彻底混匀，在室温下(15-25℃)放置5min；
[0069]
s26、简短离心以收集附着在管壁及管盖上的液体；
[0070]
s27、仔细将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至rnase-free吸附柱cr2，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
[0071]
s28、小心打开吸附柱盖子，加入500μl缓冲液gd，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
[0072]
s29、小心打开吸附柱盖子，加入600μl漂洗液pw，盖上管盖，静置2min，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
[0073]
s210、重复步骤s29；
[0074]
s211、小心打开吸附柱盖子，加入500μl无水乙醇，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃
废液；
[0075]
s212、将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心3min，使吸附膜完全边干，弃废液；
[0076]
s213、将吸附柱放入一个rnase-free离心管中，小心打开吸附柱的盖子，室温放置3min，使吸附膜完全变干，向吸附膜的中间部位悬空滴加20-150μl rnase-free ddh2o，盖上盖子，室温放置5min，12000rpm离心1min；
[0077]
s3、引物设计：在genbank中检索猪细小病毒全基因组(genbank id:nc_001718.1)，通过meglign软件分析比对，确定猪细小病毒全基因组中高度保守片段为vp2基因，使用primer premier 5软件，设计vp2基因的全长引物(表1)，根据猪细小病毒全基因组中高度保守片段vp2基因，使用crispr-dt网站中cpf1引物设计软件设计四对猪细小病毒vp2基因的crrna引物(表2)，并委托某生物公司合成生产；
[0078]
引物名称引物序列vp2-fgtctgcaacaggaaatgaatcvp2-rattctggaaacattcttatgc
[0079]
表1 ppv vp2引物
[0080][0081]
表2 ppv crrna引物
[0082][0083]
表3探针
[0084]
s4、pcr扩增：根据猪细小病毒vp2基因全长片段，使用primer premier5软件设计全长引物，进行pcr扩增，扩增片段大小为1658bp，pcr体系为20μl，其中mix 10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，dna模板1μl，灭菌水7μl，反应程序见表4；
[0085][0086]
表4目的片段的pcr扩增程序
[0087]
s5、pcr产物回收及纯化：根据sanprep柱式dna胶回收试剂盒说明书提取步骤操作，把扩增产物回收备用；
[0088]
s6、标准质粒的构建：根据takara公司的pmd
tm
19t vector cloning kit使用说明书，构建pmd
tm
19t-vp2重组质粒；
[0089]
s7、重组质粒鉴定：取部分培养菌液，委托某生物公司进行测序服务，并在ncbi网站的blast功能和meglign软件与vp2基因全长进行比对分析；
[0090]
s8、质粒dna小量抽提：根据sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒使用说明书，提取构建的pmd
tm
19t-vp2重组质粒备用；
[0091]
s9、crrna纯化
[0092]
s91、双链dna的合成：将上述合成的crrna单链退火成双链，反应体系为50μl，95℃退火5min，自然冷却至室温；
[0093]
组分体系含量10
×
buffer3.15μl上游引物(50μm)10μl下游引物(50μm)10μlrnasefreeddh2o25μl
[0094]
表5反应体系
[0095]
s92、转录：将退火得到的双链进行转录，转录体系如下，转录所需dna模板的用量应在0.1-1μg，轻轻混匀各组分，短暂离心，pcr仪37℃孵育2h，程序结束后，加入1μl的dnaseⅰ，37℃水浴消化15min，去除模板dna；
[0096]
组分体系含量10
×
buffer 3.12μlatp2μlgtp2μlutp2μlctp2μldna模板xμlt7 rna polymerase mix2μlrnase free ddh2oup to 20μl
[0097]
表6反应体系
[0098]
s93、crrna纯化：将转录产物进行纯化；
[0099]
s931、将转录产物rnase free ddh2o补足至100μl，rna用量不要超过100μg；
[0100]
s932、加入300μl buffer rp，涡旋混匀10s，室温静置5min；
[0101]
s933、加入250μl无水乙醇，涡旋混匀15s，若回收小分子rna(＜200nt)，加入600μl无水乙醇；
[0102]
s934、将hipure rna柱子套在收集管中，把上述混合液转移至柱子中，10000
×
g离心30-60s，当混合液＞700μl时，一次最多转移700μl至柱子中，多余的分次加入；
[0103]
s935、倒弃滤液，把柱子套回收集管中，加入已用无水乙醇稀释的buffer rw2500μl至柱子中，静置2min，10000
×
g离心30-60s；
[0104]
s936、倒弃滤液，把柱子套回收集管中，加入已用无水乙醇稀释的buffer rw2500μl至柱子中，10000
×
g离心30-60s；
[0105]
s937、倒弃滤液，把柱子套回收集管中，13000
×
g离心2min；
[0106]
s938、把柱子套在1.5μl离心管中，加入15-30μl rnase free water至柱子膜中央，放置1min，13000
×
g离心1min；
[0107]
s939、若需获得最高产量，重复上一步进行第二次洗脱；
[0108]
s9310、弃去柱子，将rna保存于-20℃；
[0109]
s10、猪细小病毒crispr/cas12a可视化荧光检测体系建立：对设计的四对猪细小病毒crrna引物进行筛选，对比结果，crispr/cas12a可视化荧光检测体系见表7；
[0110]
组分体系含量buffer2.12μl目的基因6μlrna抑制剂1μl探针0.6μlcrrna1μlddh2o2.5μlcas12a0.5μl
[0111]
表7反应体系
[0112]
s11、灵敏度试验：测量出质粒浓度，根据拷贝数浓度(copies/μl)＝[6.02
×
10
23
×
浓度(ng/μl)
×
10-9
]/[dna长度
×
660]公式，计算拷贝数浓度，以10倍浓度倍比稀释vp2基因
重组质粒(pmd
tm
19t-vp2)，稀释浓度为3.75
×
100copies/μl、3.75
×
101copies/μl、3.75
×
102copies/μl、3.75
×
103copies/μl、3.75
×
104copies/μl、3.75
×
105copies/μl、3.75
×
106copies/μl、3.75
×
107copies/μl、3.75
×
108copies/μl、3.75
×
109copies/μl并使用灭菌水(ddh2o)作为实验的阴性对照，反应体系使用本实验建立的体系进行灵敏度验证并将扩增产物在紫外灯下进行观察；
[0113]
s12、特异性试验：使用猪流行性腹泻病毒，猪瘟疫苗病毒，猪蓝耳疫苗病毒，猪伪狂犬病毒，猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的核酸为模板，阴性和阳性对照分别使用ddh2o和ppv的阳性样本，验证该方法的特异性并将扩增产物在紫外灯下进行观察。
[0114]
实验结果
[0115]
1、基因重组质粒构建
[0116]
1.1、pmd
tm
19t-vp2重组质粒构建
[0117]
猪细小病毒vp2基因组在pcr扩增之后，针对扩增的片段使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳验证，鉴定结果如图1所示。与预期相符的目的基因片段在蓝光切胶仪的辅助下切取目的条带，进行胶回收实验，并与pmd
tm
19t载体连接，转化到dh5α中。
[0118]
1.2、重组质粒鉴定测序
[0119]
与某生物公司合作并提供测序服务，测序结果在ncbi的blast网站、genbank基因库和meglign软件的辅助下进行序列比对，结果显示，测序结果与所需目的基因片段的对应率达到100％，表明目的基因重组质粒构建合格，无变异，可作为阳性对照使用。
[0120]
2、crrna引物筛选
[0121]
使用crispr-dt网站中cpf1在线引物设计软件设计猪细小病毒vp2基因的crrna引物4条以及一条荧光探针，对设计的四对引物进行筛选。经过筛选第1对引物最优，如图2所示。
[0122]
3、猪细小病毒的灵敏度实验
[0123]
使用sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒提取质粒后，以10倍的稀释倍数对提取的重组质粒进行稀释，用crispr/cas12a技术可视化荧光结果如图3所示。crispr技术荧光结果显示检测猪细小病毒的灵敏度达到了3.75copies/μl。
[0124]
4、猪细小病毒的特异性实验
[0125]
使用dna质粒小量提取试剂盒提取猪细小病毒vp2基因重组质粒pmd
tm
19t-vp2，用crispr/cas12a技术进行特异性实验。crispr/cas12a技术特异性荧光结果鉴定图如图4。结果显示，猪细小病毒vp2基因扩增成功，其他的病毒在蓝光下均未出现可视化荧光。
[0126]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0127]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。